血清糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D的检测
作者：唐建华 李文凯
单位：生物化学教研室 长沙 410078
关键词：糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D*；血清学；方法学；人类
湖南医科大学学报990208 提 要 利用自制的、具完整糖基化磷脂酰肌醇(GPI)结构的胎盘型碱性磷酸酶(PLAP)做底物，通过聚乙二醇/葡聚糖分相系统定性，TX-114分相定量，初步建立了检测人血清中GPI特异性磷脂酶D(GPI-PLD)的方法，并对酶促反应的某些动力学性质进行了探讨。该方法重现性好(CV=3.6%)，灵敏度高(血清用量2μl即可)，且经济、实用，有一定的推广价值。用该方法检测100名正常人血清，表明其GPI-PLD的活性范围为30%～50%(用转化底物的百分率表示)。
Methodological study ont heassay of glycosylphosphatidylinos- itolspecific phospholipase D activity in serum
, 百拇医药
Tang Jianhua Li Wenkai
(Department of Biochemistry, Hunan Medical University, Changsha 410078)
A method for the assay of glycosylphosphatidylinositol-specific phospholipase D(GPI-PLD) activity in human serum was established by using glycosylphosphatidylinositol(GPI) anchored placental alkaline phosphatase(PLAP) as a substrate. Serum GPI-PLD activity was determined both qualitatively and quantitatively by PEG/dextran and triton-X-114 partitioning respectively, and some kinetic properties of its enzymatic reaction were also studied. This method revealed a satisfactory reproductivity(CV=3.6%) and a high sensitivty(2μl serum was sufficient). In addition, it is practical, economical, and feasible to be widely applied. The activities of GPI-PLD measured by this method in 100 normal subjects ranged from 30% to 50%(in terms of the percentage of converting GPI anchored PLAP substrate to the anchor-free product).
, 百拇医药
Key words glycosylphosphatidylinositol specific phospholipase D*; serology; methodology; human
近年发现有130余种蛋白质通过糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定于细胞膜表面。这些蛋白质包括胎盘型碱性磷酸酶(PLAP)、乙酰胆碱酯酶、生长因子及CD59等[1]。人血浆中存在丰富的GPI-特异性磷酸脂酶D(GPI-PLD)，它能在去垢剂存在下，特异性释放GPI锚定蛋白质中的磷脂酸(PA)，从而使锚定蛋白质由疏水形式转变为亲水形式[2]；它来源于肝脏、胰腺和骨髓[2～4]。尽管目前对其功能还不甚明了，但有报道，肝脏疾患时血清中该酶活性发生显著改变[5，6]。因此，检测血清中GPI-PLD活性将具有十分重要的临床意义。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 材料 正常产妇新鲜胎盘由本校湘雅医院妇产科提供。正常人血标本取自湘雅医院血库。葡聚糖T500为Pharmacia产品；TX-114，1，10-二氮杂菲，Tris.HCl购自Sigma;PEG6000，二乙醇胺(DEA)，磷酸对硝基苯(pNPP)等均为国产试剂；磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)由美国Stevens教授赠送。超速离心机(日立)、高速冷冻离心机、台式离心机、匀浆器、分光光度计及恒温水浴箱等均为国产品。
1.2 方法
1.2.1 一般流程
1.2.2 底物的制备 具完整GPI结构的PLAP按Malik等[7]方法制备，全部操作在4℃下进行。主要步骤如下：新鲜人胎盘用预冷缓冲液Ⅰ(0.25mol.L-1蔗糖，5mol.L-1MgCl2，24mol.L-1KCl,50mol.L-1Tris-HCl,pH8.4) 洗去血污，切碎，去除筋膜；匀浆两次后，4℃，8 000r.min-1离心10min；取上清液用40 000r.min-1，4℃离心1h制备胎盘细胞膜；碱性条件下(pH8.4)用预冷 正丁醇抽提出膜上具完整GPI的锚定PLAP；4℃，10 000r.min-1离心15min分相；取水相进行透析，超滤浓缩后，检测GPI结构的完整性和PLAP的活性(活性单位.L-1)。分装后贮存于-30℃。
