一氧化氮对HSV-1在HeLa细胞和Vero-E6细胞中增殖的影响
作者：刘水平 舒明星 肖扬名 毛学政 戴 橄
单位：微生物学教研室 长沙 410078
关键词：一氧化氮；抗病毒作用*；HSV-1；HeLa细胞；Vero-E6细胞
湖南医科大学学报990205 提 要 以硝普钠作一氧化氮供体，观察不同剂量一氧化氮存在条件下HSV-1在HeLa细胞和Vero-E6细胞中增殖情况。结果表明：一氧化氮对HSV-1在Vero-E6细胞中增殖有明显抑制作用，而对HSV-1在HeLa细胞中增殖无明显影响。提示一氧化氮的抗病毒作用存在着细胞敏感性差异。
Effect of nitric oxide on HSV-1 infection of
HeLa cells and Vero-E6 cells
, http://www.100md.com
Liu Shuiping, Shu Mingxing, Xiao Yangming, et al
(Department of Microbiology, Hunan Medical University, Changsha 410078)
The effects of nitric oxide(NO) on HSV-1 infection of HeLa cell line and Vero-E6 cell line were investigated in this study. The titers of HSV-1 in supernatants from infected culture of Vero-E6 cells were decreased by a NO donor, sodium nitroprusside(SNP), in a dose-dependant manner, while the control compound potassium ferricyanide(KFC) had no effect. However, SNP had no effect on that of HeLa cells. The results reaffirm the antiviral effect of NO and suggest that the susceptibility of different cell lines to the effect of NO might be varied.
, 百拇医药
Key words nitric oxide; antiviral effect*; HSV-1; HeLa cells; Vero-E6 cells
有关一氧化氮(NO)的抗病毒作用，近年来的报道很多，认为NO对多种病毒的增殖有抑制作用[1，3，5，7～9]。也有资料表明，不同病毒对NO作用的敏感性存在着差异[2]。Croen首先证实NO在鼠源性RAW264.7细胞中有抗HSV-1作用[3]，但人源性U937细胞经诱导产生的NO则无抗HSV-1作用[4]。有关NO对HSV-1在HeLa细胞和Vero-E6细胞中增殖的影响尚未见报道。本文通过观察NO在不同来源的细胞中对HSV-1增殖的影响，试图为NO抗病毒作用机制研究提供新的依据。
1 材料与方法
1.1 材料 (1)病毒和细胞株：HSV-1(单纯疱疹病毒Ⅰ型)毒株来自安徽医科大学。HeLa细胞和Vero-E6细胞均为本室长期液氮保存。细胞用含10% FCS的DMEM培养基连续传代3次保持对数生长期供实验用。维持液为含2% FCS的DMEM培养基。(2)试剂：硝普钠(SNP)为北京制药工业研究所产品(注射用药)。对照试剂为铁氰化钾(KFC)，系国产分析纯。上述用药临用前用DMEM维持液配制。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 病毒感染 将24孔细胞培养板(costar)传代培养2d约90%长成单层的HeLa和Vero-E6细胞中每孔接种0.1ml 100TC1D50量的HSV-1液，37℃吸附1h后用Hanks'液轻洗3次，然后分别加入含0，50，250和500μmol.L-1 SNP或500μmol*L-1 KFC的DMEM维持液。置37℃ 5% CO2孵育箱中孵育48h，收集培养上清液置-70℃冻存，供病毒滴度和NO测定。实验中同时平行设置各浓度SNP条件下的正常细胞培养，以观察SNP对细胞活性的影响。
1.2.2 NO测定 按文献[5]方法测定NO-2浓度。
1.2.3 细胞活性检测 按文献[5]用MTT法稍加改进。在24孔细胞培养板的细胞中，每孔加入50μl 5mg.ml-1的MTT(Fluka)溶液，37℃孵育4h，弃MTT液，加1ml二甲亚砜(DMSO)溶解生成的结晶。用分光光度计测OD570值。
, 百拇医药
1.2.4 病毒滴度测定 将待测液作10倍系列稀释，常规方法感染HeLa细胞单层，37℃培养5d，观察细胞病变情况，计算TC1D50量。
1.3 统计学处理 实验结果以均数±标准差(
±s)表示，组间比较用t检验。
2 结果
2.1 SNP对细胞增殖的影响 结果见表1。实验所用浓度SNP对HeLa细胞和Vero-E6细胞的增殖均无显著影响(P>0.05)。
