化疗药物联合细胞因子对bcr-abl转基因小鼠骨髓细胞生长及转基因表达的影响①

http://www.100md.com 《湖南医科大学学报》 1999年第2期

     作者：陈汉春 Andrew Pierce Tony Whetton

    单位：陈汉春 湖南医科大学分子生物学研究中心 长沙 410078；Andrew Pierce Tony Whetton 英国曼彻斯特科技大学生物分子科学系，M60，1QD，UK

    关键词：基因；Abl；转基因小鼠；化疗药物；mSCF；mIL-3

    湖南医科大学学报990201 提 要 应用Hu或5-Fu和鼠干细胞因子(mSCF)及鼠白细胞介素-3(mIL-3)培养含金属硫蛋白(MT)启动子和增强子序列、bcr-abl cDNA(p210)序列及SV40剪切和Poly(A)信号序列的转基因慢粒白血病小鼠骨髓细胞，观察化疗药物及细胞因子单独或联合应用对MT/p210(bcr-abl)转基因小鼠骨髓细胞生长的影响，并采用RT-PCR分析培养前后骨髓细胞中转基因的表达。结果表明，mSCF和mIL-3联合应用时，明显促进骨髓细胞增殖及集落形成；不加细胞因子培养，则细胞增殖和转基因表达均受抑制；Hu或5-Fu与mSCF及mIL-3联合应用时，同样抑制细胞增殖及转基因表达。提示联合应用化疗药物及细胞因子治疗CML是具有极好应用前景的策略。

    Influence of chemotherapeutants and cytokines on growth and

    transgene expression of bone marrow cells from

    MT/p210(bcr-abl) transgenic miceChen Hanchun

    (Molecular Biology Research Center, Hunan Medical University, Changsha 410078)

    Andrew Pierce Tony Whetton

    (Department of Biomolecular Sciences, UMIST, Manchester, M60, 1QD, UK)

    The bone marrow cells of CML(chronic myelogenous leukemia) transgenic mice carrying metallothionein(MT) promoter/enhancer, bcr-abl(p210) cDNA and SV40 splicing/poly(A) signal sequences were cultured in liquid and soft agar with hydroxyurea(Hu), 5-fluorouracil(5-Fu), mouse stem cell factor(mSCF) and mouse interleukin-3(mIL-3) independently or combinatively. The cell or colony counting and transgene RT-PCR analysis showed that the proliferation, colony formation and transgene expression of the bone marrow cells were advanced in the combinative culture of mSCF with mIL-3, but they were significantly inhibited in the culture without any growth factors, or with mSCF, mIL-3 and Hu or 5-Fu. These findings suggest that the combinative utilization of chemotherapeutants and cytokines is a potentially effective strategy of the clinical treatment for CML.

    Key words gene,ABL; transgenic mouse; chemotherapeutant; mSCF; mIL-3

    正常9号与22号染色体长臂易位而产生一种缩短了的异常22号染色体，称费城染色体(ph′)。由于基因易位重排，在ph′染色体易位融合点位置出现了bcr-abl嵌合基因，该嵌合基因表达产生一种具有强酪氨酸激酶活性的p210蛋白质，从而异常激活Ras信号转导途径，使细胞无限制增殖而致白血病发生^[1]。慢性粒细胞性白血病(CML)的治疗主要包括骨髓移植、干扰素(IFN)治疗及羟基脲(Hu)等化疗药物治疗。骨髓移植主要适应于45岁以下病人，且需人类白细胞抗原(human leukocyte antigens, HLA)配型或体外骨髓净化，单纯高剂量化疗则出现骨髓抑制等副作用^[2]。目前正尝试采用化疗药物与细胞因子联合治疗CML^[3]。本研究应用化疗药物Hu或5-Fu联合细胞因子SCF及IL-3体外培养MT/p210(bcr-abl)转基因小鼠骨髓细胞，以观察其对CML小鼠骨髓细胞生长及bcr-abl基因表达的影响，探讨CML联合治疗的有效途径及其分子作用机制。

