恶性黑色素瘤人端粒酶RNA原位杂交研究及意义①
作者：魏启幼 范松青
单位：第二附属医院病理科 长沙 410011
关键词：恶性黑色素瘤；人端粒酶RNA；原位杂交
湖南医科大学学报990204 提 要 应用原位杂交法检测恶性黑色素瘤，黑色素细胞痣和正常皮肤中的hTR表达。结果显示：①恶性黑色素瘤，黑色素细胞痣和正常皮肤的hTR阳性表达率分别为86.3%，6.25%和16.7%；恶性黑色素瘤的hTR阳性表达率显著高于黑色素细胞痣和正常皮肤的阳性表达率(P<0.01)。②转移性恶性黑色素瘤的hTR阳性表达强度显著强于原发性恶性黑色素瘤者(P<0.05)。提示hTR能间接地反映端粒酶的活性。hTR可作为恶性黑色素瘤的诊断和转移预测的新标志物。
Significance of human Telomerase RNA expression in situ in
, 百拇医药
malignant melanoma
Wei Qiyou Fen Songqing
(Department of Pathology, The Second Affiliated Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410011)
By using the method of hybridization in situ, human telomerase RNA(hTR) are detected in 36 cases of malignant melanoma tissue, 16 cases of nevocellular nevus and 12 cases of normal skin. Results showed that the positive expression percentage of hTR in malignant melanoma, nevocellular nevus and normal skin was 86.3%, 6.26% and 12.7%, respectively. The positive expression percentage of hTR in malignant melanoma was significantly higher than that of nevocellular nevus and normal skin(P<0.01). Meanwhile, the positive expression intensity of hTR in metastatic malignant melanoma is frequently stronger than that of original malignant melanoma(P<0.05). The results suggest that hTR might indirectly reflect the telomerase activity, and be used as a new marker for diagnosis of malignant melanoma and metastasis prediction.
, 百拇医药
Key words malignant melanoma; human telomerase RNA; expression; hybridization in situ
端粒是染色体末端由非编码核苷酸六聚体与端粒结合蛋白结合而成的核蛋白复合体。是细胞的“分裂时钟”。端粒酶是维持端粒长度变化所必需的逆转录酶，其活性表达对细胞增殖，衰老，细胞的永生化及癌变有重要意义[1]，端粒酶活性的检测常局限于新鲜组织标本[2]，而逆转录PCR和原位杂交检测人端粒酶RNA(human telomerase RNA, hTR)成份，能间接地反映端粒酶的活性，并可用于研究存档石蜡标本[3]。本实验用原位杂交法检测恶性黑色素瘤的hTR表达，探讨hTR的表达与恶性黑色素瘤之间的联系，为恶性黑色素瘤的诊断提供一种新的手段。
1 材料与方法
, http://www.100md.com 1.1 材料 (1)标本：选自本院1977～1998年期间手术切除的无色素或少色素型恶性黑色素瘤标本36例，均经HE染色及组织化学和免疫组化HMB45染色确诊，其中原发性恶性黑色素瘤24例，分别来源于皮肤(14例)，眼眶、口腔、鼻腔(各3例)，直肠(1例)；转移性恶性黑色素瘤12例(转移至淋巴结10例，支气管和胃各1例)。36例中男23例，女13例，年龄37～62(49.3±11.2)岁。另选取黑色素细胞痣16例，正常皮肤12例作为对照，年龄32～55(33.7±13.5)岁。所有标本均用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋切片。(2)试剂：地高辛标记的端粒酶RNA(hTR)原位杂交试剂盒由北京医科大学病理系张波教授提供。
