喉乳头状瘤p53过度表达及与HPV的关系
作者：王军 王植平 张勇
单位：王军(首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉-头颈外科 邮政编码100730)；王植平(病理科) 张勇(病理科)
关键词：乳头状瘤；喉乳头状瘤病毒；p53基因；杂交
摘 要摘 要：为探讨成人型喉乳头状瘤p53基因表达和HPV 16/18感染之间的关系，利用免疫组化及原位杂交技术，对32例成人喉乳头状瘤标本进行了p53和HPV检测。结果显示：p53和HPV 16/18的阳性表达率分别为53.1%和62.5%。在随访中先后有4例发生了恶变。提示p53的过度表达和HPV感染与病变程度和癌变密切相关，二者可以作为一个预测病变转归和预后的重要指标。
Study of the relationship p53 gene mutation and human
, 百拇医药
papillomavirus infection of adult-onset papillomatosis
Wang Jun
(Otolaryngology Head and Neck Surgery, Tongren Hospital, Beijing 100730)
Wang Zhiping
(Otolaryngology Head and Neck Surgery, Tongren Hospital, Beijing 100730)
Zhang Yong
(Otolaryngology Head and Neck Surgery, Tongren Hospital, Beijing 100730)
, 百拇医药
Abstract：An immunohichemical analysis and in situ hybridization were done in order to investigate the overexpression of p53 protein and human papillomavirus 16/18 type (HPV 16/18) infection in 32 cases of adult-onset papillomatosis (AOP). The possible relationship between the overexpress of p53 protein and human papillomavirus 16/18 type infection in the lesions were examined. The results showed over expression of p53 gene was found in 53.1% (17/32) samples of laryngeal papilloma, and 62.5% (18/32) samples were positive for HPV 16/18. There were 4 cases having malignant change during the course of follow-up. It suggests over expression of p53 gene and HPV infection are closely related to severity of the lesion and the malignant change. The p53 immunohistochemical determination is well corretated with HPV detection and both could have prognostic value in these tumours.
, 百拇医药
Key words：Papilloma Papilloma virus p53 gene Hybridization▲
成人型喉乳头状瘤是喉部常见的良性肿瘤，已经证实可以发生癌变，癌变率多在10%～30%之间。野生型p53基因具有控制细胞增殖、抑制细胞转化、阻止癌变过程的作用，但它可通过突变、丢失、重排等形成失活，使p53功能丧失。当正常细胞受到病毒或其他致癌物作用时，DNA损伤不能修复，遗传不稳定，突变积累重排加快，促使其发生恶变[1]。
资料与方法
一、资料
选自我院病理科1991年5月～1994年6月收集的成人喉乳头状瘤标本32例。年龄41～80岁。男性14例，女性18例，平均56.4岁。所有标本用10%福尔马林固定后常规石蜡包埋，制成切片，4μm切片用于常规HE染色和免疫组化检测，3μm切片用于原位杂交检测。
, http://www.100md.com
二、方法
1.p53蛋白免疫组化(ABC)染色法及结果判定：鼠抗人p53单抗为北京中山生物技术公司产品，用时按1∶200稀释。ABC试剂盒及二抗、三抗为VECTOR公司产品。标本切片经脱蜡脱水，常规ABC方法染色；DAB显色，甲基绿复染；树脂封片，光镜观察。用已知p53高表达喉癌切片作阳性对照；空白对照为不加一抗，无阳性信号；阴性对照用已知无p53表达的声带息肉切片。
结果判定：每例随机观察10个高倍镜下视野，每个视野计数100个细胞中阳性细胞数(p53细胞核内有棕黄色颗粒)，取其平均值分为四级：Ⅰ：p53<10%；Ⅱ：p53 10%～30%；Ⅲ：p53 31%～70%；Ⅳ：p53>70%；核内无棕黄色颗粒。