    1 材料与方法1.1 材料

    MT/p210(bcr-abl)转基因小鼠系由Honda H等构建的C57BL/6XDBA2小鼠^[4]，Iscoves细胞培养基、胎牛血清(FCS)、小鼠IL-3(mIL-3)，Trizol试剂及Taq DNA聚合酶为GIBCO/BRL公司产品；牛血清白蛋白(BSA)，5-Fu,Hu，琼脂，DEPC及无RNA酶的DNA酶Ⅰ为Sigma公司产品；小鼠粒系-巨噬系集落刺激因子(mGM-CSF)及小鼠SCF(mSCF)为Genzyme公司产品；一步化RT-PCR Titan试剂盒为Boehringer Mannheim公司产品。PCR引物序列为：

    bcr有义引物-5’-ATTCGCTGACCATCAATAAG-3’

    abl反义引物-5’-GGCGTGATGTAGTTGCTTGG-3’

    SV40有义引物-5’-CGCTTTGGTCCCGGATCTTT-3’

    SV40反义引物-5’-TCATCACTAGATGGCATTTC-3’，均由Pharmacia Biotech公司合成。

    1.2 方法

    1.2.1 MT/p210(bcr-abl)转基因小鼠所携bcr-abl基因PCR分析 耳垂穿孔法获取MT/p210(bcr-abl)转基因小鼠组织约200mg加于20μl消化缓冲液(50mmol^.L^-1 Tris-Cl, pH8.0, 20mmol^.L^-1 NaCl, 1mmol*L^-1 EDTA， 1% SDS和20mg/ml蛋白酶K)，55℃水浴30min，加蒸馏水180μl，混匀后沸水浴5min。取其中1μl作为DNA模板，分别以bcr,abl及SV40引物经Taq DNA聚合酶催化进行DNA PCR扩增。加入DNA模板、引物及dNTP后于95℃变性5min，冷至54℃时加入Taq DNA聚合酶，总反应体系为50μl。PCR程序为95℃、30s，54℃，45s，72℃，1min，35个循环后于72℃延伸5min，取10μl以2.5%琼脂糖凝胶电泳及溴乙锭染色分析PCR产物。

    1.2.2 骨髓细胞液体培养及琼脂半固体培养 取MT/p210(bcr-abl)转基因阳性小鼠二股骨全骨髓细胞于Iscoves培养基中洗涤离心一次，以Iscoves培养基补充20% FCS及10% BSA作为基本培养条件，分别在不加外源因子及药物或加入：①mSCF 100ng^.ml^-1和mIL-3 20ng^.ml^-1以及在此基础上加入5-Fu 10μg^.ml^-1或Hu 10mM等4种培养条件下，于37℃、5% CO₂充湿培养7d，每24h计数细胞总数及台盼兰染色计数活细胞率，以20只小鼠骨髓细胞培养所得活细胞数的平均值绘制不同培养条件下细胞生长曲线；②mGM-CSF 250ng^.ml^-1，mIL-3 20ng^.ml^-1及在此基础上加入5-Fu 10μg^.ml^-1或Hu 10mM，以及③mGM-CSF 250ng^.ml^-1，mIL-3 20ng^.ml^-1-mSCF 100ng^.ml^-1及在此基础上加入5-Fu 10μg^.ml^-1或Hu 10mM，以1.0×10⁴至5.0×10⁶等不同起始培养细胞密度，于37℃，5% CO₂条件下进行3.3%软琼脂集落培养12d，计数不同培养条件下的细胞集落，取20只小鼠同一条件下骨髓细胞培养所得集落数的平均值绘制集落形成曲线。

    1.2.3 总RNA提取、纯化及浓度测定 离心收集不同条件下液体培养7d的骨髓细胞，加于1ml Trizol试剂中，混匀后加0.2ml氯仿，摇匀并于室温静置2min，于4℃, 12?!000g离心15min。吸取含RNA的上层水相，加0.5ml异丙醇，混匀后室温静置10min，于4℃，12?!000g离心10min。以75%乙醇洗涤离心(4℃,7 500g,5min)一次，空气中干燥RNA沉淀5至10min。加DEPC处理水90μl，于60℃水浴5min溶解RNA，加入10×高盐消化缓冲液10μl及无RNA酶的DNA酶Ⅰ1.5U， 37℃、30min消化样品中可能残留的DNA，经苯酚、氯仿抽提后，以乙醇、醋酸钠沉淀RNA，以75%乙醇洗RNA沉淀一次并于空气中干燥后，以20μl DEPC水溶解RNA，分光光度法测定各样品RNA含量。

