细胞遗传学和PT-PCR对APC诊断的临床意义
作者：仇惠英 王阳 王玮 孙爱宁 薛永权 夏学鸣 陈子兴
单位：苏州医学院附属第一医院、江苏省血液研究所
关键词：早幼粒细胞白血病，急性；细胞遗传学；RT-PCR
临床血液学杂志990202
摘要 目的：探讨细胞遗传学及RT-PCR检测对APL诊断的临床意义。方法：直接法或24 h培养法处理骨髓标本，采用R带或G带 方法显带检测t(15；17)易位，RT-PCR检测PML-RARa融合基因。结果： 形态诊断M355例，3例疑诊M3或M2；染色体检测50例发现t(15；17)，敏感率90.91 %，3例形态不能肯定诊断者染色体发现t(15；17)，诊断为M3v型；有t(15；17)易位者 均检测到PML-RARa融合基因，3例无t(15；17)易位者，RML-RARa检测阳性。3例误诊者均 经染色体及融合基因检测排除。结论：细胞遗传学t(15；17)及融合基因R ML-RARa检测是诊断APL的可靠指标，RT-PCR融合基因检测更为敏感。
, 百拇医药
The Clinical Significance of Cytogenetics and RT-PCR in the Diagnosis of Acute Promyelocyte Leukemia
Qiu Huiying,Wang Yang,Wang Wei,et al
The First Hospital of Suzhou Medical College,Suzhou,215006
Abstract Objective:With to investigate the clinical significance of cytogenetics and PT-PCR in the diagnosis of APL.Method s:With K and Q bindring tedhigue translocation t(15;17) and PT-PCR det ect PML-PARa fusion gene.Results: 58 patients were primary di agnosed as APL based on morphologic feature,50 patients (90.91%) were found to have t(15;17) and 3 cases morphological suspected APL were confirmed as M3v a ccording to cytogenetics.The patients with t(15;17) have all detected PML-RARa fusion gene,3 patients with not(15;17) were found PML-RARa,3 cases were morphol ogical misdiagnosed.Conclusio:Cytogenetics and RT-PCR detecti on of t(15;17) (q22,q12) and PML-RARa fusion gene were reliable evidences RT-P CR method is more sensitive than other methods.
, 百拇医药
Key words Acute promyelocyte leukemia Cytogenetics RT-PCR
急性早幼粒细胞性白血病(APL)是一种特殊类型的急性白血病 ，临床上易并发弥漫性血管内凝血(DIC)。细胞毒化疗在诱导治疗中死亡率高，全反式维甲 酸(ATRA)的应用，使初诊患者的死亡率明显下降，完全缓解率(CR)显著提高，因此快速、正 确的诊断特别重要。APL具有特殊的形态特征，大部分患者可仅凭形态得到诊断，但仍有部 分患者仅靠形态学难以诊断，故细胞遗传学及分子生物学检测对APL的诊断具有重要的临床 意义。
1 材料和方法
1.1 病例 58例初诊病例，男26例，女32例，年龄19 ～63岁。根据形态学检查确诊或疑诊为APL，参照天津标准和FAB标准，将APL分成M3a、M 3b、M3v三种亚型。
, 百拇医药
1.2 细胞遗传学检查 58例患者治疗前均常规作染色 体检查，标本采自骨髓，直接法或24 h培养法处理标本，采用R带或G带方法显带，根据《国 际人类染色体命名法(ISCN)1991年》命名核型。