1.2 方法 采用地高辛标记探针的原位杂交法，NBT/BCIP显色，实验中所有载玻片均用APES防脱片处理。具体操作步骤如下：常规石蜡切片，厚4μm，60℃烤箱内烤片5h；切片脱蜡水化，0.1NHCL室温10min，蛋白酶K(1∶10)37℃ 20min，4%多聚甲醛室温10min；90%的冰乙醇(-20℃)脱水；每片滴加20μl杂交液(Hyb A液18μl，HybB液2μl，混匀，80℃加热10min)；用封口膜覆盖，放湿盒中(含50%甲酰胺)50℃ 16～24h保温；将切片置于2×SSC中(含50%甲酰胺)，37℃，30min，置于2×SSC中37℃,15min共2次，切片置于Buffer Ⅰ洗1min；(1∶100)马血清封闭，室温30min，抗Dig-AP(1∶500)50μl/片，37℃ 1h，Buffer Ⅱ洗10min共3次。BufferⅢ洗2min；NBT/BCIP显色(暗处数分钟～数小时)，蛋白甘油封片，同时设阳性和阴性对照。
, 百拇医药
1.3 结果判断[8] (1)细胞浆或细胞核出现蓝紫色为阳性。(2)阳性染色的计算为肿瘤阳性细胞数记分(0～4)与肿瘤阳性染色区域记分之和减去肿瘤背景染色记分(0～4)；无阳性细胞数记0分；<25%,25%～50%，50%～75%,>75%的阳性肿瘤细胞数分别记1，2，3，4分；作为表达强度分析，无阳性染色为0分；1/4，2/4，3/4和4/4的阳性肿瘤染色区域分别记1，2，3，4分；无背景染色为0，弱背景、中等背景、强背景、极强背景染色分别记1，2，3，4分。
1.4 统计学处理 采用χ2检验和t检验。
2 结果
2.1 恶性黑色素瘤，黑色素细胞痣和正常皮肤中hTR的阳性表达与分布 结果见表1。恶性黑色素瘤的hTR阳性表达率为86.3%，大部分肿瘤的阳性信号位于细胞浆(图1)，少部分肿瘤的阳性信号位于细胞浆，细胞核(图2)。黑色素细胞痣的hTR阳性率为6.25%，阳性信号位于细胞核(图3)，正常皮肤hTR的阳性率16.7%，阳性信号在细胞浆(图4)。恶性黑色素瘤的hTR阳性表达率显著高于黑色素细胞痣和正常皮肤的hTR阳性表达率(P<0.01)。
, 百拇医药
表1 恶性黑色素瘤，黑色素细胞痣和正常皮肤的hTR表达 组别
例数
hTR表达
阳性例数
阳性率(%)
恶性黑色素瘤
36
31
86.3〓
黑色素细胞痣
16
1
, http://www.100md.com
6.25①
正常皮肤
12
2
16.7①
①与恶性黑色素瘤比，均P<0.01
图1 hTR阳性表达位于恶性黑色素瘤细胞浆、原位杂交 ×400
图2 hTR阳性表达位于恶性黑色素瘤细胞浆和细胞核，原位杂交 ×400
, 百拇医药
图3 hTR阳性表达位于黑色素细胞痣的细胞核，原位杂交 ×200
图4 hTR阳性表达位于正常鳞状上皮细胞浆，原位杂交 ×100
Fig. 1 The cytoplasms of malignant melanoma showing positive expression of hTR by hybridization in situ ×400
Fig. 2 Both cytoplasms and nucleues of malignant melanoma showing positive expression of hTR by hybridization in situ ×400
Fig. 3 The nucleuses of nevocellular nevus showing positive expression of hTR by hybridization in situ ×200
, 百拇医药
Fig. 4 The stratified epitheliar cytoplasms of normal skin showing positive expression of hTR by hybridization in situ ×100
2.2 原发性恶性黑色素瘤与转移性恶性黑色素瘤的hTR阳性表达率和表达强度的比较 结果见表2。转移性恶性黑色素瘤的hTR阳性表达强度显著高于原发性恶性黑色素瘤(P<0.05)；但其二者的hTR阳性表达率相比差异无显著性(P>0.05)。
表2 原发性与转移性恶性黑色素瘤的hTR阳性表达率和表达强度的比较 组别
例数
hTR表达
阳性率
, http://www.100md.com (%)
阳性强度
(
±s)
原发性恶性黑色素瘤
24
20
2.85±1.69①
转移性恶性黑色素瘤
12
11
4.45±2.11②
, 百拇医药
①与②比较P<0.05
3 讨论