2.ISH检测HPV及结果判断：基因探针为地高辛标记的HPV 16/18混合型。组织片预处理，二甲苯脱蜡，乙醇梯度下行水化；常规蛋白酶K消化、洗涤、乙醇梯度上行脱水、室温干燥组织切片；滴加探针混合液(含有HPV 16/18探针)，20μl/张，置于50%甲酰胺湿盒中，96℃～98℃ 10分钟进行预杂交；然后将湿盒置于凉水中(约15℃)，10分钟后将湿盒置于38℃湿箱中杂交过夜；次日滴加抗体复合物，伊红染色，二甲苯透明，树脂胶封片。已知HPV 16/18型阳性高表达宫颈癌切片作阳性对照，不滴加探针标本作空白对照。结果判定：HPV感染阳性细胞表现为核内显示紫蓝色颗粒。
, 百拇医药
结果
一、临床及病理资料分析
共搜集石蜡标本32例，男性14例，女性18例，男女之比为1∶1.3。年龄41～80岁，平均56.4岁。在32例标本中，轻、中、重度非典型增生分别为8、14、10例。据统计，共有4例重度非典型增生病变先后发生了恶变，占12.5%。
二、p53蛋白检测结果
在喉乳头状瘤32例标本中，p53阳性表达率为53.1%(17/32)，Ⅰ、Ⅱ级表达有10例，占58.82%，Ⅲ、Ⅳ级表达有7例，占41.18%。其中轻、中、重度非典型增生p53阳性表达率分别为37.5%(3/8)、50.0%(7/14)、70.0%(7/10)。经统计学检验，重度非典型增生与轻、中度非典型增生有显著性差异(P<0.05)。
三、HPV感染检测结果
, 百拇医药
利用原位杂交方法，对32例喉乳头状瘤进行了检测，HPV 16/18的阳性表达率为62.5%(18/32)。
讨论
一、喉乳头状瘤p53过度表达
目前人们对于喉癌的研究已进入分子水平，正常细胞的增殖主要取决于促进生长的原癌基因和抑制生长的肿瘤抑制基因的平衡调节，原癌基因的激活或肿瘤抑制基因的失活都可导致细胞生长的失控，引起正常细胞发生癌变。p53是目前所知的一种重要的细胞生长调控因子，它通过参与细胞周期的调控，对细胞的分裂和增殖发挥负调节作用，与细胞分化及基因的稳定性有关[2]。
p53基因作为抗癌基因，作用方式不同于致癌基因，致癌基因以功能激活的方式致癌，而抗癌基因则以功能失活的方式参与致癌过程。目前至少发现五种机制可使p53蛋白的功能失活：①p53蛋白的一个或两个等位基因缺失和微小的局部缺损。②p53蛋白的编码氨基酸突变。③与人类乳头状瘤病毒E6蛋白的结合而失活。E6蛋白具有结合p53蛋白的特异位点，能和p53形成复合物而使其失活。④与抗癌基因mdm2产物p90蛋白形成复合物而失活。⑤从细胞核中被排至胞浆而失活。
, 百拇医药
p53基因的功能失活可能是导致肿瘤发生的重要机制之一。在本实验中，喉乳头状瘤p53阳性表达平均为53.1%，其中重度非典型增生病变为70.0%，经统计学检验，轻、中、重度非典型增生有显著性差异(P<0.05)。在喉乳头状瘤切片中发现，p53阳性染色大多位于基底细胞或基底层细胞上方的细胞中，提示基底细胞可能是早期发生细胞恶变的位置。研究中又发现，重度非典型增生p53的表达强度明显较轻、中度非典型增生病变高，这说明p53基因突变在肿瘤的发生中可能起重要作用。通过对病变特点的研究，可对探索细胞恶变的机理提供有益的帮助。
二、p53过度表达和HPV感染在喉乳头状瘤恶变中可能的作用
p53基因的缺失和灭活与喉癌的发生可能有密切的关系。HPV的感染可能起一个协同因子的作用，HPV(主要是HPV16、18)一方面通过自身致癌的潜能协同致癌，另一方面可通过p53蛋白与HPV16、18 E6蛋白结合加速p53蛋白的降解来协同致癌[3]。本实验显示，在喉乳头状瘤中，18例HPV16、18阳性组织中有8例p53过度表达，达44.44%，在喉乳头状瘤恶变的4例中，HPV和p53均阳性，说明HPV和p53两者均阳性患者的癌变可能性比较大。喉癌的发生是一个复杂的过程，对于HPV感染和p53基因突变在喉癌前病变中可能起单独或协同作用的了解，有助于我们进一步认识喉癌的发生机制。
, 百拇医药
三、喉乳头状瘤的恶变与HPV感染的关系
HPV是一类基因组呈双腹状结构的DNA肿瘤病毒，它是荨常疣、扁平疣等人类疣的致病因子，与很多良恶性肿瘤的发生有密切关系，但不同型别的HPV在不同良恶性病变中的表达率有显著性差异，其中HPV6、11型主要与良性病变有关，属“低危险型”，而HPV16、18型则在恶性肿瘤中有较高的表达率，属“高危险型”[4]。HPV可感染人类某些部位的皮肤和粘膜上皮细胞，它往往局限在粘膜一定分化程度的角蛋白内才能增殖，并在基底细胞内长期处于潜伏状态，一些损害可自行发生逆转，一些可以演变成癌[5]。HPV通过病毒基因整合到人体染色体的一定部位可导致细胞发生转化，HPV编码的E6、E7蛋白可以和p53和Rb的产物p53蛋白和Rb蛋白形成复合物并使后者失活，p53蛋白和Rb蛋白失活将导致细胞增生分裂失控[6]。因此HPV所致抑癌基因失活可能在癌变中起重要作用。本实验结果显示，在喉乳头状瘤HPV16/18阳性率为62.5%，其中4例恶变者均为阳性。HPV感染阳性的组织中发现细胞的形态学改变，出现凹空细胞征，说明在喉癌前病变中，尤其是对于HPV16/18有较高表达的喉乳头状瘤有极大的恶变可能，应给予足够的监测。■
, http://www.100md.com
参考文献：
[1]Fukasawa K, Choi T, Kuriyama R, et al. Abnormal centrosome amplification in the absence of p53. Science, 1996, 271:1744.