1.3 RT-PCR检测 31例患者同期行RT-PCR检测PML- RARa融合基因。方法：①骨髓标本，Ficoll方法分离单个核细胞；②RNA抽提：用异硫氰酸 胍一步法抽提。③RT-PCR检测PML-RARa mRNA。逆转录CDNA反应：取RNA 2 μg、六随机引 物(promega) 100 ng，dH2O调至20 μl，700℃ 10 min预变性，再加入反应体系液(RNA s in 1.25 μl、dNTP 2 μl、dTT 4 μl、dH2O 3.75 μl、MMIV逆转录酶1 μl、 5 xbuffer 8 μl)，反应条件 370℃、45 min。筑巢式PCR反应：根据文献〔1〕修改 而成。PCR反应在两个体系中进行，第1体系检测L型，第2体系检测S型。反应体积100 μl， 包括逆转录反应产物10 μl，寡核苷酸引物各150 pmol，dNTP浓度各为200 mmol/L、10 mmo l/L，pH 8.4，MgCl2 1.5 mmol/L，BSA 20 mg/L，KCl 50 mmol/L,Taq多聚酶2 .5 U(Sangon)。扩增条件：变性，940℃，45 s；退火，550℃，1 min：延伸，720℃，90 s，每一轮反应为30周期，但第1周期变性条件为950℃，5 min，而在最后1周期延伸时间增 至720℃，10 min。第2轮反应的模板为第1轮反应的产物(10 μl)，更换引物，其余同第1轮 PCR反应。每次实验均做阴、阳性对照及空白对照。阳性对照为NB4细胞。所有标本均用β- actin做内对照，产物为304 bp。④PCR产物分析：取10 μl PCR产物，在1.5%琼脂糖凝 胶中进行电泳，用溴乙淀(1 μg/μl)染色，照相。
, 百拇医药
1.4 治疗 ATRA40～60 mg/d，连续使用，30 d后复查 骨髓象，治疗效果不佳者，改用联合化疗。
2 结果
2.1 形态学诊断 APL 55例，其中M3a 40例，M3 b 15例，3例形态学不能肯定诊断，疑为M2或M3v型。
2.2 细胞遗传学检查 58例中54例有克隆性染色体异 常，占93.10% t(15；17)易位50例，其中异常(AA)型21例，正常与异常嵌合(AN)型29例 。50例中3例合并其它异常，分别为i(17 q-)、75～92，xxyy、+mar 8例无t(15；17)易位 的实验室检查情况见附表，其中5例最终诊断为M3型，且临床上均经过ATRA诱导治疗达到 完全缓解，1例形态诊断M3型，染色体发现t(8；12)，提示M2型，故单靠染色体诊断的 敏感率为90.91%(50/55)。3例形态不能肯定诊断者，染色体均发现t(15；17)易位，确 诊为M3m型。
, 百拇医药
附表 8例无t(15；17)易位患者的实验室检查情 况 病例号
形态学
染色体
PML-R ARa
最终诊断
1
M3b
46xy
ND
M3b
2
M3a
, 百拇医药
t(2;13)
L型
M3a
3
M3a
46xx
AML1/ETO
M2
4
M3a
4q+
S型
, 百拇医药
M3a
5
M3b
45,-2,-7
(-)
M2
6
M3a
46xy
ND
M3a
7
, 百拇医药
M3a
46xy
L型
M3a
8
M3a
t(8;21)
AML1/ETO
M2
ND：未检测
2.3 融合基因检测 31例同期进行了RT-PCR对PML-R ARa融合基因的检测，具有t(15；17)易位的患者均检测到PML-RARa融合基因，其中L型19例 ，S型9例。由表所见，8例无t(15；17)易位者，6例行RT-PCR检测，其中3例检测到PML-RA Ra，临床用ATRA诱导治疗CR；例5 PML-RARa(-)，经ATRA治疗37 d未缓解，改用联合化疗CR ；例3例8形态具有大量的胞浆颗粒，诊断为M3，但染色体检测为t(8；21)易位及46xx,RT -PCR同样未检测到PML-RARa融合基因，但均检测到AML 1/ETO融合基因，最后诊断为M2 。综合形态、细胞遗传学、RT-PCR结果55例最终确诊为M3。
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2.4 治疗结果 55例APL患者经ATRA治疗49例达完全缓 解，平均缓解时间38 d，6例在治疗中因弥散性血管内凝血，颅内出血早期死亡。
3 讨论
急性早幼粒细胞性白血病具有特异的染色体易位t(15；17)(q22 q12)，累及15号 染色体上的早幼粒细胞性白血病(PML)基因和17号染色体上的维甲酸受体(RARa)基因，产生P ML-RARa融合基因〔2〕，仅极少数APL具有变异性的t(11；17)易位导致PLZF-RARa 融合基因及t(5；17)易位导致NPM-RARa融合基因的存在〔3，4〕。
形态学检查是诊断APL的基础。形态特征为含有大量颗粒的异常早幼粒细胞，核畸形，易见 核仁，Auer小体，POX强阳性，根据胞浆颗粒的形态粗颗粒、细颗粒、灰尘样颗粒分为M3a 、M3b、M3v三种亚型，其中M3v型胞浆颗粒常需在电镜下观察，光镜下难以确诊。本 组形态确诊52例，3例M3v型染色体确诊，3例形态学误诊，形态学检查的确诊率为89.6 6%(52/58)。