1995年Singer等人分离并克隆了Hela细胞的端粒酶RNA。命名为人端粒酶RNA(hTR)，并且发现其在干细胞及肿瘤细胞中hTR比正常细胞高表达。因此，端粒酶作为正常细胞增殖，分化及肿瘤细胞的无限增殖的重要调控因子备受关注。端粒酶活性检测常是利用PCR扩增后，根据电泳后显带来对端粒酶活性进行半定量分析，但要求条件较高，使用受到限制。Yashima等人建立了原位杂交法检测肿瘤组织的hTR原位表达。并将Trap-PCR半定量检测的端粒酶活性结果与石蜡标本切片hTR原位杂交的结果进行比较，显示两种检测方法的结果有很好的一致性[4]。原位杂交检测hTR的表达能间接地反映端粒酶的活性，也可原位直观地显示肿瘤细胞中hTR的阳性位置。而且适用于档存石蜡标本，有利于对各肿瘤进行端粒酶活性表达的回顾性研究。
本实验利用原位杂交法检测恶性黑色素瘤，黑色素细胞痣和正常皮肤组织中的hTR表达，结果显示恶性黑色素瘤的hTR阳性表达率达86.3%，显著高于黑色素细胞痣(6.25%)和正常皮肤(16.7%)。Taylor等对7例恶性黑色素瘤的端粒酶活性进行研究，结果发现6例恶性黑色素瘤有端粒酶活性(85.7%)[5]。Kim等人对400多例来源于12种不同组织的原发肿瘤病例进行端粒酶检测，其阳性率高达84.8%，而肿瘤周围正常组织或良性病变中阳性率仅为4.2%[2]，良恶性肿瘤中端粒酶活性存在显著性差异，表明端粒酶可作为肿瘤诊断的标志物。本实验检测hTR的阳性表达结果与文献报道的端粒酶活性检测结果十分相似[2，3，5，6]。提示肿瘤组织中的hTR原位表达能间接地反映其端粒酶的活性，hTR作为恶性黑色素瘤的一种新的肿瘤标志物，有助于恶性黑色素瘤与黑色素细胞痣的鉴别诊断。
, http://www.100md.com
有研究结果表明，端粒酶的活性水平与肿瘤的大小，淋巴结的转移，肿瘤的分级和预后密切相关[3，7]。本实验结果显示转移性恶性黑色素瘤的hTR阳性表达强度显著高于原发性恶性黑色素瘤，提示hTR表达强度与肿瘤的转移有某种程度的联系，即端粒酶活性越高，肿瘤细胞越容易发生转移，肿瘤的恶性生物学行为增加。因此，hTR的检测有助于肿瘤细胞的恶性生物学行为的预测。
由此可见，原位杂交法检测hTR的表达，不仅能间接地反映肿瘤细胞端粒酶的活性，而且有助于良恶性肿瘤的鉴别诊断。hTR可作为恶性黑色素瘤一种新的肿瘤标志物及其转移的预测指标。
①湖南省科委资助项目
中国图书分类号 R739.5
参考文献
[1]Allossop RC, Vaziri H, Patterson C, et al. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA, 1992,89:10114-10118
, 百拇医药
[2]Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994,266:2011-2015
[3]Yashima K, Piatyszek MA, Saborian HM, et al. Telomerase activity and in situ telomerase RNA expression in malignant and non-malignant lymph nodes. J Clin Pathol, 1997,50:110-117
[4]Singer MS, Gottschling DE, TLCL. Template RNA component of Sacharomyces cerevisiae telomerase. Science, 1994,266:404-409
, http://www.100md.com
[5]Taylor RS, Ramirez RD, Ogoshi M, et al. Detection of telomerase activity in malignant and nonmalignant skin conditions. J Invest Dermatol, 1996,106:759-765
[6]Ueda M, Ouhtit A, Bito T, et al. Evidence of uv-associated activation of telomerase in human skin. Cancer Res, 1997,57:370-374
[7]Hiyama E, Yokoyama T, Tatsumoto N, et al. Telomerase activity in gastric cancer. Cancer Res, 1995,55:3258-3262
[8]Kuhajda FP, Offutt LE, ASCP HT, et al. The distribution of CEA in breast carcinoma diagnostic and prognostic implications. Cancer, 1983,52:1257-1264
收稿日期：1998-03-10, 百拇医药
单位：第二附属医院病理科 长沙 410011
关键词：恶性黑色素瘤；人端粒酶RNA；原位杂交