, 百拇医药
1.2.3 血清GPI-PLD活性的确定 37℃下，将血清(或PI-PLD)、底物与含或不含GPI-PLD抑制剂(1，10-二氮杂菲)的缓冲液Ⅱ(50mmol.L-1Tris-HCl,10mmol.L-1NaCl,2.5mmol.L-1CaCl2，0.1% TX-100，pH7.4)置水浴保温60min，制成待检测分相样品；再根据检测目的选用不同的分相系统终止反应，并对分相后的PLAP进行检测。
1.2.4 聚乙二醇/葡聚糖分相 按Raymond等方法[8]操作。主要过程如下：制备5D/5P分相系统(即重量百分比均为5%的葡聚糖T500和PEG6000分相体系)1ml，加入待检测分相样品0.1ml；25℃，10 000r.min-1离心5min，分别取葡聚糖(D)相和PEG(P)相各50μl，检测PLAP活性。通过计算，求出每一相中PLAP的总活性，绘出PLAP的分相图谱，从而确立所检获的血清酶是GPI-PLD。
, 百拇医药
1.2.5 TX-114分相 按Low等方法[2]进行：待检测分相样品250μl，加入250μl含1.25% TX-114的缓冲液Ⅱ，混匀；冰浴15min，使之成为均一相。取20μl均相液检测PLAP活性，由此求出总PLAP活性(T)；其余混匀液转入37℃水浴15min进行分相，20℃，12 000r.min-1离心3min，取上相水溶液20μl检测PLAP活性，并求出亲水形式的PLAP的总活性(A)。再通过公式[(样品管的A/T-对照管的A/T)×100%]计算，可获得酶转化底物的百分率，即血清中GPI-PLD的活性。
1.2.6 PLAP活性的测定 按Raymond等[9]方法进 行。主要过程：将20μl含PLAP的样品加入1ml缓冲液Ⅲ(1.01mol.L-1二乙醇胺，0.505mmol.L-1MgCl2,pH10.5)，37℃预保温5min，加入100μl含5mmol.L-1磷酸对硝基苯的缓冲液Ⅲ，准确计时保温10min，用1mol.L-1NaOH终止显色，405nm波长比色。根据消光系数求出PLAP酶活性。
, 百拇医药
2 结果与讨论
2.1 自制底物的检定 图1结果表明，98%以上的PLAP活性分布在TX-114相中，水相几乎不能检得PLAP活性。说明制备出来的底物几乎全部是携GPI完整结构的PLAP；经纯品PI-PLC作用后，则90%以上PLAP活性转入水相，TX-114相中却不到10%。说明该酶绝大部分已被转变成亲水形式，所制备的底物完全可用以检测GPI特异性磷脂酶。实验还表明，制备后的底物，其PLAP活性为60 000IU.L-1，若分装，置-30℃贮存一年，不影响实验结果。
图1 TX-114分相检测制备的底物
A组：未经GPI特异性磷脂酶作用的底物 B组：底物经纯品PI-PLC作用后
, 百拇医药
Fig. 1 Detection of the prepared substrate with the triton X-114 partitioning Group A: Substrate not incubated with GPI specific phospholipase Group B: Substrate after the incubation with purified PI-PLC
2.2 聚乙二醇/葡聚糖分相 采用5D/5P分相系统，分别检测GPI结构完整的PLAP；经PI-PLC作用后的PLAP以及经血清作用后的PLAP见图2。由图2可见，疏水形式的具完整GPI结构的PLAP在两相中的分配为P相70%，D相30%；经PI-PLC作用后，PLAP在两相的分配均为50%；而经血清作用后，PLAP在P相的分配为30%，D相为70%。此结果与Raymond的报道一致[8]。说明血清中起作用的是GPI-PLD而不是GPI特异性磷脂酶C。由于两种特异性磷脂酶作用于磷脂酰肌醇的部位不同，故释放出亲水形式的PLAP中多糖部分的结构也不相同，从而使5D/5P分相的分配图谱也各具特征。
, 百拇医药
图2 5D/5P分相系统中同源型PLAP的分布
A组：未经GPI特异性磷脂酶作用的PLAP B组：经纯化的PI-PLC作用后的PLAP C组：经血清作用后的PLAP
Fig. 2 Distribution of PLAP isoforms in the 5D/5P phase system Group A: GPI-anchored PLAP not incubated with GPI specific phospholipase Group B: PLAP follwoing incubation with purified PI-PLC Group C: PLAP following incubation with serum
2.3 1，10-二氮杂菲对血清转换底物的抑制 不同浓度的1，10-二氮杂菲对血清转换底物的抑制作用见图3。由图3可知，随抑制剂浓度的增加，血清转换底物的活性下降；至抑制剂达1mmol.L-1时，血清转换底物的活性仅为8%。由于1，10-二氮杂菲是目前公认的GPI-PLD特异性抑制剂[9]，进一步说明本文检测到的血清酶是GPI-PLD而不是GPI特异性磷脂酶C。
