粮食中黄绿青霉素的高效液相色谱法检测
作者：杨秋慧 周宏博 李群伟
单位：哈尔滨医科大学 大骨节病研究所， 150001
关键词：黄绿青霉素；高效液相色谱
New Page 1 【摘要】 目的 用高效液相色谱(HPLC)检测粮食中黄绿青霉素(citreoviridin,简称CIT)的含量，用于评价粮食受青霉菌污染程度。方法 用CIT纯品污染粮样，再用二氯甲烷提取、过滤，过4cm硅胶柱，用乙酸乙酯∶正己烷(7∶3,V/V)洗脱，60℃氮气吹干，HPLC检测。结果 最低检出量为8ng,线性、重复性良好，回收率较高。结论 文中报告的方法可用于地方病区粮食黄绿青霉素污染水平的检测、评价。
分类号：S432.44 文献标识码：A 论文编号：1000-4955(1999)02-0107—09
Liquid chromatograph method for determination of citreoviridin in cereal
, http://www.100md.com
YANG Qiuhui,ZHOU Hongbo,LI Qunwei
Institute of KBD,Harbin Medical University,Harbin 150001
【Abstract】 Objective To analyze the content of citreoviridin in rice and evaluate the degree of contamination.Methods The rice was contaminated with pure CIT,extract was purified on silica column,citreoviridin was eluted with 15ml acetate-hexane(7:3) into vial and evaporated to dryness under nitrogen at 60℃ and saved for LC analysis.Results The minimum detection limits were 8ng for citreoviridin standard.The method is linear,the repeatability and recovery rate are satisfactory.Conclusions The method can be used to determine the content of CIT and evaluate the degree of cereal contamination in epidemiological studies
, 百拇医药
【Key words】 Citreoviridin HPLC
文献报告克山病患者多有食用霉捂粮食的既往史，病因物质可能与青霉菌污染及其毒素有关[1]。文献报告，青霉菌毒素中有一种毒素citreoviridine toxin(CIT)，对心脏呈现特殊毒性作用，并认为是致心脏型脚气病(cardiac beriberi)的直接原因[2]。关于CIT的检测方法，在我国克山病研究历史上尚未有人涉及。本研究所及作者本人愿意在这方面进行探索，所以着手引进和实施CIT的HPLC法检测。报告如下：
1 材料与方法
正相色谱法检测CIT于1988年提出，但该法用辅助器材多而且昂贵，难以应用[3]。本文采用硅胶柱代替原法的SPE萃取柱，显著降低了费用，并且化简了方法。
, http://www.100md.com 1.1 试剂 二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷为市售分析纯。CIT标准品购自sigma公司。
1.2 仪器 日本岛津HPLC-6A液相色谱仪；SPD-6AV；Uv-VIS检测器和CR-1B数据处理机；硅胶色谱柱(4.6mm×15cm,5μm)。乙酸乙酯∶正己烷(7∶3,V/V)为流动相；流速为1.5
ml/min;检测波长为388nm;分析过程时间10min。
1.3 标准品与样品处理
1.3.1 标准品的制备：将2.0mg CIT溶于10ml乙酸乙酯制成200μg/ml贮存液，用乙酸乙酯：正己烷吸释制成浓度为10μg/ml的标准品，0℃存放。
1.3.2 样品的处理：取市售大米20g(未检出CIT)，加入不同量CIT标准品，再加入50ml的二氯甲烷，康氏振荡器振荡30min，取滤液，过4cm长硅胶柱，用5ml二氯甲烷冲洗，15ml乙酯乙酯∶正己烷(7∶3,V/V)洗脱目标物CIT，收集洗出液，60℃氮气吹干，流动相定容后，取10μl备检。
, 百拇医药
2 结果
2.1 CIT人工污染粮样及空白粮样色谱图 图a为CIT标准品色谱图，浓度为10μg/ml，进样量10μl。图b为空白粮样色谱图，未见CIT检出(0.1μg/10μl)。图c为人工污染粮样CIT色谱图，未见杂峰干扰，分离较好。图d为人工污染粮样与标准品叠加峰。
图1 CIT人工污染粮样及空白粮样色谱图
2.2 线性范围 本方法在0.78～100μg/ml范围内检测CIT，呈线性关系，最小检测限为8ng,绘制标准曲线见图2
, http://www.100md.com
图2 CIT标准曲线
2.3 精密度及重复性 在实验条件下，对CIT标准品进行了日间、日内测定，按测得峰面积计算日内及日间变异系数。日内变异系数小于日间变异系数(表1)。
表1 日内变异与日间变异(100ng/assay)
项目
n
峰面积(A)
s
CV%
日内
日间
4
, http://www.100md.com