表1 SNP对HeLa细胞和Vero-E6细胞活性的影响(OD570值，±s) SNP(μmol.L-1)
, 百拇医药
n
HeLa cells
Vero-E6 cells
0
4
0.81±0.08
0.84±0.03
50
4
0.76±0.03
0.85±0.02
250
, 百拇医药 4
0.75±0.02
0.84±0.03
500
4
0.76±0.04
0.83±0.04
2.2 SNP与细胞培养液中NO的量效关系 结果见表2。可见细胞培养上清液中NO量随SNP浓度增加而增加，同量的SNP在HeLa细胞和Vero-E6细胞培养液中释放的NO量无显著差异。而对照物KFC则无释放NO作用。
2.3 NO对HSV-1增殖的影响 随着SNP浓度增高，Vero-E6细胞上清液中HSV-1滴度减少，当SNP浓度为250μmol.L-1时，HSV-1的增殖受到显著抑制。而实验所用浓度SNP对HSV-1在HeLa细胞中的增殖无显著影响(P>0.05)(附图)。实验中当用500μmol.L-1 KFC作SNP对照时，HSV-1滴度(1ogTCID50=3.5±0.21)与正常对 照组(SNP=0)的HSV-1滴度(logTCID50=3.6±0.25)比较差异无显著性(P>0.05)表2 HSV-1感染48h后不同SNP浓度条件下细胞上清液中NO-2浓度(μmol.L-1,±s) SNP(μmol.L-1)
, 百拇医药
n
HeLa cells
Vero-E6 cells
0
4
6.8±0.7
8.2±0.7
50
4
20.6±1.7
23±1.3
250
4
, 百拇医药
40.2±2.4
38.5±1.7
500
4
56.4±1.8
61.2±1.7
KFC对照
4
6.3±0.3
8.9±0.7
(500μmol.L-1)
, http://www.100md.com
附图 不同浓度SNP的HeLa细胞和Vero-E6细胞上清液中的HSV-1滴度(n=4) ①与②比较P<0.01
Fig. Viral titers in supernatants with different concentrations of SNP of HeLa cells and Vero-E6 cells. ①P<0.01 vs ②
3 讨论
NO是机体细胞内一氧化氮合成酶(NOS)以L-精氨酸为底物所催化合成的高活性小分子化合物。研究发现，体内多种细胞含有NOS，发挥多种生理功能[6]。目前已有报道显示，NO对多种病毒的增殖有抑制作用，但确切机制尚不清楚。Karupiah等[7]认为NO抗HSV-1作用与NO作用于病毒的核糖核苷酸还原酶有关，因缺乏此酶的HSV变异株在NO作用病毒仍能复制。这种NO对病毒的直接作用可以解释不同的病毒对NO作用的敏感性不同[2，8]。另一方面，NO与超氧阴离子结合成过氧化亚硝酸根阴离子(ONOO-)，可改变宿主细胞膜脂、受体及其它相关蛋白等而改变细胞内信号传导通道，通过改变代谢酶而抑制病毒增殖。Subauste[9]和Sanders[10]研究了鼻病毒对人呼吸道上皮细胞的感染，发现细胞对病毒的敏感性、细胞表面粘附分子的表达、细胞因子水平以及NO抗病毒作用等几方面因素相关联。细胞NOS表达与细胞因子(IFN-γ，TNF-α等)密切相关[6]。这提示NO通过间接方式发挥抗病毒作用。
, http://www.100md.com
本实验结果，SNP对HSV-1在HeLa细胞中增殖无显著影响，对照物KFC无抗HSV-1作用，说明SNP对HSV-1无直接作用，SNP对HSV-1在Vero-E6细胞中增殖的抑制作用乃NO所致。这与Croen[3]和Komatsu[1]的报道相一致。由于SNP在HeLa细胞和Vero-E6细胞上清液释放的NO量无显著差别(表2)，结果显示，HeLa细胞和Vero-E6细胞对NO作用的敏感性有差异。这可能是由于HeLa细胞是人宫颈癌上皮细胞株，而Vero-E6细胞为非洲绿猴肾上皮细胞株，二者来源不同，含有不同的酶系统、受体及其他相关因素，从而导致NO间接抗病毒作用的效果差异。这种差异的精确解释及NO生理作用的阐明有赖于NO抗病毒机制的深入研究。
中国图书分类号 Q28
参考文献
[1]Komatsu T, Bi ZB, Reiss CS. Interferon-γ induced type 1 nitric oxide synthase activity inhibits viral replication in neurons. J Neuroimmunol, 1996,68:101-108
, 百拇医药
[2]Krell TR, Elbl MM. Nitric oxide and viral infection: no antiviral activity against a fiavivirus in vitro and evidence for contribution to pathogenesis in experimental infection in vivo. Virology, 1996,219:304-306
