氟中毒大鼠肝细胞凋亡研究
作者：井 玲 邵宗俊 任立群 李广生
单位：白求恩医科大学 地方病研究所， 吉林 长春 130021
关键词：氟中毒；细胞凋亡
中国地方病学杂志990202 【摘要】 目的 研究氟化物对肝细胞凋亡的影响。方法 用偏食饲料、饮水加氟化钠100mg/L或同时加碳酸钙3 200mg/kg饲料喂饲大鼠2个月，用流式细胞术检测肝细胞凋亡小体百分率，同时检测了谷胱苷肽过氧化物酶活性和脂质过氧化物含量。结果 发现氟中毒组大鼠肝细胞凋亡小体百分率较对照组明显升高(P=0.01～0.05)，加钙可使这种改变更为明显(P<0.01)；而GSH-px活性则明显降低。结论 氟化物的毒性可导致肝细胞凋亡，对机体抗氧化能力的降低可能起一定作用。
分类号：R599.9 O246 文献标识码：A 论文编号：1000-4955(1999)02-0084—86
, 百拇医药
Hepatocyte apoptosis in fluorosis rats
JING Ling,SHAO Zongjun,REN Liqun,et al
Institute of Endemic Diseases in Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021
【Abstract】 Objective To study the influence of fluoride and F+Ca on the hepatocyte apoptosis in rats.Methods The hepatocyte apoptosis was investigated by using flow cytometry and the GSH-px activity was measured at the same time.Results The percentage of hepatocyte apoptosis bodies was higher in the group added fluoride (P=0.01～0.05) and much higher in the group added F+Ca (P<0.01) than that of control;the GSH-px activity was reduced in rats fed with F or F+Ca.Conclusions The hepatocyte apoptosis can be induced by fluoride and the change of GSH-px may play an important role in the mechanism of hepatocyte apoptosis.
, 百拇医药
【Key words】 Fluorosis Apoptosis
氟化物对肝脏的毒性作用已有一些报道[1，2]，光镜可见肝细胞索排列紊乱，胞浆结构疏松；电镜下发现肝细胞变形、细胞核膜皱折、固缩，核仁边集等，并发现超氧化物歧化酶可明显阻断上述改变。本文将通过检查氟中毒大鼠肝细胞凋亡及和脂质过氧化之间的关系、加钙后的影响，研究氟化物肝脏毒性的机制。
1 材料和方法
1.1 动物和分组 雄性Wistar大鼠30只，分为三组，对照组大鼠饲偏食饲料，饮自来水；加氟组大鼠饲偏食饲料，饮水加氟化钠100mg/L。氟加钙组大鼠除在偏食饲料中加CaCO3 3200mg/kg饲料外，其余实验条件同加氟组。动物自由进食水，实验周期为2个月。
1.2 自由基代谢检查 颈血管取血，测全血GSH-px活性和血清LPO含量。
, 百拇医药
1.3 流式细胞术检测凋亡小体 颈血管取血后，处死动物，取肝脏约100mg,用毛玻璃研磨制备单细胞悬液，取肝细胞悬液(细胞数为2×106/ml)250μl加入同等体积RNA酶(500μl/ml),37℃消化30min，50μg/ml碘化丙啶(PI)4℃染色1h，FACScan流式细胞仪检测，Cellfit软件收集10 000个细胞，1ysys软件分析数据，记录Ap区亚峰细胞百分率，即为细胞凋亡百分率。并根据DAN含量进行细胞周期分析。
2 结果
2.1 凋亡小体百分率 对照组凋亡小体百分率为33.75±2.83,加氟组为45.92±4.93，加氟加钙组为49.92±15.73，均较对照组有明显差异,分别为P=0.01～0.05,P<0.05(表1)。
表1 各组大鼠肝细胞凋亡小体百分率 组别
凋亡小体百分率(x±s)
, http://www.100md.com
对照组
加氟组
加氟加钙组
33.75±2.83
45.92±4.93*
49.92±15.73**
注：和对照组相比，*P=0.01～0.05;**P<0.01
2.2 细胞周期分析 和对照组相比，加氟组大鼠S期细胞有所增加，G2/M期细胞减少，加氟加钙组除G0/G1期细胞稍有增多外，S期和G2/M期细胞有所增加，差异均未达显著程度。但从趋势上看S期向G2/M期转变过程受到影响，使细胞停滞在S期(表2)。
, 百拇医药
表2 加氟和加氟加钙对肝细胞周期的影响 组别
G0/G1(%)
S(%)
G2/M(%)
对照组
加氟组
加氟加钙组
55.14±15.4
60.43±16.88
50.18±19.79
28.06±7.92
, 百拇医药
50.70±16.43
43.34±24.2
5.70±3.32
4.95±2.21
6.48±4.59
2.3 全血GSH-px和血清LPO活力测定 加氟组和加氟加钙组大鼠GSH-px活性较对照组明显降低，LPO含量无明显差异(表3)。 表3 各组大鼠GSH-px和LPO测定结果 组别