[2]Lane DP. p53, guardian of the genome. Nature, 1992, 358:15.
[3]Lopez AM, Garcia CT, Lozano RA, et al. Human papillomavirus and p53 oncoprotein in verrucous carrinoma of the larynx. J Laryngoal Otol, 1996,110:742.
[4]Rimell FL, Shoemaker DL, Pou AM, et al. Pediatric respiratory papillomatosis: prognostic role of viral typing and cofactors. Laryngoscope, 1997,107:915.
, http://www.100md.com
[5]Naffsinger A, Writte D, Fenoglio-Preiser CM. The relationship of human papillomawiruses to anorectal neoplasia. Cancer Res, 1992, 70:1276.
[6]Werness BA, Levine AJ, Howley PM. Association of HPV16/18. E6 proteins p53. Science, 1990,248:76.
收稿日期：1998-07-21
修回日期：1998-11-20, 百拇医药
单位：王军(首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉-头颈外科 邮政编码100730)；王植平(病理科) 张勇(病理科)
关键词：乳头状瘤；喉乳头状瘤病毒；p53基因；杂交
摘 要摘 要：为探讨成人型喉乳头状瘤p53基因表达和HPV 16/18感染之间的关系，利用免疫组化及原位杂交技术，对32例成人喉乳头状瘤标本进行了p53和HPV检测。结果显示：p53和HPV 16/18的阳性表达率分别为53.1%和62.5%。在随访中先后有4例发生了恶变。提示p53的过度表达和HPV感染与病变程度和癌变密切相关，二者可以作为一个预测病变转归和预后的重要指标。
Study of the relationship p53 gene mutation and human
, 百拇医药
papillomavirus infection of adult-onset papillomatosis
Wang Jun
(Otolaryngology Head and Neck Surgery, Tongren Hospital, Beijing 100730)
Wang Zhiping
(Otolaryngology Head and Neck Surgery, Tongren Hospital, Beijing 100730)
Zhang Yong
(Otolaryngology Head and Neck Surgery, Tongren Hospital, Beijing 100730)
, 百拇医药
Abstract：An immunohichemical analysis and in situ hybridization were done in order to investigate the overexpression of p53 protein and human papillomavirus 16/18 type (HPV 16/18) infection in 32 cases of adult-onset papillomatosis (AOP). The possible relationship between the overexpress of p53 protein and human papillomavirus 16/18 type infection in the lesions were examined. The results showed over expression of p53 gene was found in 53.1% (17/32) samples of laryngeal papilloma, and 62.5% (18/32) samples were positive for HPV 16/18. There were 4 cases having malignant change during the course of follow-up. It suggests over expression of p53 gene and HPV infection are closely related to severity of the lesion and the malignant change. The p53 immunohistochemical determination is well corretated with HPV detection and both could have prognostic value in these tumours.