湖南医科大学学报990204 提 要 应用原位杂交法检测恶性黑色素瘤，黑色素细胞痣和正常皮肤中的hTR表达。结果显示：①恶性黑色素瘤，黑色素细胞痣和正常皮肤的hTR阳性表达率分别为86.3%，6.25%和16.7%；恶性黑色素瘤的hTR阳性表达率显著高于黑色素细胞痣和正常皮肤的阳性表达率(P<0.01)。②转移性恶性黑色素瘤的hTR阳性表达强度显著强于原发性恶性黑色素瘤者(P<0.05)。提示hTR能间接地反映端粒酶的活性。hTR可作为恶性黑色素瘤的诊断和转移预测的新标志物。
Significance of human Telomerase RNA expression in situ in
, 百拇医药
malignant melanoma
Wei Qiyou Fen Songqing
(Department of Pathology, The Second Affiliated Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410011)
By using the method of hybridization in situ, human telomerase RNA(hTR) are detected in 36 cases of malignant melanoma tissue, 16 cases of nevocellular nevus and 12 cases of normal skin. Results showed that the positive expression percentage of hTR in malignant melanoma, nevocellular nevus and normal skin was 86.3%, 6.26% and 12.7%, respectively. The positive expression percentage of hTR in malignant melanoma was significantly higher than that of nevocellular nevus and normal skin(P<0.01). Meanwhile, the positive expression intensity of hTR in metastatic malignant melanoma is frequently stronger than that of original malignant melanoma(P<0.05). The results suggest that hTR might indirectly reflect the telomerase activity, and be used as a new marker for diagnosis of malignant melanoma and metastasis prediction.
, 百拇医药
Key words malignant melanoma; human telomerase RNA; expression; hybridization in situ
端粒是染色体末端由非编码核苷酸六聚体与端粒结合蛋白结合而成的核蛋白复合体。是细胞的“分裂时钟”。端粒酶是维持端粒长度变化所必需的逆转录酶，其活性表达对细胞增殖，衰老，细胞的永生化及癌变有重要意义[1]，端粒酶活性的检测常局限于新鲜组织标本[2]，而逆转录PCR和原位杂交检测人端粒酶RNA(human telomerase RNA, hTR)成份，能间接地反映端粒酶的活性，并可用于研究存档石蜡标本[3]。本实验用原位杂交法检测恶性黑色素瘤的hTR表达，探讨hTR的表达与恶性黑色素瘤之间的联系，为恶性黑色素瘤的诊断提供一种新的手段。
1 材料与方法
, http://www.100md.com 1.1 材料 (1)标本：选自本院1977～1998年期间手术切除的无色素或少色素型恶性黑色素瘤标本36例，均经HE染色及组织化学和免疫组化HMB45染色确诊，其中原发性恶性黑色素瘤24例，分别来源于皮肤(14例)，眼眶、口腔、鼻腔(各3例)，直肠(1例)；转移性恶性黑色素瘤12例(转移至淋巴结10例，支气管和胃各1例)。36例中男23例，女13例，年龄37～62(49.3±11.2)岁。另选取黑色素细胞痣16例，正常皮肤12例作为对照，年龄32～55(33.7±13.5)岁。所有标本均用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋切片。(2)试剂：地高辛标记的端粒酶RNA(hTR)原位杂交试剂盒由北京医科大学病理系张波教授提供。