[3]Croen KD. Evidence for an antiviral effect of nitric oxide. J Clin Invest, 1993,91:2446-2452
[4]Lopez-Guerrero JA, Alonso MA. Nitric oxide production induced by herpes simplex virus type 1 does not alter the course of the infection in human monocytic cells. J Gen Virol, 1997,78:1997-1980
, 百拇医药
[5]Bi ZB, Reiss CS. Inhibition of vesicular stomatitis virus infection by nitric oxide. J Virol, 1995,69:2208-2213
[6]Nathan C, Xie QW. Nitric oxide synthases: role, tolls, and controls. Cell, 1994,78:915-918
[7]Karupiah G, Harris N. Inhibition of viral replication by nitric oxide and its reversal by ferrous sulfate and tricarboxylic acid cycle metabolites. J Exp Med, 1995,181(6):2171-2179
[8]Lin YL, Huang YL, Ma SH, et al. Inhibition of Japanese encephalitis virus infection by nitric oxide: antiviral effect of NO on RNA virus replication. J Virol, 1997,71:5227-5235
, 百拇医药
[9]Subauste MC, Jacoby DB, Kichards SM, et al. Infection of a human respiratory epiehelial cell line with rhinovirus. J Clin Invest, 1995,96:549-557
[10]Sanders SP, Siekierski ES, Porter JD, et al. Nitric oxide inhibits rhinovirus-induced cytokine production and viral replication in a human respiratory epithelial cell line. J Virol, 1998,72:934-942
收稿日期：1999-02-02, http://www.100md.com
单位：微生物学教研室 长沙 410078
关键词：一氧化氮；抗病毒作用*；HSV-1；HeLa细胞；Vero-E6细胞
湖南医科大学学报990205 提 要 以硝普钠作一氧化氮供体，观察不同剂量一氧化氮存在条件下HSV-1在HeLa细胞和Vero-E6细胞中增殖情况。结果表明：一氧化氮对HSV-1在Vero-E6细胞中增殖有明显抑制作用，而对HSV-1在HeLa细胞中增殖无明显影响。提示一氧化氮的抗病毒作用存在着细胞敏感性差异。
Effect of nitric oxide on HSV-1 infection of
HeLa cells and Vero-E6 cells
, http://www.100md.com
Liu Shuiping, Shu Mingxing, Xiao Yangming, et al
(Department of Microbiology, Hunan Medical University, Changsha 410078)
The effects of nitric oxide(NO) on HSV-1 infection of HeLa cell line and Vero-E6 cell line were investigated in this study. The titers of HSV-1 in supernatants from infected culture of Vero-E6 cells were decreased by a NO donor, sodium nitroprusside(SNP), in a dose-dependant manner, while the control compound potassium ferricyanide(KFC) had no effect. However, SNP had no effect on that of HeLa cells. The results reaffirm the antiviral effect of NO and suggest that the susceptibility of different cell lines to the effect of NO might be varied.