, 百拇医药
图3 1，10-二氮杂菲对血清转化底物的抑制作用
Fig. 3 1,10-phenanthroline inhibition on the conversion of GPI anchored PLAP to the anchor-free isoform after incubation with serum
2.4 反应条件对检测血清GPI-PLD的影响
2.4.1 缓冲液Ⅱ的pH值和去垢剂浓度 用同一份血清，保持其它条件不变，仅改变缓冲液Ⅱ的pH值，以TX-114分相观察实验结果。三次平行实验的结果(平均值)如下：pH为6时，血清GPI-PLD转化底物的百分率为50%；pH值为7.4时该率为45%；pH值为8.4时则35%。由于pH值7.4与循环血浆pH值一致，故本文选择pH7.4的缓冲液Ⅱ。同理，若仅改变缓冲液Ⅱ中TX-100的浓度，发现当TX-100浓度大于0.2%或小于0.02%以后，所测得的血清GPI-PLD活性均下降。本文选定TX-100的浓度为0.1%。
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2.4.2 血清保温时间 用TX-114分相，保持其他条件不变，观测保温时间为10，20，30，40，50，60，75，90min时同一份血清转化底物的百分率。三次平行实验测得的平均值相应为：12%，16%，22%，24%，29%，34%，42%，45%；由此求得的每min血清GPI-PLD转化底物的百分率对应为：1.2，0.8，0.73，0.6，0.58，0.57，0.56，0.5。由此可知，随着保温时间延长，血清每min转化底物的百分率下降，但在30min至90min时，下降幅度很慢。为了保证检测PLAP时显色适宜，本文确定血清保温时间为60min。
2.4.3 底物用量 用TX-114分相，测得相同用量的同一份血清对1.2，0.6，0.3，0.15IU的GPI锚定PLAP底物的转化百分率(三个平行实验的平均值)相应为40%，42%，45%，40%。当底物用量超过0.6IU时，检测PLAP的显色太深，需缩短显色时间并影响结果；相反，当底物用量小于0.3IU时则显色太浅，需延长显色时间，也影响结果。故本文选定底物用量为0.3IU。
, 百拇医药
2.4.4 血清用量 取同一份血清，用TX-114分相，观察血清用量对底物转化百分率的影响(附表)。当血清用量超过1μl时，其线性关系基本上表现为：每增加一个数量级的血清用量则底物转化百分率亦增加10%。说明该方法的线性范围较宽且检测下限极低(灵敏度很高)。本文确定血清用量为2μl，因为该用量能保证实验误差较低。
附表 血清用量对底物转化百分率的影响(三次试验的平均值) 血清用量(μl)
0
0.25
0.5
1
2
4
10
, 百拇医药
20
50
100
200
底物转化的百分率(%)
2
10
20
30
35
37
39
41
, 百拇医药 45
49
51
2.5 实验精密度 用TX-114分相，在上述选定条件下，测定同一份血清标本(一式20份)。由同一人测得其中10份的结果(
±s)为46.7%±1.3%(CV=2.8%)；由另一人测得另外10份的结果(±s)为45.8%±1.0%(CV=2.2%)；两人20份血清标本测定的总变异系数为3.6%。表明该方法稳定可靠。另外，血清于0℃保存5天，所检获的酶活性仍无明显下降。
2.6 正常人群血清GPI-PLD活性的测定 用该方法测100名正常人(20～55岁)，结果表明其血清中GPI-PLD的活性范围(以转化底物的百分率表示)为30%～50%。此结果与Raymond的报道相一致(包括酶活性单位表示法)[5]。
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目前，用作检测GPI-PLD活性的底物有差异表面糖蛋白(VSG)，GPI锚定乙酰胆碱酯酶及GPI锚定PLAP等[10]。前两者由于制备复杂，检测方法较难推广。本文用自制的GPI 锚定PLAP做底物，在Raymond方法基础上加以修改；即以测定PLAP酶活性代替电泳法检测PLAP含量，成功地建立了检测人血清GPI-PLD 的方法。与Raymond的方法相比较，本文的方法血清用量仅2μl，底物用量不足 1IU，CV=3.6%；而Raymond的方法却分别为20μl，800IU和9%。另外，他们的方法需梯度凝胶电泳和光密度计等；本文方法仅需分光光度计，设备简单，灵敏度高，便于推广。
中国图书分类号 R446.112 参考文献
[1]Nosjean O, Clivier N. Mammalian GPI protein: sorting, membrane residence and functions. Biochim Biophys Acta, 1997,1331:153-186
, 百拇医药
[2]Low MG, Huang KS. Factors affecting the ability of GPI-PLD to degrade the membrane anchors of cell surface proteins. Biochem J, 1991,279:483-487
[3]Mets CN, Zhang YY, Guo Y, et al. Production of GPI-PLD by the islets of langerhans. J Biol Chem, 1991,266:17733-17736