, 百拇医药
Key words：Papilloma Papilloma virus p53 gene Hybridization▲
成人型喉乳头状瘤是喉部常见的良性肿瘤，已经证实可以发生癌变，癌变率多在10%～30%之间。野生型p53基因具有控制细胞增殖、抑制细胞转化、阻止癌变过程的作用，但它可通过突变、丢失、重排等形成失活，使p53功能丧失。当正常细胞受到病毒或其他致癌物作用时，DNA损伤不能修复，遗传不稳定，突变积累重排加快，促使其发生恶变[1]。
资料与方法
一、资料
选自我院病理科1991年5月～1994年6月收集的成人喉乳头状瘤标本32例。年龄41～80岁。男性14例，女性18例，平均56.4岁。所有标本用10%福尔马林固定后常规石蜡包埋，制成切片，4μm切片用于常规HE染色和免疫组化检测，3μm切片用于原位杂交检测。
, http://www.100md.com
二、方法
1.p53蛋白免疫组化(ABC)染色法及结果判定：鼠抗人p53单抗为北京中山生物技术公司产品，用时按1∶200稀释。ABC试剂盒及二抗、三抗为VECTOR公司产品。标本切片经脱蜡脱水，常规ABC方法染色；DAB显色，甲基绿复染；树脂封片，光镜观察。用已知p53高表达喉癌切片作阳性对照；空白对照为不加一抗，无阳性信号；阴性对照用已知无p53表达的声带息肉切片。
结果判定：每例随机观察10个高倍镜下视野，每个视野计数100个细胞中阳性细胞数(p53细胞核内有棕黄色颗粒)，取其平均值分为四级：Ⅰ：p53<10%；Ⅱ：p53 10%～30%；Ⅲ：p53 31%～70%；Ⅳ：p53>70%；核内无棕黄色颗粒。
2.ISH检测HPV及结果判断：基因探针为地高辛标记的HPV 16/18混合型。组织片预处理，二甲苯脱蜡，乙醇梯度下行水化；常规蛋白酶K消化、洗涤、乙醇梯度上行脱水、室温干燥组织切片；滴加探针混合液(含有HPV 16/18探针)，20μl/张，置于50%甲酰胺湿盒中，96℃～98℃ 10分钟进行预杂交；然后将湿盒置于凉水中(约15℃)，10分钟后将湿盒置于38℃湿箱中杂交过夜；次日滴加抗体复合物，伊红染色，二甲苯透明，树脂胶封片。已知HPV 16/18型阳性高表达宫颈癌切片作阳性对照，不滴加探针标本作空白对照。结果判定：HPV感染阳性细胞表现为核内显示紫蓝色颗粒。
, 百拇医药
结果
一、临床及病理资料分析
共搜集石蜡标本32例，男性14例，女性18例，男女之比为1∶1.3。年龄41～80岁，平均56.4岁。在32例标本中，轻、中、重度非典型增生分别为8、14、10例。据统计，共有4例重度非典型增生病变先后发生了恶变，占12.5%。
二、p53蛋白检测结果
在喉乳头状瘤32例标本中，p53阳性表达率为53.1%(17/32)，Ⅰ、Ⅱ级表达有10例，占58.82%，Ⅲ、Ⅳ级表达有7例，占41.18%。其中轻、中、重度非典型增生p53阳性表达率分别为37.5%(3/8)、50.0%(7/14)、70.0%(7/10)。经统计学检验，重度非典型增生与轻、中度非典型增生有显著性差异(P<0.05)。
三、HPV感染检测结果
, 百拇医药
利用原位杂交方法，对32例喉乳头状瘤进行了检测，HPV 16/18的阳性表达率为62.5%(18/32)。
讨论
一、喉乳头状瘤p53过度表达
目前人们对于喉癌的研究已进入分子水平，正常细胞的增殖主要取决于促进生长的原癌基因和抑制生长的肿瘤抑制基因的平衡调节，原癌基因的激活或肿瘤抑制基因的失活都可导致细胞生长的失控，引起正常细胞发生癌变。p53是目前所知的一种重要的细胞生长调控因子，它通过参与细胞周期的调控，对细胞的分裂和增殖发挥负调节作用，与细胞分化及基因的稳定性有关[2]。
p53基因作为抗癌基因，作用方式不同于致癌基因，致癌基因以功能激活的方式致癌，而抗癌基因则以功能失活的方式参与致癌过程。目前至少发现五种机制可使p53蛋白的功能失活：①p53蛋白的一个或两个等位基因缺失和微小的局部缺损。②p53蛋白的编码氨基酸突变。③与人类乳头状瘤病毒E6蛋白的结合而失活。E6蛋白具有结合p53蛋白的特异位点，能和p53形成复合物而使其失活。④与抗癌基因mdm2产物p90蛋白形成复合物而失活。⑤从细胞核中被排至胞浆而失活。
, 百拇医药