    1.2.4 RT-PCR分析 准确取各样品RNA 1μg，按Boehringer Mannheim公司推荐方法，在50μl反应体系中，加SV40反义引物及dNTP和RT-PCR缓冲液，于60℃加热2min后，加入RT-PCR Titan混合酶，于49℃、30min逆转录SV40 mRNA为cDNA。于94℃ 2min变性后，进行PCR扩增。程序为94℃ 30s，49℃ 40s,68℃ 40s，35个循环后于68℃延伸5min，取10μl反应产物、采用ΦX174 DNA/Hinc Ⅱ片段及MT/p210(bcr-abl)转基因阳性小鼠的DNA bcr-abl和SV40 PCR产物作分子量对照，经2.5%琼脂糖凝胶电泳及溴乙锭染色后以美国Stratagene公司产Eagle EyeⅡ型图像分析处理系统对SV40 mRNA的RT-PCR片段(174bp)电泳区带进行光密度扫描，并以未培养的小鼠骨髓细胞中SV40 mRNA表达量为基准，定量分析各培养条件下被转移基因的表达水平。

    2 结果

    2.1 MT/p210(bcr-abl)转基因小鼠被转移基因遗传频率分析 442只bcr-abl阳性小鼠后代中，检测出bcr-abl阳性鼠298只，总阳性率为67.4%，其中236只雄鼠中bcr-abl阳性鼠118只，占50%；206只雌鼠中bcr-abl阳性鼠180只，占87.4%，雌鼠群中被转移基因的阳性率约为雄鼠群的1.3倍。

    2.2 化疗药物及细胞因子对MT/p210(bcr-abl)转基因小鼠骨髓细胞生长的影响 在不加任何生长因子的条件下培养，细胞无增殖，且快速死亡。SCF与IL-3联合使用具有促细胞生长作用，细胞经过体外生长适应后，于培养的第4d及第5d均呈现细胞增殖，但在培养的第5d及第7d，因未能继续补充外源细胞因子，其培养细胞逐渐死亡。在SCF及IL-3促进细胞增殖的基础上，分别加入二种化疗药物，5-Fu对细胞的杀伤或生长抑制效应出现较快，在培养的第2d即十分明显，但Hu对细胞的杀伤或生长抑制效应持续时间较长，在培养的第5d其作用仍较明显(图1)。

    图1 化疗药物及细胞因子对MT/p210(bcr-abl)转基因小鼠骨髓细胞生长的影响

    Fig. 1 Influence of chemotherapeutants and cytokines on the growth of bone marrow cells from MT/p210(bcr-abl) transgenic mice

    不加生长因子或在加入GM-CSF，IL-3和加入GM-CSF，IL-3，SCF的基础上使用Hu或5-Fu进行软琼脂培养12d，在1.0×10⁴至5.0×10⁶的不同起始细胞密度的培养条件下，均未见集落形成。在GM-CSF和IL-3作用的基础上，SCF呈现十分明显的促集落形成效应(图2)。

    图2 细胞因子对MT/p210(bcr-abl)转基因小鼠骨髓细胞集落形成的影响

    Fig. 2 Influence of cytokines on colony formation of bone marrow cells from MT/p210(bcr-abl) transgenic mice

    2.3 化疗药物及细胞因子对MT/p210(bcr-abl)转基因小鼠骨髓细胞中被转移基因表达的影响 结果见图3。转基因小鼠DNA的bcr-abl PCR扩增信号甚强(lane 1, 372bp)；同样扩增条件下，获得了其SV40 DNA的PCR扩增片段(lane 2, 244bp)；以未培养的小鼠骨髓细胞中被转移基因SV40的表达水平作对照(lane 3, 174bp,相对表达量为1)，不加生长因子培养的骨髓细胞中被转移基因的表达信号甚弱(lane 4，相对表达量为0.3536±0.008，n=20)；经IL-3联合SCF培养的骨髓细胞中被转移基因SV40 mRNA扩增信号较强(lane 5,相对表达量为0.8551±0.007，n=20)，在此基础上加入5-Fu或Hu均使培养细胞中被转移基因的表达信号减弱(lane 6和7，相对表达量分别为0.6902±0.006，n=20和0.6422±0.005，n=20)；在不使用生长因子的同时，加入化疗药物Hu培养的骨髓细胞中其被转移基因几乎无表达(lane 8，相对表达量为0.1167±0.008，n=20)。