[4]Xie MS, Low MG. Expression and secretion of GPI-PLD by myeloid cell lines. Biochem J, 1994,297:547-554
[5]Raymond FD, Fortunato G, Moss DW, et al. GPI-PLD activity in health and disease. Clin Sci, 1994,86:447-451
, 百拇医药
[6]Moss DW. Physicochemical and pathophysiological factors in the release of membrane-bound alkaline phosphatase from cells. Clin Chim Acta, 1997,257:133-140
[7]Malik AS, Low MG. Conversion of human PLAP from a high Mr form to a low Mr form during butanol extraction. Biochem J, 1986,240:519-527
[8]Raymond FD, Moss DW, Fisher D. Phase partitioning detects differences between phospholipase-released forms of ALP: a GPI-linked protein. Biochim Biophys Acta, 1993,1156:117-122
[9]Raymond FD, Fortunato G, Moss DW. A method for the assay of GPI-PLD activity in serum. Clin Chim Acta, 1993,215:139-152
[10]余明琨，龚隽.糖基磷脂酰肌醇专一的磷脂酶D.生命的化学，1996，4：30-32
收稿日期：1998-05-20, http://www.100md.com
单位：生物化学教研室 长沙 410078
关键词：糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D*；血清学；方法学；人类
湖南医科大学学报990208 提 要 利用自制的、具完整糖基化磷脂酰肌醇(GPI)结构的胎盘型碱性磷酸酶(PLAP)做底物，通过聚乙二醇/葡聚糖分相系统定性，TX-114分相定量，初步建立了检测人血清中GPI特异性磷脂酶D(GPI-PLD)的方法，并对酶促反应的某些动力学性质进行了探讨。该方法重现性好(CV=3.6%)，灵敏度高(血清用量2μl即可)，且经济、实用，有一定的推广价值。用该方法检测100名正常人血清，表明其GPI-PLD的活性范围为30%～50%(用转化底物的百分率表示)。
Methodological study ont heassay of glycosylphosphatidylinos- itolspecific phospholipase D activity in serum
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Tang Jianhua Li Wenkai
(Department of Biochemistry, Hunan Medical University, Changsha 410078)
A method for the assay of glycosylphosphatidylinositol-specific phospholipase D(GPI-PLD) activity in human serum was established by using glycosylphosphatidylinositol(GPI) anchored placental alkaline phosphatase(PLAP) as a substrate. Serum GPI-PLD activity was determined both qualitatively and quantitatively by PEG/dextran and triton-X-114 partitioning respectively, and some kinetic properties of its enzymatic reaction were also studied. This method revealed a satisfactory reproductivity(CV=3.6%) and a high sensitivty(2μl serum was sufficient). In addition, it is practical, economical, and feasible to be widely applied. The activities of GPI-PLD measured by this method in 100 normal subjects ranged from 30% to 50%(in terms of the percentage of converting GPI anchored PLAP substrate to the anchor-free product).