5
181291
180602
1482
6759
0.82
3.74
2.4 回收率测定 将一定量的CIT加入粮样中，测定不同毒素浓度的粮食加入回收率(表2)表2 粮食中各浓度CIT加入回收率
CIT浓度(ng/g)
平均回收率(%)
50
, 百拇医药
100
500
71.7±3.3
76.0±8.4
80.8±3.65
以上结果表明，本法具有较好的线性、重复性和较高的回收率，样品处理简单，所需器材价格便宜，一般实验室皆可满足条件，结果重复性好，适用于流行病现场工作大量粮食样本的检测以及实验室培养真菌产毒情况的评价。
3 讨论
真菌毒素与人类疾病的关系日益引起医学界的重视，其中黄曲霉毒素可导致肝癌，T-2毒素是ATA(alimentary toxic aleukia)，和大骨节病的致病因子。
, http://www.100md.com
粮食样品中真菌毒素的检出，时常在提取分离时遇到很大困难，加杂物质太多，不易排除，难以做到如一般无机物那样肯定的定量。本文报告的方法，是在薄层法基础上改进的HPLC法[3]，效果比较好。主要是：①如本文所见几乎没有杂峰干扰，表示溶剂、柱层析、洗脱液的选择适宜。②灵敏度比较高，文献报导阳性样品最低检出量19ng/g,最高5000ng/g，本法最低出量为20ng/g，可充分满足需要。③由于作者对原法的改进，显著降低了检验费用。原方法每个样品44元，本法7元，降低了84%。
地方病研究中对真菌毒素的重视，日渐在同行中普及。既然目标物质是具体的某种毒素，检出法则成为不可逾越的关键步骤。关于克山病病因的诸种假设要通过对目标物质的测定取得突破。
作者简介：杨秋慧，女，1972年生，博士后
参考文献
[1] 杨建伯.克山病流行病学调查总结(1965～1975)—论发霉变质粮食的致病作用[A].中国地方病学杂志，第三届全国地方病学术会议论文集[C]，1995:48～53
, 百拇医药
[2] Ueno Y.Citreoviridin from penicillium citreo-viride biourge,Mycotoxins[M].Amsterdam-Oxford-NewYork,1974,291～300
[3] Stubblefield RD,Greer JI,Shotwell OL.Liquid chromatographic method for determination of citreoviridin in corn and rice[J].J-Assoc-Off-Anal-Chem,1988,71(4):721～724
[4] Poland AE.Mycotoxins in review[J].Food-Addit-Contam,1993,10(1):17～28
收稿日期：1998-10-10, http://www.100md.com
单位：哈尔滨医科大学 大骨节病研究所， 150001
关键词：黄绿青霉素；高效液相色谱
New Page 1 【摘要】 目的 用高效液相色谱(HPLC)检测粮食中黄绿青霉素(citreoviridin,简称CIT)的含量，用于评价粮食受青霉菌污染程度。方法 用CIT纯品污染粮样，再用二氯甲烷提取、过滤，过4cm硅胶柱，用乙酸乙酯∶正己烷(7∶3,V/V)洗脱，60℃氮气吹干，HPLC检测。结果 最低检出量为8ng,线性、重复性良好，回收率较高。结论 文中报告的方法可用于地方病区粮食黄绿青霉素污染水平的检测、评价。
分类号：S432.44 文献标识码：A 论文编号：1000-4955(1999)02-0107—09
Liquid chromatograph method for determination of citreoviridin in cereal
, http://www.100md.com
YANG Qiuhui,ZHOU Hongbo,LI Qunwei
Institute of KBD,Harbin Medical University,Harbin 150001
【Abstract】 Objective To analyze the content of citreoviridin in rice and evaluate the degree of contamination.Methods The rice was contaminated with pure CIT,extract was purified on silica column,citreoviridin was eluted with 15ml acetate-hexane(7:3) into vial and evaporated to dryness under nitrogen at 60℃ and saved for LC analysis.Results The minimum detection limits were 8ng for citreoviridin standard.The method is linear,the repeatability and recovery rate are satisfactory.Conclusions The method can be used to determine the content of CIT and evaluate the degree of cereal contamination in epidemiological studies
, 百拇医药
【Key words】 Citreoviridin HPLC