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t(15；17)是APL的特异性标志，但由于受细胞分裂相及标本量的影响，并非所有的APL患者 均能检出t(15；17)，约90%的APL可见t(15；17)。本文55例中50例(90.91%)患者骨髓单 个核细胞经Q带或R显带检出t(15；17)。对于M3v型单靠形态特征难以诊断，缺乏典型的异 常早幼粒细胞，胞浆颗粒如灰尘样，常需电镜下观察，易误诊为M2、M4、M5型，如能 检测到t(15；17)具有决定性意义。本组3例M3v型均经染色体而得到确诊。3例形态误诊的 病例，染色体均未检测到t(15；17)，因此染色体检测到t(15；17)易位对APL诊断为一可靠 的客观佐证。
PML-RARa基因系t(15；17)染色体易位所致，根据PML断裂位点的不同可分为长(L)、短(S) 型两类，L、S型与预后相关，L型患者缓解期及生存期比S型长〔5〕。由于PML-RARa 融合基因只存在于APL中，因此PML-RARa检测对APL的诊断具有重要意义，而且还可以用于 预后判断及微小残留病灶的检测。王阳等〔6〕用RT-PCR检测10例长存期77～107个 月的APL患者，均未检测到PML-RARa融合基因。本组具有t(15；17)易位者均检测到PML-RA Ra融合基因，6例无t(15；17)易位者3例检测到PML-RARa融合基因，而且临床ATRA治疗有效 ，排除了PML-RARa融合基因检测假阳性的可能。因此，PML-RARa融合基因检测比染色体检 测的敏感性高，而且不受细胞分裂相的影响，本组敏感度相当于104～105个正常细胞中 可检出1个APL细胞〔6〕。由于RT-PCR对PML-RARa检测的敏感性，对形态及细胞遗 传学不能确定者可提供客观的诊断依据。
, 百拇医药
综上所述，形态学检查是诊断APL的基础，染色体发现t(15；17)易位并同时RT-PCR检测到P ML-RARa融合基因是诊断APL的可靠指标，可提高APL的确诊率并为治疗提供可靠的依据。
邮政编码：苏州，215006
参考文献
[1] Huang W,Sun GL,LiXS,et al.Acute promyelocytic leukemia:clin ical relevance of two major PML-RAR alpha isoforms and detection of minimal res idual disease by retro transcriptase/polymerase chain rection to predict relapse .Blood,1993,82:1264-1269
, 百拇医药
[2] De TH,Lavan C,MarchioA.The PML-RAR alpha fusion mRNA generated b the t(15;17 ) translocation in acute promyelocytic leukemia encodes a functionally altered R AR.Cell,1991,66:675-684
[3] Licht JD,Chomienne C,Goy A,et al.Clinical and moecular characterization of a rare syndrome of acute promyelocytic leukemia associated with translocation (11; 17).Blood,1995,85:1083-1094
[4] Redner PL,Corey SJ,Rush EA.Differentiation of t(15；17) variant acute promyel ocytic leukemia blasts by all-trans retinoic acid.Leukemia,1997,11:1014-1016
, 百拇医药
[5] Vahdat L,Maslak P,Miller WH Jr,et al.Early mortality and the retinoic acid sy ndrome in acute promyelocytic leukemia:Impact of leukocytosis,low dose chenother apy;PML/RARa isoform,and CD13 expression in patients treated with all-tra ns retinoic acid.Blood,1994,84(11):3843-3849
[6] 王阳，夏学鸣，薛永权，等.长期生存急性早幼粒细胞白血病患者微小残留病变的测定. 中华内科杂志，1998，37(1)：30-32
(1998-08-21 收稿 1998-10-29 修回), http://www.100md.com
单位：苏州医学院附属第一医院、江苏省血液研究所
关键词：早幼粒细胞白血病，急性；细胞遗传学；RT-PCR
临床血液学杂志990202