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Key words glycosylphosphatidylinositol specific phospholipase D*; serology; methodology; human
近年发现有130余种蛋白质通过糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定于细胞膜表面。这些蛋白质包括胎盘型碱性磷酸酶(PLAP)、乙酰胆碱酯酶、生长因子及CD59等[1]。人血浆中存在丰富的GPI-特异性磷酸脂酶D(GPI-PLD)，它能在去垢剂存在下，特异性释放GPI锚定蛋白质中的磷脂酸(PA)，从而使锚定蛋白质由疏水形式转变为亲水形式[2]；它来源于肝脏、胰腺和骨髓[2～4]。尽管目前对其功能还不甚明了，但有报道，肝脏疾患时血清中该酶活性发生显著改变[5，6]。因此，检测血清中GPI-PLD活性将具有十分重要的临床意义。
1 材料与方法
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1.1 材料 正常产妇新鲜胎盘由本校湘雅医院妇产科提供。正常人血标本取自湘雅医院血库。葡聚糖T500为Pharmacia产品；TX-114，1，10-二氮杂菲，Tris.HCl购自Sigma;PEG6000，二乙醇胺(DEA)，磷酸对硝基苯(pNPP)等均为国产试剂；磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)由美国Stevens教授赠送。超速离心机(日立)、高速冷冻离心机、台式离心机、匀浆器、分光光度计及恒温水浴箱等均为国产品。
1.2 方法
1.2.1 一般流程
1.2.2 底物的制备 具完整GPI结构的PLAP按Malik等[7]方法制备，全部操作在4℃下进行。主要步骤如下：新鲜人胎盘用预冷缓冲液Ⅰ(0.25mol.L-1蔗糖，5mol.L-1MgCl2，24mol.L-1KCl,50mol.L-1Tris-HCl,pH8.4) 洗去血污，切碎，去除筋膜；匀浆两次后，4℃，8 000r.min-1离心10min；取上清液用40 000r.min-1，4℃离心1h制备胎盘细胞膜；碱性条件下(pH8.4)用预冷 正丁醇抽提出膜上具完整GPI的锚定PLAP；4℃，10 000r.min-1离心15min分相；取水相进行透析，超滤浓缩后，检测GPI结构的完整性和PLAP的活性(活性单位.L-1)。分装后贮存于-30℃。
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1.2.3 血清GPI-PLD活性的确定 37℃下，将血清(或PI-PLD)、底物与含或不含GPI-PLD抑制剂(1，10-二氮杂菲)的缓冲液Ⅱ(50mmol.L-1Tris-HCl,10mmol.L-1NaCl,2.5mmol.L-1CaCl2，0.1% TX-100，pH7.4)置水浴保温60min，制成待检测分相样品；再根据检测目的选用不同的分相系统终止反应，并对分相后的PLAP进行检测。
1.2.4 聚乙二醇/葡聚糖分相 按Raymond等方法[8]操作。主要过程如下：制备5D/5P分相系统(即重量百分比均为5%的葡聚糖T500和PEG6000分相体系)1ml，加入待检测分相样品0.1ml；25℃，10 000r.min-1离心5min，分别取葡聚糖(D)相和PEG(P)相各50μl，检测PLAP活性。通过计算，求出每一相中PLAP的总活性，绘出PLAP的分相图谱，从而确立所检获的血清酶是GPI-PLD。
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1.2.5 TX-114分相 按Low等方法[2]进行：待检测分相样品250μl，加入250μl含1.25% TX-114的缓冲液Ⅱ，混匀；冰浴15min，使之成为均一相。取20μl均相液检测PLAP活性，由此求出总PLAP活性(T)；其余混匀液转入37℃水浴15min进行分相，20℃，12 000r.min-1离心3min，取上相水溶液20μl检测PLAP活性，并求出亲水形式的PLAP的总活性(A)。再通过公式[(样品管的A/T-对照管的A/T)×100%]计算，可获得酶转化底物的百分率，即血清中GPI-PLD的活性。
