肾综合征出血热血小板形态计量学分析
作者：鲁猛厚 谢玉桃 曾庆善
单位：附属湘雅医院传染科 长沙 410008 电镜室 长沙 410078
关键词：血小板；肾综合征；出血；体视学
湖南医科大学学报990209 提 要 对12例肾综合征出血热(HFRS)患者血小板的平均截面积(
)、α-颗粒的面数密度(NA)、体密度(VV)及开放小管(OCS)和丝足的均数(
)进行计量学分析。结果显示：HFRS患者血小板的与对照组比较差异无显著性；其血小板的丝足显著大于对照组(P<0.05)，OCS 明显小于对照组(P<0.05)，血小板内α-颗粒的面数密度显著小于对照组(P<0.05)，体密度却显著大于对照组(P<0.01)。提示临床出血的主要原因除HFRS血小板总数减少外，因血小板的质量低下而被异常激活，导致正常的凝血、止血功能障碍也是不可忽视的因素。
, http://www.100md.com
Platelet stereological study in patients with HFRS
Lu Menghou Xie Yutao
(Research Institute of Infectious Diseases, Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008)
Zeng Qingshan
(Laboratory of Electron Microscopy, Hunan Medical University, Changsha 410078)
To investigate the effects of stereological alteration of platelets on hemorrhage in hemorrhagic fever with renal syndrome(HFRS), platelet mean cross area(), area density of α-granules(Na), volume density(VV),the mean open tubule(OCS) and pseudopodia mean() were performed stereometric analysis in 12 patients with HFRS. The platelet was observed, and no significant difference was found compared with the control(P>0.05), while the number of pseudopodia was higher, and the open tubule number was lower than those of the control(p<0.01). The results suggest that in addition to the total platelet count decrement, the quality deterioration and functional activity abnormalities of platelets play an important role on the disordered hemostasis and coagulation in HFRS.
, 百拇医药
Key words platelet; renal syndrome; hemorrhagic fever; stereology
出血是肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)最常见、最严重的表现之一[1]，而血小板的损害又是引起出血的最主要因素。近年来临床上对HFRS患者血小板进行了超微结构观察及免疫组织化学检测，以期了解血小板在出血热发病中的机制。但有关HFRS血小板形态计量学分析，国内外尚未见报道。为探讨血小板形态学改变对HFRS出血的影响，本文对12例HFRS患者血小板平均截面积()、α-颗粒的面数密度(NA)、体密度(VV)及开放小管(OCS)和丝足的均数()进行计量学分析，为深入研究HFRS提供客观的亚细胞水平的形态学数据资料。
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1 材料与方法
1.1 标本采集 HFRS患者与健康人各12例，男∶女均为2∶1。患者年龄为25～48.5(平均32.8)岁，病程7.6d。所有病例均系我科住院且按全国诊断标准确诊的病人(入院后未经任何药物治疗)，与同等年龄、性别的健康陪人同时采血，并立即进行血小板分离检测。
1.2 电镜标本制作 取静脉血5ml，肝素抗凝，常规梯度离心，取其血小板层，用2.5%戊二醛(缓冲液为0.1mol.L-1二甲砷酸盐，pH7.2)作前固定，用3%铁氢化钾[K3Fe(CN)2]及2%锇酸(1∶1)混合液后固定，梯度丙酮脱水，E-pon 812包埋。每例样品制作包埋块3个，LKBⅢ型超薄切片机切片，枸橼酸铅——醋酸铀双染色，用铜网捞取每一个包埋块的2～3个切片，在H-600透射电镜低倍镜(×3000)下任选一张清晰的切片观察，并随机拍摄3～5个血小板的截面照片(×5000)，使每例拍摄照片总数在3张以上，血小板截面数>10个，用正方测试格做点分析法计量。将所获数据输入计算机进行统计学分析。