1.2 方法 采用地高辛标记探针的原位杂交法，NBT/BCIP显色，实验中所有载玻片均用APES防脱片处理。具体操作步骤如下：常规石蜡切片，厚4μm，60℃烤箱内烤片5h；切片脱蜡水化，0.1NHCL室温10min，蛋白酶K(1∶10)37℃ 20min，4%多聚甲醛室温10min；90%的冰乙醇(-20℃)脱水；每片滴加20μl杂交液(Hyb A液18μl，HybB液2μl，混匀，80℃加热10min)；用封口膜覆盖，放湿盒中(含50%甲酰胺)50℃ 16～24h保温；将切片置于2×SSC中(含50%甲酰胺)，37℃，30min，置于2×SSC中37℃,15min共2次，切片置于Buffer Ⅰ洗1min；(1∶100)马血清封闭，室温30min，抗Dig-AP(1∶500)50μl/片，37℃ 1h，Buffer Ⅱ洗10min共3次。BufferⅢ洗2min；NBT/BCIP显色(暗处数分钟～数小时)，蛋白甘油封片，同时设阳性和阴性对照。
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1.3 结果判断[8] (1)细胞浆或细胞核出现蓝紫色为阳性。(2)阳性染色的计算为肿瘤阳性细胞数记分(0～4)与肿瘤阳性染色区域记分之和减去肿瘤背景染色记分(0～4)；无阳性细胞数记0分；<25%,25%～50%，50%～75%,>75%的阳性肿瘤细胞数分别记1，2，3，4分；作为表达强度分析，无阳性染色为0分；1/4，2/4，3/4和4/4的阳性肿瘤染色区域分别记1，2，3，4分；无背景染色为0，弱背景、中等背景、强背景、极强背景染色分别记1，2，3，4分。
1.4 统计学处理 采用χ2检验和t检验。
2 结果
2.1 恶性黑色素瘤，黑色素细胞痣和正常皮肤中hTR的阳性表达与分布 结果见表1。恶性黑色素瘤的hTR阳性表达率为86.3%，大部分肿瘤的阳性信号位于细胞浆(图1)，少部分肿瘤的阳性信号位于细胞浆，细胞核(图2)。黑色素细胞痣的hTR阳性率为6.25%，阳性信号位于细胞核(图3)，正常皮肤hTR的阳性率16.7%，阳性信号在细胞浆(图4)。恶性黑色素瘤的hTR阳性表达率显著高于黑色素细胞痣和正常皮肤的hTR阳性表达率(P<0.01)。
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表1 恶性黑色素瘤，黑色素细胞痣和正常皮肤的hTR表达 组别
例数
hTR表达
阳性例数
阳性率(%)
恶性黑色素瘤
36
31
86.3〓
黑色素细胞痣
16
1
, http://www.100md.com
6.25①
正常皮肤
12
2
16.7①
①与恶性黑色素瘤比，均P<0.01
图1 hTR阳性表达位于恶性黑色素瘤细胞浆、原位杂交 ×400
图2 hTR阳性表达位于恶性黑色素瘤细胞浆和细胞核，原位杂交 ×400
, 百拇医药
图3 hTR阳性表达位于黑色素细胞痣的细胞核，原位杂交 ×200
图4 hTR阳性表达位于正常鳞状上皮细胞浆，原位杂交 ×100
Fig. 1 The cytoplasms of malignant melanoma showing positive expression of hTR by hybridization in situ ×400
Fig. 2 Both cytoplasms and nucleues of malignant melanoma showing positive expression of hTR by hybridization in situ ×400
Fig. 3 The nucleuses of nevocellular nevus showing positive expression of hTR by hybridization in situ ×200
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Fig. 4 The stratified epitheliar cytoplasms of normal skin showing positive expression of hTR by hybridization in situ ×100
2.2 原发性恶性黑色素瘤与转移性恶性黑色素瘤的hTR阳性表达率和表达强度的比较 结果见表2。转移性恶性黑色素瘤的hTR阳性表达强度显著高于原发性恶性黑色素瘤(P<0.05)；但其二者的hTR阳性表达率相比差异无显著性(P>0.05)。
表2 原发性与转移性恶性黑色素瘤的hTR阳性表达率和表达强度的比较 组别
例数
hTR表达
阳性率
, http://www.100md.com (%)
阳性强度
(
±s)原发性恶性黑色素瘤
24
20
2.85±1.69①
转移性恶性黑色素瘤
12
11
4.45±2.11②
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①与②比较P<0.05
3 讨论