p53基因的功能失活可能是导致肿瘤发生的重要机制之一。在本实验中，喉乳头状瘤p53阳性表达平均为53.1%，其中重度非典型增生病变为70.0%，经统计学检验，轻、中、重度非典型增生有显著性差异(P<0.05)。在喉乳头状瘤切片中发现，p53阳性染色大多位于基底细胞或基底层细胞上方的细胞中，提示基底细胞可能是早期发生细胞恶变的位置。研究中又发现，重度非典型增生p53的表达强度明显较轻、中度非典型增生病变高，这说明p53基因突变在肿瘤的发生中可能起重要作用。通过对病变特点的研究，可对探索细胞恶变的机理提供有益的帮助。
二、p53过度表达和HPV感染在喉乳头状瘤恶变中可能的作用
p53基因的缺失和灭活与喉癌的发生可能有密切的关系。HPV的感染可能起一个协同因子的作用，HPV(主要是HPV16、18)一方面通过自身致癌的潜能协同致癌，另一方面可通过p53蛋白与HPV16、18 E6蛋白结合加速p53蛋白的降解来协同致癌[3]。本实验显示，在喉乳头状瘤中，18例HPV16、18阳性组织中有8例p53过度表达，达44.44%，在喉乳头状瘤恶变的4例中，HPV和p53均阳性，说明HPV和p53两者均阳性患者的癌变可能性比较大。喉癌的发生是一个复杂的过程，对于HPV感染和p53基因突变在喉癌前病变中可能起单独或协同作用的了解，有助于我们进一步认识喉癌的发生机制。
, 百拇医药
三、喉乳头状瘤的恶变与HPV感染的关系
HPV是一类基因组呈双腹状结构的DNA肿瘤病毒，它是荨常疣、扁平疣等人类疣的致病因子，与很多良恶性肿瘤的发生有密切关系，但不同型别的HPV在不同良恶性病变中的表达率有显著性差异，其中HPV6、11型主要与良性病变有关，属“低危险型”，而HPV16、18型则在恶性肿瘤中有较高的表达率，属“高危险型”[4]。HPV可感染人类某些部位的皮肤和粘膜上皮细胞，它往往局限在粘膜一定分化程度的角蛋白内才能增殖，并在基底细胞内长期处于潜伏状态，一些损害可自行发生逆转，一些可以演变成癌[5]。HPV通过病毒基因整合到人体染色体的一定部位可导致细胞发生转化，HPV编码的E6、E7蛋白可以和p53和Rb的产物p53蛋白和Rb蛋白形成复合物并使后者失活，p53蛋白和Rb蛋白失活将导致细胞增生分裂失控[6]。因此HPV所致抑癌基因失活可能在癌变中起重要作用。本实验结果显示，在喉乳头状瘤HPV16/18阳性率为62.5%，其中4例恶变者均为阳性。HPV感染阳性的组织中发现细胞的形态学改变，出现凹空细胞征，说明在喉癌前病变中，尤其是对于HPV16/18有较高表达的喉乳头状瘤有极大的恶变可能，应给予足够的监测。■
, http://www.100md.com
参考文献：
[1]Fukasawa K, Choi T, Kuriyama R, et al. Abnormal centrosome amplification in the absence of p53. Science, 1996, 271:1744.
[2]Lane DP. p53, guardian of the genome. Nature, 1992, 358:15.
[3]Lopez AM, Garcia CT, Lozano RA, et al. Human papillomavirus and p53 oncoprotein in verrucous carrinoma of the larynx. J Laryngoal Otol, 1996,110:742.
[4]Rimell FL, Shoemaker DL, Pou AM, et al. Pediatric respiratory papillomatosis: prognostic role of viral typing and cofactors. Laryngoscope, 1997,107:915.
, http://www.100md.com
[5]Naffsinger A, Writte D, Fenoglio-Preiser CM. The relationship of human papillomawiruses to anorectal neoplasia. Cancer Res, 1992, 70:1276.
[6]Werness BA, Levine AJ, Howley PM. Association of HPV16/18. E6 proteins p53. Science, 1990,248:76.
收稿日期：1998-07-21
修回日期：1998-11-20, 百拇医药