, 百拇医药
1.3 形态计量学分析 (1)血小板的平均截面积(mean profile area,)：计算公式为=aPx/Nx，其中N代表血小板的个数，Px代表被测血小板截面内的测试点数，a代表测试格常数。(2)α-颗粒(α-G)的体积密度(volume density,VV)：根据Deless原理，二维剖面图象的两截面的面积比等于它们在空间的体积比，从而可间接反映某结构在其参照系中所占体积的相对大小。VV的计算公式为
；n代表照片总数，Px代表血小板截面内测试点数，Pr代表参照系内测试点数。(3)α-G面数密度(numerical density area, NA)：计算公式为
代表血小板截面内α-G数，Px代表血小板截面内测试点数，a代表测试格常数。
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2 结果
对以上成组设计的两样本均数进行t检验，结果见附表。
附表 HFRS血小板(Pt)的，丝足，α-GVV，NA和OCS计量比较(
±s)
Apt
丝足
, http://www.100md.com
VVα-G
NA
OCS
HFRS组
3.137±0.250
3.001±0.291
0.445±0.037
0.760±0.070
6.121±1.503
对照组
, 百拇医药 3.056±0.163
2.451±0.317
0.312±0.027
0.089±0.010
8.636±1.371
P
<0.5
<0.05
<0.01
<0.05
<0.05
3 讨论
, http://www.100md.com
出血是HFRS三大主征之一，病人常因严重出血而致死。HFRS患者出血机制十分复杂，除有凝血因子异常，抗凝系统失控，纤溶系统亢进，血中类肝素物质增多，血管壁异常外，血小板减少和其形态异常也是导致出血的重要因素[1～3]。本组病例出血发生率为100%，出血部位有球结膜、皮肤粘膜、消化道、腹膜腔等。作者曾对HFRS患者的血小板进行电镜观察，发现其超微结构有明显异常[4]，但未对其进行形态计量学分析。本文对12例HFRS患者进行血小板形态计量学分析，结果表明患者血小板的与对照组比较差异无显著性，HFRS血小板的丝足显著大于对照组(P<0.05)，而OCS的又明显小于对照组(P<0.05)。丝足增大提示HFRS血小板大多数处于被激活状态，丝足数目增多，有利于其外表面膜与血浆接触的面积扩大；而OCS的缩小说明HFRS血小板内OCS的表面膜与血浆的接触机会减少，血小板内各种凝血因子 的释放受到影响[5～7]。本组HFRS患者血小板内α-G的面数密度显著 低于对照组(P<0.05)，而其体密度却大于对照组，且差异有高度显著性(P<0.01)。这可能由于病毒、免疫复合物以及其他促凝物质激活血小板，活化的血小板不断释放凝血酶，TXA2，5-HT，儿茶酚胺和ADP等致聚物，在其它因素共同作用下导致弥漫性血管内凝血(DIC)。DIC又可进一步激活血小板，以致α-G数普遍减少，继而使α-G更新率增加。大量新生的α-G是其VV增加的可能因素。
, 百拇医药
综上所述，笔者认为HFRS患者血小板总体数量减少，可能是临床表现出血的主要原因，而血小板质量的低下，也是不可忽视的重要因素。血小板质量低下主要表现为血小板的异常激活，一方面引起凝血因子大量释放，促进凝血并有可能导致DIC；另一方面持续性的血小板活化使血小板内凝血因子耗竭，从而影响正常的凝血、止血功能。血小板总体数量减少，其质量低下以及血小板凝血因子的释放障碍，均有可能成为HFRS患者出血的重要原因。
中国图书分类号 R331.143
参考文献
[1]Leduc JW, Smith GA, Childs JE, et al. Global survey of antibody to hantaan-related virus among peridomestic rodents. Bull WHO, 1986,64(1):139-144
, http://www.100md.com
[2]刘泽富，白雪帆主编.传染科医师进修必读.北京：人民军医出版社，1997：135-149
[3]胡大荣，王宇明主编.传染病学新进展.重庆：科学技术文献出版社，1995：180-190
[4]鲁猛厚，曾庆善，刘双虎，等.重症流行性出血热血小板及中性粒细胞的超微结构观察.湖南医科大学学报，1993，18(2)：157-159
[5]Tomiyama Y, Kunicki TJ, Zipf TF, et al. Response of human platelets to activating monoclonal antibodies: Importence of FcrR(CD32) plenotype and level of expression. Blood, 1992,80:2261-2264
[6]Anderson GP, Anderson CL. Signal transduction by the platelet Fc receptor. Blood, 1990,76:1165-1169
[7]钟慈声主编.细胞和组织的超微结构.北京：人民卫生出版社，1984：89-95