1995年Singer等人分离并克隆了Hela细胞的端粒酶RNA。命名为人端粒酶RNA(hTR)，并且发现其在干细胞及肿瘤细胞中hTR比正常细胞高表达。因此，端粒酶作为正常细胞增殖，分化及肿瘤细胞的无限增殖的重要调控因子备受关注。端粒酶活性检测常是利用PCR扩增后，根据电泳后显带来对端粒酶活性进行半定量分析，但要求条件较高，使用受到限制。Yashima等人建立了原位杂交法检测肿瘤组织的hTR原位表达。并将Trap-PCR半定量检测的端粒酶活性结果与石蜡标本切片hTR原位杂交的结果进行比较，显示两种检测方法的结果有很好的一致性[4]。原位杂交检测hTR的表达能间接地反映端粒酶的活性，也可原位直观地显示肿瘤细胞中hTR的阳性位置。而且适用于档存石蜡标本，有利于对各肿瘤进行端粒酶活性表达的回顾性研究。
本实验利用原位杂交法检测恶性黑色素瘤，黑色素细胞痣和正常皮肤组织中的hTR表达，结果显示恶性黑色素瘤的hTR阳性表达率达86.3%，显著高于黑色素细胞痣(6.25%)和正常皮肤(16.7%)。Taylor等对7例恶性黑色素瘤的端粒酶活性进行研究，结果发现6例恶性黑色素瘤有端粒酶活性(85.7%)[5]。Kim等人对400多例来源于12种不同组织的原发肿瘤病例进行端粒酶检测，其阳性率高达84.8%，而肿瘤周围正常组织或良性病变中阳性率仅为4.2%[2]，良恶性肿瘤中端粒酶活性存在显著性差异，表明端粒酶可作为肿瘤诊断的标志物。本实验检测hTR的阳性表达结果与文献报道的端粒酶活性检测结果十分相似[2，3，5，6]。提示肿瘤组织中的hTR原位表达能间接地反映其端粒酶的活性，hTR作为恶性黑色素瘤的一种新的肿瘤标志物，有助于恶性黑色素瘤与黑色素细胞痣的鉴别诊断。
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有研究结果表明，端粒酶的活性水平与肿瘤的大小，淋巴结的转移，肿瘤的分级和预后密切相关[3，7]。本实验结果显示转移性恶性黑色素瘤的hTR阳性表达强度显著高于原发性恶性黑色素瘤，提示hTR表达强度与肿瘤的转移有某种程度的联系，即端粒酶活性越高，肿瘤细胞越容易发生转移，肿瘤的恶性生物学行为增加。因此，hTR的检测有助于肿瘤细胞的恶性生物学行为的预测。
由此可见，原位杂交法检测hTR的表达，不仅能间接地反映肿瘤细胞端粒酶的活性，而且有助于良恶性肿瘤的鉴别诊断。hTR可作为恶性黑色素瘤一种新的肿瘤标志物及其转移的预测指标。
①湖南省科委资助项目
中国图书分类号 R739.5
参考文献
[1]Allossop RC, Vaziri H, Patterson C, et al. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA, 1992,89:10114-10118
, 百拇医药
[2]Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994,266:2011-2015
[3]Yashima K, Piatyszek MA, Saborian HM, et al. Telomerase activity and in situ telomerase RNA expression in malignant and non-malignant lymph nodes. J Clin Pathol, 1997,50:110-117
[4]Singer MS, Gottschling DE, TLCL. Template RNA component of Sacharomyces cerevisiae telomerase. Science, 1994,266:404-409
, http://www.100md.com
[5]Taylor RS, Ramirez RD, Ogoshi M, et al. Detection of telomerase activity in malignant and nonmalignant skin conditions. J Invest Dermatol, 1996,106:759-765
[6]Ueda M, Ouhtit A, Bito T, et al. Evidence of uv-associated activation of telomerase in human skin. Cancer Res, 1997,57:370-374
[7]Hiyama E, Yokoyama T, Tatsumoto N, et al. Telomerase activity in gastric cancer. Cancer Res, 1995,55:3258-3262
[8]Kuhajda FP, Offutt LE, ASCP HT, et al. The distribution of CEA in breast carcinoma diagnostic and prognostic implications. Cancer, 1983,52:1257-1264
收稿日期：1998-03-10, 百拇医药