摘要 目的：探讨细胞遗传学及RT-PCR检测对APL诊断的临床意义。方法：直接法或24 h培养法处理骨髓标本，采用R带或G带 方法显带检测t(15；17)易位，RT-PCR检测PML-RARa融合基因。结果： 形态诊断M355例，3例疑诊M3或M2；染色体检测50例发现t(15；17)，敏感率90.91 %，3例形态不能肯定诊断者染色体发现t(15；17)，诊断为M3v型；有t(15；17)易位者 均检测到PML-RARa融合基因，3例无t(15；17)易位者，RML-RARa检测阳性。3例误诊者均 经染色体及融合基因检测排除。结论：细胞遗传学t(15；17)及融合基因R ML-RARa检测是诊断APL的可靠指标，RT-PCR融合基因检测更为敏感。
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The Clinical Significance of Cytogenetics and RT-PCR in the Diagnosis of Acute Promyelocyte Leukemia
Qiu Huiying,Wang Yang,Wang Wei,et al
The First Hospital of Suzhou Medical College,Suzhou,215006
Abstract Objective:With to investigate the clinical significance of cytogenetics and PT-PCR in the diagnosis of APL.Method s:With K and Q bindring tedhigue translocation t(15;17) and PT-PCR det ect PML-PARa fusion gene.Results: 58 patients were primary di agnosed as APL based on morphologic feature,50 patients (90.91%) were found to have t(15;17) and 3 cases morphological suspected APL were confirmed as M3v a ccording to cytogenetics.The patients with t(15;17) have all detected PML-RARa fusion gene,3 patients with not(15;17) were found PML-RARa,3 cases were morphol ogical misdiagnosed.Conclusio:Cytogenetics and RT-PCR detecti on of t(15;17) (q22,q12) and PML-RARa fusion gene were reliable evidences RT-P CR method is more sensitive than other methods.
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Key words Acute promyelocyte leukemia Cytogenetics RT-PCR
急性早幼粒细胞性白血病(APL)是一种特殊类型的急性白血病 ，临床上易并发弥漫性血管内凝血(DIC)。细胞毒化疗在诱导治疗中死亡率高，全反式维甲 酸(ATRA)的应用，使初诊患者的死亡率明显下降，完全缓解率(CR)显著提高，因此快速、正 确的诊断特别重要。APL具有特殊的形态特征，大部分患者可仅凭形态得到诊断，但仍有部 分患者仅靠形态学难以诊断，故细胞遗传学及分子生物学检测对APL的诊断具有重要的临床 意义。
1 材料和方法
1.1 病例 58例初诊病例，男26例，女32例，年龄19 ～63岁。根据形态学检查确诊或疑诊为APL，参照天津标准和FAB标准，将APL分成M3a、M 3b、M3v三种亚型。
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1.2 细胞遗传学检查 58例患者治疗前均常规作染色 体检查，标本采自骨髓，直接法或24 h培养法处理标本，采用R带或G带方法显带，根据《国 际人类染色体命名法(ISCN)1991年》命名核型。