收稿日期：1998-08-25, 百拇医药
单位：附属湘雅医院传染科 长沙 410008 电镜室 长沙 410078
关键词：血小板；肾综合征；出血；体视学
湖南医科大学学报990209 提 要 对12例肾综合征出血热(HFRS)患者血小板的平均截面积(
)、α-颗粒的面数密度(NA)、体密度(VV)及开放小管(OCS)和丝足的均数()进行计量学分析。结果显示：HFRS患者血小板的与对照组比较差异无显著性；其血小板的丝足显著大于对照组(P<0.05)，OCS 明显小于对照组(P<0.05)，血小板内α-颗粒的面数密度显著小于对照组(P<0.05)，体密度却显著大于对照组(P<0.01)。提示临床出血的主要原因除HFRS血小板总数减少外，因血小板的质量低下而被异常激活，导致正常的凝血、止血功能障碍也是不可忽视的因素。, http://www.100md.com
Platelet stereological study in patients with HFRS
Lu Menghou Xie Yutao
(Research Institute of Infectious Diseases, Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008)
Zeng Qingshan
(Laboratory of Electron Microscopy, Hunan Medical University, Changsha 410078)
To investigate the effects of stereological alteration of platelets on hemorrhage in hemorrhagic fever with renal syndrome(HFRS), platelet mean cross area(
), area density of α-granules(Na), volume density(VV),the mean open tubule(OCS) and pseudopodia mean() were performed stereometric analysis in 12 patients with HFRS. The platelet was observed, and no significant difference was found compared with the control(P>0.05), while the number of pseudopodia was higher, and the open tubule number was lower than those of the control(p<0.01). The results suggest that in addition to the total platelet count decrement, the quality deterioration and functional activity abnormalities of platelets play an important role on the disordered hemostasis and coagulation in HFRS., 百拇医药
Key words platelet; renal syndrome; hemorrhagic fever; stereology
出血是肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)最常见、最严重的表现之一[1]，而血小板的损害又是引起出血的最主要因素。近年来临床上对HFRS患者血小板进行了超微结构观察及免疫组织化学检测，以期了解血小板在出血热发病中的机制。但有关HFRS血小板形态计量学分析，国内外尚未见报道。为探讨血小板形态学改变对HFRS出血的影响，本文对12例HFRS患者血小板平均截面积(
)、α-颗粒的面数密度(NA)、体密度(VV)及开放小管(OCS)和丝足的均数()进行计量学分析，为深入研究HFRS提供客观的亚细胞水平的形态学数据资料。, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 标本采集 HFRS患者与健康人各12例，男∶女均为2∶1。患者年龄为25～48.5(平均32.8)岁，病程7.6d。所有病例均系我科住院且按全国诊断标准确诊的病人(入院后未经任何药物治疗)，与同等年龄、性别的健康陪人同时采血，并立即进行血小板分离检测。
1.2 电镜标本制作 取静脉血5ml，肝素抗凝，常规梯度离心，取其血小板层，用2.5%戊二醛(缓冲液为0.1mol.L-1二甲砷酸盐，pH7.2)作前固定，用3%铁氢化钾[K3Fe(CN)2]及2%锇酸(1∶1)混合液后固定，梯度丙酮脱水，E-pon 812包埋。每例样品制作包埋块3个，LKBⅢ型超薄切片机切片，枸橼酸铅——醋酸铀双染色，用铜网捞取每一个包埋块的2～3个切片，在H-600透射电镜低倍镜(×3000)下任选一张清晰的切片观察，并随机拍摄3～5个血小板的截面照片(×5000)，使每例拍摄照片总数在3张以上，血小板截面数>10个，用正方测试格做点分析法计量。将所获数据输入计算机进行统计学分析。