1.2.6 PLAP活性的测定 按Raymond等[9]方法进 行。主要过程：将20μl含PLAP的样品加入1ml缓冲液Ⅲ(1.01mol.L-1二乙醇胺，0.505mmol.L-1MgCl2,pH10.5)，37℃预保温5min，加入100μl含5mmol.L-1磷酸对硝基苯的缓冲液Ⅲ，准确计时保温10min，用1mol.L-1NaOH终止显色，405nm波长比色。根据消光系数求出PLAP酶活性。
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2 结果与讨论
2.1 自制底物的检定 图1结果表明，98%以上的PLAP活性分布在TX-114相中，水相几乎不能检得PLAP活性。说明制备出来的底物几乎全部是携GPI完整结构的PLAP；经纯品PI-PLC作用后，则90%以上PLAP活性转入水相，TX-114相中却不到10%。说明该酶绝大部分已被转变成亲水形式，所制备的底物完全可用以检测GPI特异性磷脂酶。实验还表明，制备后的底物，其PLAP活性为60 000IU.L-1，若分装，置-30℃贮存一年，不影响实验结果。
图1 TX-114分相检测制备的底物
A组：未经GPI特异性磷脂酶作用的底物 B组：底物经纯品PI-PLC作用后
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Fig. 1 Detection of the prepared substrate with the triton X-114 partitioning Group A: Substrate not incubated with GPI specific phospholipase Group B: Substrate after the incubation with purified PI-PLC
2.2 聚乙二醇/葡聚糖分相 采用5D/5P分相系统，分别检测GPI结构完整的PLAP；经PI-PLC作用后的PLAP以及经血清作用后的PLAP见图2。由图2可见，疏水形式的具完整GPI结构的PLAP在两相中的分配为P相70%，D相30%；经PI-PLC作用后，PLAP在两相的分配均为50%；而经血清作用后，PLAP在P相的分配为30%，D相为70%。此结果与Raymond的报道一致[8]。说明血清中起作用的是GPI-PLD而不是GPI特异性磷脂酶C。由于两种特异性磷脂酶作用于磷脂酰肌醇的部位不同，故释放出亲水形式的PLAP中多糖部分的结构也不相同，从而使5D/5P分相的分配图谱也各具特征。
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图2 5D/5P分相系统中同源型PLAP的分布
A组：未经GPI特异性磷脂酶作用的PLAP B组：经纯化的PI-PLC作用后的PLAP C组：经血清作用后的PLAP
Fig. 2 Distribution of PLAP isoforms in the 5D/5P phase system Group A: GPI-anchored PLAP not incubated with GPI specific phospholipase Group B: PLAP follwoing incubation with purified PI-PLC Group C: PLAP following incubation with serum
2.3 1，10-二氮杂菲对血清转换底物的抑制 不同浓度的1，10-二氮杂菲对血清转换底物的抑制作用见图3。由图3可知，随抑制剂浓度的增加，血清转换底物的活性下降；至抑制剂达1mmol.L-1时，血清转换底物的活性仅为8%。由于1，10-二氮杂菲是目前公认的GPI-PLD特异性抑制剂[9]，进一步说明本文检测到的血清酶是GPI-PLD而不是GPI特异性磷脂酶C。
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图3 1，10-二氮杂菲对血清转化底物的抑制作用
Fig. 3 1,10-phenanthroline inhibition on the conversion of GPI anchored PLAP to the anchor-free isoform after incubation with serum
2.4 反应条件对检测血清GPI-PLD的影响