1.3 RT-PCR检测 31例患者同期行RT-PCR检测PML- RARa融合基因。方法：①骨髓标本，Ficoll方法分离单个核细胞；②RNA抽提：用异硫氰酸 胍一步法抽提。③RT-PCR检测PML-RARa mRNA。逆转录CDNA反应：取RNA 2 μg、六随机引 物(promega) 100 ng，dH2O调至20 μl，700℃ 10 min预变性，再加入反应体系液(RNA s in 1.25 μl、dNTP 2 μl、dTT 4 μl、dH2O 3.75 μl、MMIV逆转录酶1 μl、 5 xbuffer 8 μl)，反应条件 370℃、45 min。筑巢式PCR反应：根据文献〔1〕修改 而成。PCR反应在两个体系中进行，第1体系检测L型，第2体系检测S型。反应体积100 μl， 包括逆转录反应产物10 μl，寡核苷酸引物各150 pmol，dNTP浓度各为200 mmol/L、10 mmo l/L，pH 8.4，MgCl2 1.5 mmol/L，BSA 20 mg/L，KCl 50 mmol/L,Taq多聚酶2 .5 U(Sangon)。扩增条件：变性，940℃，45 s；退火，550℃，1 min：延伸，720℃，90 s，每一轮反应为30周期，但第1周期变性条件为950℃，5 min，而在最后1周期延伸时间增 至720℃，10 min。第2轮反应的模板为第1轮反应的产物(10 μl)，更换引物，其余同第1轮 PCR反应。每次实验均做阴、阳性对照及空白对照。阳性对照为NB4细胞。所有标本均用β- actin做内对照，产物为304 bp。④PCR产物分析：取10 μl PCR产物，在1.5%琼脂糖凝 胶中进行电泳，用溴乙淀(1 μg/μl)染色，照相。
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1.4 治疗 ATRA40～60 mg/d，连续使用，30 d后复查 骨髓象，治疗效果不佳者，改用联合化疗。
2 结果
2.1 形态学诊断 APL 55例，其中M3a 40例，M3 b 15例，3例形态学不能肯定诊断，疑为M2或M3v型。
2.2 细胞遗传学检查 58例中54例有克隆性染色体异 常，占93.10% t(15；17)易位50例，其中异常(AA)型21例，正常与异常嵌合(AN)型29例 。50例中3例合并其它异常，分别为i(17 q-)、75～92，xxyy、+mar 8例无t(15；17)易位 的实验室检查情况见附表，其中5例最终诊断为M3型，且临床上均经过ATRA诱导治疗达到 完全缓解，1例形态诊断M3型，染色体发现t(8；12)，提示M2型，故单靠染色体诊断的 敏感率为90.91%(50/55)。3例形态不能肯定诊断者，染色体均发现t(15；17)易位，确 诊为M3m型。
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附表 8例无t(15；17)易位患者的实验室检查情 况 病例号
形态学
染色体
PML-R ARa
最终诊断
1
M3b
46xy
ND
M3b
2
M3a
, 百拇医药
t(2;13)
L型
M3a
3
M3a
46xx
AML1/ETO
M2
4
M3a
4q+
S型
, 百拇医药
M3a
5
M3b
45,-2,-7
(-)
M2
6
M3a
46xy
ND
M3a
7
, 百拇医药
M3a
46xy
L型
M3a
8
M3a
t(8;21)
AML1/ETO
M2
ND：未检测
2.3 融合基因检测 31例同期进行了RT-PCR对PML-R ARa融合基因的检测，具有t(15；17)易位的患者均检测到PML-RARa融合基因，其中L型19例 ，S型9例。由表所见，8例无t(15；17)易位者，6例行RT-PCR检测，其中3例检测到PML-RA Ra，临床用ATRA诱导治疗CR；例5 PML-RARa(-)，经ATRA治疗37 d未缓解，改用联合化疗CR ；例3例8形态具有大量的胞浆颗粒，诊断为M3，但染色体检测为t(8；21)易位及46xx,RT -PCR同样未检测到PML-RARa融合基因，但均检测到AML 1/ETO融合基因，最后诊断为M2 。综合形态、细胞遗传学、RT-PCR结果55例最终确诊为M3。
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2.4 治疗结果 55例APL患者经ATRA治疗49例达完全缓 解，平均缓解时间38 d，6例在治疗中因弥散性血管内凝血，颅内出血早期死亡。
3 讨论
急性早幼粒细胞性白血病具有特异的染色体易位t(15；17)(q22 q12)，累及15号 染色体上的早幼粒细胞性白血病(PML)基因和17号染色体上的维甲酸受体(RARa)基因，产生P ML-RARa融合基因〔2〕，仅极少数APL具有变异性的t(11；17)易位导致PLZF-RARa 融合基因及t(5；17)易位导致NPM-RARa融合基因的存在〔3，4〕。
形态学检查是诊断APL的基础。形态特征为含有大量颗粒的异常早幼粒细胞，核畸形，易见 核仁，Auer小体，POX强阳性，根据胞浆颗粒的形态粗颗粒、细颗粒、灰尘样颗粒分为M3a 、M3b、M3v三种亚型，其中M3v型胞浆颗粒常需在电镜下观察，光镜下难以确诊。本 组形态确诊52例，3例M3v型染色体确诊，3例形态学误诊，形态学检查的确诊率为89.6 6%(52/58)。