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Key words nitric oxide; antiviral effect*; HSV-1; HeLa cells; Vero-E6 cells
有关一氧化氮(NO)的抗病毒作用，近年来的报道很多，认为NO对多种病毒的增殖有抑制作用[1，3，5，7～9]。也有资料表明，不同病毒对NO作用的敏感性存在着差异[2]。Croen首先证实NO在鼠源性RAW264.7细胞中有抗HSV-1作用[3]，但人源性U937细胞经诱导产生的NO则无抗HSV-1作用[4]。有关NO对HSV-1在HeLa细胞和Vero-E6细胞中增殖的影响尚未见报道。本文通过观察NO在不同来源的细胞中对HSV-1增殖的影响，试图为NO抗病毒作用机制研究提供新的依据。
1 材料与方法
1.1 材料 (1)病毒和细胞株：HSV-1(单纯疱疹病毒Ⅰ型)毒株来自安徽医科大学。HeLa细胞和Vero-E6细胞均为本室长期液氮保存。细胞用含10% FCS的DMEM培养基连续传代3次保持对数生长期供实验用。维持液为含2% FCS的DMEM培养基。(2)试剂：硝普钠(SNP)为北京制药工业研究所产品(注射用药)。对照试剂为铁氰化钾(KFC)，系国产分析纯。上述用药临用前用DMEM维持液配制。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 病毒感染 将24孔细胞培养板(costar)传代培养2d约90%长成单层的HeLa和Vero-E6细胞中每孔接种0.1ml 100TC1D50量的HSV-1液，37℃吸附1h后用Hanks'液轻洗3次，然后分别加入含0，50，250和500μmol.L-1 SNP或500μmol*L-1 KFC的DMEM维持液。置37℃ 5% CO2孵育箱中孵育48h，收集培养上清液置-70℃冻存，供病毒滴度和NO测定。实验中同时平行设置各浓度SNP条件下的正常细胞培养，以观察SNP对细胞活性的影响。
1.2.2 NO测定 按文献[5]方法测定NO-2浓度。
1.2.3 细胞活性检测 按文献[5]用MTT法稍加改进。在24孔细胞培养板的细胞中，每孔加入50μl 5mg.ml-1的MTT(Fluka)溶液，37℃孵育4h，弃MTT液，加1ml二甲亚砜(DMSO)溶解生成的结晶。用分光光度计测OD570值。
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1.2.4 病毒滴度测定 将待测液作10倍系列稀释，常规方法感染HeLa细胞单层，37℃培养5d，观察细胞病变情况，计算TC1D50量。
1.3 统计学处理 实验结果以均数±标准差(
±s)表示，组间比较用t检验。2 结果
2.1 SNP对细胞增殖的影响 结果见表1。实验所用浓度SNP对HeLa细胞和Vero-E6细胞的增殖均无显著影响(P>0.05)。
表1 SNP对HeLa细胞和Vero-E6细胞活性的影响(OD570值，
±s) SNP(μmol.L-1), 百拇医药
n
HeLa cells
Vero-E6 cells
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0.81±0.08
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0.76±0.03
0.85±0.02
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0.75±0.02
0.84±0.03
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0.76±0.04
0.83±0.04
2.2 SNP与细胞培养液中NO的量效关系 结果见表2。可见细胞培养上清液中NO量随SNP浓度增加而增加，同量的SNP在HeLa细胞和Vero-E6细胞培养液中释放的NO量无显著差异。而对照物KFC则无释放NO作用。
2.3 NO对HSV-1增殖的影响 随着SNP浓度增高，Vero-E6细胞上清液中HSV-1滴度减少，当SNP浓度为250μmol.L-1时，HSV-1的增殖受到显著抑制。而实验所用浓度SNP对HSV-1在HeLa细胞中的增殖无显著影响(P>0.05)(附图)。实验中当用500μmol.L-1 KFC作SNP对照时，HSV-1滴度(1ogTCID50=3.5±0.21)与正常对 照组(SNP=0)的HSV-1滴度(logTCID50=3.6±0.25)比较差异无显著性(P>0.05)表2 HSV-1感染48h后不同SNP浓度条件下细胞上清液中NO-2浓度(μmol.L-1,
±s) SNP(μmol.L-1), 百拇医药
n
HeLa cells
Vero-E6 cells
0
4
6.8±0.7
8.2±0.7
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20.6±1.7
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40.2±2.4
38.5±1.7
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56.4±1.8
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KFC对照
4
6.3±0.3
8.9±0.7
(500μmol.L-1)
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附图 不同浓度SNP的HeLa细胞和Vero-E6细胞上清液中的HSV-1滴度(n=4) ①与②比较P<0.01