文献报告克山病患者多有食用霉捂粮食的既往史，病因物质可能与青霉菌污染及其毒素有关[1]。文献报告，青霉菌毒素中有一种毒素citreoviridine toxin(CIT)，对心脏呈现特殊毒性作用，并认为是致心脏型脚气病(cardiac beriberi)的直接原因[2]。关于CIT的检测方法，在我国克山病研究历史上尚未有人涉及。本研究所及作者本人愿意在这方面进行探索，所以着手引进和实施CIT的HPLC法检测。报告如下：
1 材料与方法
正相色谱法检测CIT于1988年提出，但该法用辅助器材多而且昂贵，难以应用[3]。本文采用硅胶柱代替原法的SPE萃取柱，显著降低了费用，并且化简了方法。
, http://www.100md.com 1.1 试剂 二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷为市售分析纯。CIT标准品购自sigma公司。
1.2 仪器 日本岛津HPLC-6A液相色谱仪；SPD-6AV；Uv-VIS检测器和CR-1B数据处理机；硅胶色谱柱(4.6mm×15cm,5μm)。乙酸乙酯∶正己烷(7∶3,V/V)为流动相；流速为1.5
ml/min;检测波长为388nm;分析过程时间10min。
1.3 标准品与样品处理
1.3.1 标准品的制备：将2.0mg CIT溶于10ml乙酸乙酯制成200μg/ml贮存液，用乙酸乙酯：正己烷吸释制成浓度为10μg/ml的标准品，0℃存放。
1.3.2 样品的处理：取市售大米20g(未检出CIT)，加入不同量CIT标准品，再加入50ml的二氯甲烷，康氏振荡器振荡30min，取滤液，过4cm长硅胶柱，用5ml二氯甲烷冲洗，15ml乙酯乙酯∶正己烷(7∶3,V/V)洗脱目标物CIT，收集洗出液，60℃氮气吹干，流动相定容后，取10μl备检。
, 百拇医药
2 结果
2.1 CIT人工污染粮样及空白粮样色谱图 图a为CIT标准品色谱图，浓度为10μg/ml，进样量10μl。图b为空白粮样色谱图，未见CIT检出(0.1μg/10μl)。图c为人工污染粮样CIT色谱图，未见杂峰干扰，分离较好。图d为人工污染粮样与标准品叠加峰。
图1 CIT人工污染粮样及空白粮样色谱图
2.2 线性范围 本方法在0.78～100μg/ml范围内检测CIT，呈线性关系，最小检测限为8ng,绘制标准曲线见图2
, http://www.100md.com
图2 CIT标准曲线
2.3 精密度及重复性 在实验条件下，对CIT标准品进行了日间、日内测定，按测得峰面积计算日内及日间变异系数。日内变异系数小于日间变异系数(表1)。
表1 日内变异与日间变异(100ng/assay)
项目
n
峰面积(A)
s
CV%
日内
日间
4
, http://www.100md.com
5
181291
180602
1482
6759
0.82
3.74
2.4 回收率测定 将一定量的CIT加入粮样中，测定不同毒素浓度的粮食加入回收率(表2)表2 粮食中各浓度CIT加入回收率
CIT浓度(ng/g)
平均回收率(%)
50
, 百拇医药
100
500
71.7±3.3
76.0±8.4
80.8±3.65
以上结果表明，本法具有较好的线性、重复性和较高的回收率，样品处理简单，所需器材价格便宜，一般实验室皆可满足条件，结果重复性好，适用于流行病现场工作大量粮食样本的检测以及实验室培养真菌产毒情况的评价。
3 讨论
真菌毒素与人类疾病的关系日益引起医学界的重视，其中黄曲霉毒素可导致肝癌，T-2毒素是ATA(alimentary toxic aleukia)，和大骨节病的致病因子。
, http://www.100md.com
粮食样品中真菌毒素的检出，时常在提取分离时遇到很大困难，加杂物质太多，不易排除，难以做到如一般无机物那样肯定的定量。本文报告的方法，是在薄层法基础上改进的HPLC法[3]，效果比较好。主要是：①如本文所见几乎没有杂峰干扰，表示溶剂、柱层析、洗脱液的选择适宜。②灵敏度比较高，文献报导阳性样品最低检出量19ng/g,最高5000ng/g，本法最低出量为20ng/g，可充分满足需要。③由于作者对原法的改进，显著降低了检验费用。原方法每个样品44元，本法7元，降低了84%。
地方病研究中对真菌毒素的重视，日渐在同行中普及。既然目标物质是具体的某种毒素，检出法则成为不可逾越的关键步骤。关于克山病病因的诸种假设要通过对目标物质的测定取得突破。
作者简介：杨秋慧，女，1972年生，博士后
参考文献
[1] 杨建伯.克山病流行病学调查总结(1965～1975)—论发霉变质粮食的致病作用[A].中国地方病学杂志，第三届全国地方病学术会议论文集[C]，1995:48～53
, 百拇医药
[2] Ueno Y.Citreoviridin from penicillium citreo-viride biourge,Mycotoxins[M].Amsterdam-Oxford-NewYork,1974,291～300
[3] Stubblefield RD,Greer JI,Shotwell OL.Liquid chromatographic method for determination of citreoviridin in corn and rice[J].J-Assoc-Off-Anal-Chem,1988,71(4):721～724
[4] Poland AE.Mycotoxins in review[J].Food-Addit-Contam,1993,10(1):17～28
收稿日期：1998-10-10, http://www.100md.com