, 百拇医药
1.3 形态计量学分析 (1)血小板的平均截面积(mean profile area,
)：计算公式为=aPx/Nx，其中N代表血小板的个数，Px代表被测血小板截面内的测试点数，a代表测试格常数。(2)α-颗粒(α-G)的体积密度(volume density,VV)：根据Deless原理，二维剖面图象的两截面的面积比等于它们在空间的体积比，从而可间接反映某结构在其参照系中所占体积的相对大小。VV的计算公式为；n代表照片总数，Px代表血小板截面内测试点数，Pr代表参照系内测试点数。(3)α-G面数密度(numerical density area, NA)：计算公式为代表血小板截面内α-G数，Px代表血小板截面内测试点数，a代表测试格常数。, http://www.100md.com
2 结果
对以上成组设计的两样本均数进行t检验，结果见附表。
附表 HFRS血小板(Pt)的
，丝足，α-GVV，NA和OCS计量比较(±s)Apt
丝足
, http://www.100md.com
VVα-G
NA
OCS
HFRS组
3.137±0.250
3.001±0.291
0.445±0.037
0.760±0.070
6.121±1.503
对照组
, 百拇医药 3.056±0.163
2.451±0.317
0.312±0.027
0.089±0.010
8.636±1.371
P
<0.5
<0.05
<0.01
<0.05
<0.05
3 讨论
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出血是HFRS三大主征之一，病人常因严重出血而致死。HFRS患者出血机制十分复杂，除有凝血因子异常，抗凝系统失控，纤溶系统亢进，血中类肝素物质增多，血管壁异常外，血小板减少和其形态异常也是导致出血的重要因素[1～3]。本组病例出血发生率为100%，出血部位有球结膜、皮肤粘膜、消化道、腹膜腔等。作者曾对HFRS患者的血小板进行电镜观察，发现其超微结构有明显异常[4]，但未对其进行形态计量学分析。本文对12例HFRS患者进行血小板形态计量学分析，结果表明患者血小板的
与对照组比较差异无显著性，HFRS血小板的丝足显著大于对照组(P<0.05)，而OCS的又明显小于对照组(P<0.05)。丝足增大提示HFRS血小板大多数处于被激活状态，丝足数目增多，有利于其外表面膜与血浆接触的面积扩大；而OCS的缩小说明HFRS血小板内OCS的表面膜与血浆的接触机会减少，血小板内各种凝血因子 的释放受到影响[5～7]。本组HFRS患者血小板内α-G的面数密度显著 低于对照组(P<0.05)，而其体密度却大于对照组，且差异有高度显著性(P<0.01)。这可能由于病毒、免疫复合物以及其他促凝物质激活血小板，活化的血小板不断释放凝血酶，TXA2，5-HT，儿茶酚胺和ADP等致聚物，在其它因素共同作用下导致弥漫性血管内凝血(DIC)。DIC又可进一步激活血小板，以致α-G数普遍减少，继而使α-G更新率增加。大量新生的α-G是其VV增加的可能因素。, 百拇医药
综上所述，笔者认为HFRS患者血小板总体数量减少，可能是临床表现出血的主要原因，而血小板质量的低下，也是不可忽视的重要因素。血小板质量低下主要表现为血小板的异常激活，一方面引起凝血因子大量释放，促进凝血并有可能导致DIC；另一方面持续性的血小板活化使血小板内凝血因子耗竭，从而影响正常的凝血、止血功能。血小板总体数量减少，其质量低下以及血小板凝血因子的释放障碍，均有可能成为HFRS患者出血的重要原因。
中国图书分类号 R331.143
参考文献
[1]Leduc JW, Smith GA, Childs JE, et al. Global survey of antibody to hantaan-related virus among peridomestic rodents. Bull WHO, 1986,64(1):139-144
, http://www.100md.com
[2]刘泽富，白雪帆主编.传染科医师进修必读.北京：人民军医出版社，1997：135-149
[3]胡大荣，王宇明主编.传染病学新进展.重庆：科学技术文献出版社，1995：180-190
[4]鲁猛厚，曾庆善，刘双虎，等.重症流行性出血热血小板及中性粒细胞的超微结构观察.湖南医科大学学报，1993，18(2)：157-159
[5]Tomiyama Y, Kunicki TJ, Zipf TF, et al. Response of human platelets to activating monoclonal antibodies: Importence of FcrR(CD32) plenotype and level of expression. Blood, 1992,80:2261-2264
[6]Anderson GP, Anderson CL. Signal transduction by the platelet Fc receptor. Blood, 1990,76:1165-1169
[7]钟慈声主编.细胞和组织的超微结构.北京：人民卫生出版社，1984：89-95
收稿日期：1998-08-25, 百拇医药