Fig. Viral titers in supernatants with different concentrations of SNP of HeLa cells and Vero-E6 cells. ①P<0.01 vs ②
3 讨论
NO是机体细胞内一氧化氮合成酶(NOS)以L-精氨酸为底物所催化合成的高活性小分子化合物。研究发现，体内多种细胞含有NOS，发挥多种生理功能[6]。目前已有报道显示，NO对多种病毒的增殖有抑制作用，但确切机制尚不清楚。Karupiah等[7]认为NO抗HSV-1作用与NO作用于病毒的核糖核苷酸还原酶有关，因缺乏此酶的HSV变异株在NO作用病毒仍能复制。这种NO对病毒的直接作用可以解释不同的病毒对NO作用的敏感性不同[2，8]。另一方面，NO与超氧阴离子结合成过氧化亚硝酸根阴离子(ONOO-)，可改变宿主细胞膜脂、受体及其它相关蛋白等而改变细胞内信号传导通道，通过改变代谢酶而抑制病毒增殖。Subauste[9]和Sanders[10]研究了鼻病毒对人呼吸道上皮细胞的感染，发现细胞对病毒的敏感性、细胞表面粘附分子的表达、细胞因子水平以及NO抗病毒作用等几方面因素相关联。细胞NOS表达与细胞因子(IFN-γ，TNF-α等)密切相关[6]。这提示NO通过间接方式发挥抗病毒作用。
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本实验结果，SNP对HSV-1在HeLa细胞中增殖无显著影响，对照物KFC无抗HSV-1作用，说明SNP对HSV-1无直接作用，SNP对HSV-1在Vero-E6细胞中增殖的抑制作用乃NO所致。这与Croen[3]和Komatsu[1]的报道相一致。由于SNP在HeLa细胞和Vero-E6细胞上清液释放的NO量无显著差别(表2)，结果显示，HeLa细胞和Vero-E6细胞对NO作用的敏感性有差异。这可能是由于HeLa细胞是人宫颈癌上皮细胞株，而Vero-E6细胞为非洲绿猴肾上皮细胞株，二者来源不同，含有不同的酶系统、受体及其他相关因素，从而导致NO间接抗病毒作用的效果差异。这种差异的精确解释及NO生理作用的阐明有赖于NO抗病毒机制的深入研究。
中国图书分类号 Q28
参考文献
[1]Komatsu T, Bi ZB, Reiss CS. Interferon-γ induced type 1 nitric oxide synthase activity inhibits viral replication in neurons. J Neuroimmunol, 1996,68:101-108
, 百拇医药
[2]Krell TR, Elbl MM. Nitric oxide and viral infection: no antiviral activity against a fiavivirus in vitro and evidence for contribution to pathogenesis in experimental infection in vivo. Virology, 1996,219:304-306
[3]Croen KD. Evidence for an antiviral effect of nitric oxide. J Clin Invest, 1993,91:2446-2452
[4]Lopez-Guerrero JA, Alonso MA. Nitric oxide production induced by herpes simplex virus type 1 does not alter the course of the infection in human monocytic cells. J Gen Virol, 1997,78:1997-1980
, 百拇医药
[5]Bi ZB, Reiss CS. Inhibition of vesicular stomatitis virus infection by nitric oxide. J Virol, 1995,69:2208-2213
[6]Nathan C, Xie QW. Nitric oxide synthases: role, tolls, and controls. Cell, 1994,78:915-918
[7]Karupiah G, Harris N. Inhibition of viral replication by nitric oxide and its reversal by ferrous sulfate and tricarboxylic acid cycle metabolites. J Exp Med, 1995,181(6):2171-2179
[8]Lin YL, Huang YL, Ma SH, et al. Inhibition of Japanese encephalitis virus infection by nitric oxide: antiviral effect of NO on RNA virus replication. J Virol, 1997,71:5227-5235
, 百拇医药
[9]Subauste MC, Jacoby DB, Kichards SM, et al. Infection of a human respiratory epiehelial cell line with rhinovirus. J Clin Invest, 1995,96:549-557
[10]Sanders SP, Siekierski ES, Porter JD, et al. Nitric oxide inhibits rhinovirus-induced cytokine production and viral replication in a human respiratory epithelial cell line. J Virol, 1998,72:934-942
收稿日期：1999-02-02, http://www.100md.com