2.4.1 缓冲液Ⅱ的pH值和去垢剂浓度 用同一份血清，保持其它条件不变，仅改变缓冲液Ⅱ的pH值，以TX-114分相观察实验结果。三次平行实验的结果(平均值)如下：pH为6时，血清GPI-PLD转化底物的百分率为50%；pH值为7.4时该率为45%；pH值为8.4时则35%。由于pH值7.4与循环血浆pH值一致，故本文选择pH7.4的缓冲液Ⅱ。同理，若仅改变缓冲液Ⅱ中TX-100的浓度，发现当TX-100浓度大于0.2%或小于0.02%以后，所测得的血清GPI-PLD活性均下降。本文选定TX-100的浓度为0.1%。
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2.4.2 血清保温时间 用TX-114分相，保持其他条件不变，观测保温时间为10，20，30，40，50，60，75，90min时同一份血清转化底物的百分率。三次平行实验测得的平均值相应为：12%，16%，22%，24%，29%，34%，42%，45%；由此求得的每min血清GPI-PLD转化底物的百分率对应为：1.2，0.8，0.73，0.6，0.58，0.57，0.56，0.5。由此可知，随着保温时间延长，血清每min转化底物的百分率下降，但在30min至90min时，下降幅度很慢。为了保证检测PLAP时显色适宜，本文确定血清保温时间为60min。
2.4.3 底物用量 用TX-114分相，测得相同用量的同一份血清对1.2，0.6，0.3，0.15IU的GPI锚定PLAP底物的转化百分率(三个平行实验的平均值)相应为40%，42%，45%，40%。当底物用量超过0.6IU时，检测PLAP的显色太深，需缩短显色时间并影响结果；相反，当底物用量小于0.3IU时则显色太浅，需延长显色时间，也影响结果。故本文选定底物用量为0.3IU。
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2.4.4 血清用量 取同一份血清，用TX-114分相，观察血清用量对底物转化百分率的影响(附表)。当血清用量超过1μl时，其线性关系基本上表现为：每增加一个数量级的血清用量则底物转化百分率亦增加10%。说明该方法的线性范围较宽且检测下限极低(灵敏度很高)。本文确定血清用量为2μl，因为该用量能保证实验误差较低。
附表 血清用量对底物转化百分率的影响(三次试验的平均值) 血清用量(μl)
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底物转化的百分率(%)
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2.5 实验精密度 用TX-114分相，在上述选定条件下，测定同一份血清标本(一式20份)。由同一人测得其中10份的结果(
±s)为46.7%±1.3%(CV=2.8%)；由另一人测得另外10份的结果(±s)为45.8%±1.0%(CV=2.2%)；两人20份血清标本测定的总变异系数为3.6%。表明该方法稳定可靠。另外，血清于0℃保存5天，所检获的酶活性仍无明显下降。2.6 正常人群血清GPI-PLD活性的测定 用该方法测100名正常人(20～55岁)，结果表明其血清中GPI-PLD的活性范围(以转化底物的百分率表示)为30%～50%。此结果与Raymond的报道相一致(包括酶活性单位表示法)[5]。
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目前，用作检测GPI-PLD活性的底物有差异表面糖蛋白(VSG)，GPI锚定乙酰胆碱酯酶及GPI锚定PLAP等[10]。前两者由于制备复杂，检测方法较难推广。本文用自制的GPI 锚定PLAP做底物，在Raymond方法基础上加以修改；即以测定PLAP酶活性代替电泳法检测PLAP含量，成功地建立了检测人血清GPI-PLD 的方法。与Raymond的方法相比较，本文的方法血清用量仅2μl，底物用量不足 1IU，CV=3.6%；而Raymond的方法却分别为20μl，800IU和9%。另外，他们的方法需梯度凝胶电泳和光密度计等；本文方法仅需分光光度计，设备简单，灵敏度高，便于推广。
中国图书分类号 R446.112 参考文献
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收稿日期：1998-05-20, http://www.100md.com