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t(15；17)是APL的特异性标志，但由于受细胞分裂相及标本量的影响，并非所有的APL患者 均能检出t(15；17)，约90%的APL可见t(15；17)。本文55例中50例(90.91%)患者骨髓单 个核细胞经Q带或R显带检出t(15；17)。对于M3v型单靠形态特征难以诊断，缺乏典型的异 常早幼粒细胞，胞浆颗粒如灰尘样，常需电镜下观察，易误诊为M2、M4、M5型，如能 检测到t(15；17)具有决定性意义。本组3例M3v型均经染色体而得到确诊。3例形态误诊的 病例，染色体均未检测到t(15；17)，因此染色体检测到t(15；17)易位对APL诊断为一可靠 的客观佐证。
PML-RARa基因系t(15；17)染色体易位所致，根据PML断裂位点的不同可分为长(L)、短(S) 型两类，L、S型与预后相关，L型患者缓解期及生存期比S型长〔5〕。由于PML-RARa 融合基因只存在于APL中，因此PML-RARa检测对APL的诊断具有重要意义，而且还可以用于 预后判断及微小残留病灶的检测。王阳等〔6〕用RT-PCR检测10例长存期77～107个 月的APL患者，均未检测到PML-RARa融合基因。本组具有t(15；17)易位者均检测到PML-RA Ra融合基因，6例无t(15；17)易位者3例检测到PML-RARa融合基因，而且临床ATRA治疗有效 ，排除了PML-RARa融合基因检测假阳性的可能。因此，PML-RARa融合基因检测比染色体检 测的敏感性高，而且不受细胞分裂相的影响，本组敏感度相当于104～105个正常细胞中 可检出1个APL细胞〔6〕。由于RT-PCR对PML-RARa检测的敏感性，对形态及细胞遗 传学不能确定者可提供客观的诊断依据。
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综上所述，形态学检查是诊断APL的基础，染色体发现t(15；17)易位并同时RT-PCR检测到P ML-RARa融合基因是诊断APL的可靠指标，可提高APL的确诊率并为治疗提供可靠的依据。
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参考文献
[1] Huang W,Sun GL,LiXS,et al.Acute promyelocytic leukemia:clin ical relevance of two major PML-RAR alpha isoforms and detection of minimal res idual disease by retro transcriptase/polymerase chain rection to predict relapse .Blood,1993,82:1264-1269
, 百拇医药
[2] De TH,Lavan C,MarchioA.The PML-RAR alpha fusion mRNA generated b the t(15;17 ) translocation in acute promyelocytic leukemia encodes a functionally altered R AR.Cell,1991,66:675-684
[3] Licht JD,Chomienne C,Goy A,et al.Clinical and moecular characterization of a rare syndrome of acute promyelocytic leukemia associated with translocation (11; 17).Blood,1995,85:1083-1094
[4] Redner PL,Corey SJ,Rush EA.Differentiation of t(15；17) variant acute promyel ocytic leukemia blasts by all-trans retinoic acid.Leukemia,1997,11:1014-1016
, 百拇医药
[5] Vahdat L,Maslak P,Miller WH Jr,et al.Early mortality and the retinoic acid sy ndrome in acute promyelocytic leukemia:Impact of leukocytosis,low dose chenother apy;PML/RARa isoform,and CD13 expression in patients treated with all-tra ns retinoic acid.Blood,1994,84(11):3843-3849
[6] 王阳，夏学鸣，薛永权，等.长期生存急性早幼粒细胞白血病患者微小残留病变的测定. 中华内科杂志，1998，37(1)：30-32
(1998-08-21 收稿 1998-10-29 修回), http://www.100md.com