    图3 MT/p210(bcr-abl)转基因小鼠骨髓细胞培养后被转移基因表达mRNA的RT-PCR扩增图谱

    M：ΦX174/Hinc Ⅱ DNA分子量标准

    Fig. 3 RT-PCR amplified map of the transgene expressed mRNA in the cultured bone marrow cells from MT/p210(bcr-abl) transgenic mice

    M：ΦX174/Hinc Ⅱ DNA molecular size markers

    3 讨论

    由于CML具有特征性的Ph′染色体，它已成为研究白血病及其他恶性肿瘤的分子病因及分子治疗机制的理想模型，常用于评价CML诸多治疗药物及方案的效果^[5]。CML细胞对现用药物的强抗药性，因此，探寻新的治疗药物或联合治疗方案及进一步研究其分子作用机制对CML的分子病理学研究和指导临床治疗具有重要的意义。以转基因动物模型研究人类疾病具有取材容易、操作简便及无风险等诸多优点。该研究采用的MT/p210(bcr-abl)转基因小鼠模型，整合了全长的bcr-abl cDNA序列，能完整表达p210蛋白质并使其转基因小鼠发生CML^[4]，但整合入转基因小鼠细胞基因组DNA中的bcr-abl cDNA与其mRNA的PCR扩增片段大小无差异。为了能检测被转移基因的表达水平，在整合的SV40 poly(A)信号序列中包含了70bp的剪切序列，故使整合入转基因小鼠细胞基因组的SV40 DNA PCR扩增的片段比其相应的mRNA RT-PCR扩增片段大70bp，分别为244bp和174bp。利用这一特性可鉴定RT-PCR产物是否由其被转移基因表达之mRNA扩增而产生。分析该转基因小鼠的被转移基因遗传频率表明，似乎CML更易遗传于雌性个体，提示在人类这类疾病发生的性别差异也是值得研究的课题。

    CML的发生与发展主要由于p210(bcr-abl)蛋白质的强酪氨酸激酶活性使其自身及其他信号转导分子磷酸化而异常激活Ras信号转导途径，并相对抑制其他相关的正常信号转导途径，从而阻碍细胞分化和凋亡，导致细胞无限制生长^[1]。在以化疗药物杀伤恶变细胞或抑制其增殖的同时，采用多水平作用的细胞因子重新活化其正常的信号转导途径，促进干细胞及祖细胞以其正常途径增殖和分化，以纠正CML的恶性表型，这是目前正在尝试的CML联合治疗及其机理研究的总趋势^[6～8]。本研究的结果表明，SCF与IL-3联合应用，对造血细胞增殖具较强促进作用，但对恶变及非恶变的造血干细胞或祖细胞的增殖、分化的调控无明显特异性。拆除生长因子及加入5-Fu或Hu培养其骨髓细胞，均明显抑制细胞增殖及/或集落形成和bcr-abl基因表达。这些研究结果进一步证实了CML细胞具有明显的生存优势、抗药性及生长因子依赖性等特性。提示联合应用某些化疗药物及细胞因子治疗CML、在抑制bcr-abl基因表达、减少p210蛋白质产生的同时，能保护其正常造血干细胞或祖细胞增殖与分化。

    除骨髓移植、药物及细胞因子治疗CML外，CML的基因治疗研究也已起步^[9]，但其临床普及应用则尚需时日，且费用甚高；骨髓移植虽是一种治疗CML的有效手段，但受供体骨髓来源限制，且操作难度较大；单纯高剂量化疗则呈现较多且严重的毒、副作用。所以联合使用化疗药物与细胞因子治疗CML的策略具有极好的应用前景。

    ①国家自然科学基金资助项目(39570805)

    中国图书分类号 R733.7

    参考文献

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    [3]Martinelli G, Testoni N, Zuffa E, et al. FLANG (fludarabine+cytosine arabinoside+novantrone+G-CSF) induces partial remission in lymphoid blast transformation of Ph⁺ chronic myelogenous leukemia. Leuk Lymphoma, 1996,22(1-2):173-176

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    收稿日期：1998-08-25

    百拇医药网 http://www.100md.com/html/analecta/1999/02/01/13/956.htm