GSH-px(U/ml)
LPO(相对荧光强度)
对照组
加氟组
, 百拇医药
加氟加钙组
4.90±2.30
2.03±1.04**
2.28±1.30**
6.08±1.99
6.07±1.28
6.51±2.13
注：**和对照组相比，P<0.01
3 讨论
肝细胞凋亡很多见，在肝脏的免疫细胞介导的细胞毒作用、化学药物或毒物作用、病毒性疾病及自身免疫性病等病理损害中，细胞凋亡为肝细胞死亡的重要机制。如传染性病毒性肝炎的噬酸性体和碎屑坏死、黄热病的Councilman体是凋亡的肝细胞；酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、肝细胞肝癌、药物性肝损伤和某些抗癌药所致的肝细胞死亡等也大多是细胞凋亡[3,4]。肝细胞凋亡有两个形态变化过程：(1)核染色质凝聚、核和胞浆收缩、细胞表面微绒毛消失并逐渐形成大小不等的由膜包绕的凋亡小体，内含结构完整的细胞器，酸性磷酸酶染色阳性；(2)凋亡小体被周围的实质细胞或Kupffer细胞吞噬，胆管上皮细胞的凋亡小体也可脱落于胆管腔内自溶消失或排除。肝细胞局部不发生炎症反应、继发性组织损伤或诱发组织的再生修复。本研究中加氟组和加氟加钙组大鼠肝脏流式细胞术检查发现凋亡小体百分率较对照组明显升高(P=0.01～0.05,P<0.01)，细胞周期研究结果虽无明显差异,但从趋势上看加氟组大鼠S期细胞增多，而G0/M期细胞减少，说明氟可能影响了S期向G0/M期的转变过程。在我们过去的研究中曾发现钙可明显拮抗氟的肾毒性和骨毒性[5，6]，本研究也预期得出钙可拮抗氟所致的细胞凋亡，但结果相反。细胞浆中钙离子浓度增高激活钙依赖半胱氨酸蛋白酶，破坏细胞骨架等使细胞表面形成泡状突起是细胞凋亡的重要机制之一[7]，本研究结果似乎与此有关。同时探讨了关于氟化物所致细胞凋亡和脂质过氧化之间的关系，发现氟中毒虽然不影响脂质过氧化物的含量,但可使GSH-px活性明显降低，提示机体抗氧化能力的降低和细胞凋亡有一定的关系。关于细胞凋亡和脂质过氧化的关系已有报道[8，9]，但在氟中毒时二者的关系还需要做进一步的研究证明。氟导致细胞凋亡的报道很少，仅有一篇报道在培养骨肉瘤细胞中加入5nM氟化钠，用TUNEL法和凝胶电泳可检出凋亡细胞和梯状图谱核苷酸片段，首次论及了体外实验中氟中毒和细胞凋亡的关系[10]。本研究用流式细胞术证明了氟化物可导致大鼠肝细胞凋亡，提示过量氟在体内的毒性同样和细胞凋亡有关。且所致细胞凋亡在氟中毒肝脏病变中扮演重要角色，加钙虽然可以减轻氟的骨骼毒性，但并不能减轻肝脏细胞凋亡改变；另一方面我们将继续研究氟化物促进肝细胞凋亡的基因调控、生化机制和形态特点等，以探讨利用氟的这种功能使氟化物做为一种抗癌药物的可能性。
, http://www.100md.com
基金来源：国家自然科学基金(39730390)
作者简介：井玲，女，1961年生，副研究员
参考文献
[1] 边晓燕，吴振铎，李红，等.氟对大鼠肝细胞影响及SOD阻断因子的透射电镜研究[J].中国地方病学杂志，1993,12(3):136～137
[2] 李键学，全笑江，吴云鹏，等.氟对大鼠肝、肾、脑细胞活性氧代谢的影响[A].中国氟研究文 选[C].贵州科技出版社，73～75
[3] 丁濂.肝细胞的调亡[J].中华病理学杂志，V25(2):118～120
[4] 谈星旺综述，细胞凋亡与肝损伤[J].国外医学(生理、病理科学与临床分册)，1998，V18(1)：76～78
, 百拇医药
[5] 邵忠俊，井玲，李广生，等.微量营养素缺乏对大鼠肝细胞凋亡影响的初步研究[J].白求恩医科大学学报，1998，24(2)：137～138
[6] 井玲，李广生，李成库，等.骨软化性氟骨症动物模型的研究[J].白求恩医科大学学报，1987，13(1)：79～81
[7] 徐铮，井玲，李广生，等.实验性氟中毒的肾脏损害及发生机理[J].中国地方病学杂志，1991,10(3):138～141
[8] Sen S.Programmed cell death:concept,mechanism and control[J] Biol Rev Camb Philos Soc 1992,67(3):287～319
[9] Greenspan HC,Aruma OI.Oxidative stress and apoptosis in HIV infection:a role for plant-drived metabolites with synergistic antioxidant activity[J].Immunol Today 1994,15:209～213
[10] Hirano SM.Fluoride mediates apoptosis in osteosarcoma UMR 106 and its cytoxicity depends on the PH[J].Arch Toxicol 1997,72(1):52～58
收日期：1998-08-20；修订日期：1998-10-27, 百拇医药
单位：白求恩医科大学 地方病研究所， 吉林 长春 130021
关键词：氟中毒；细胞凋亡
中国地方病学杂志990202 【摘要】 目的 研究氟化物对肝细胞凋亡的影响。方法 用偏食饲料、饮水加氟化钠100mg/L或同时加碳酸钙3 200mg/kg饲料喂饲大鼠2个月，用流式细胞术检测肝细胞凋亡小体百分率，同时检测了谷胱苷肽过氧化物酶活性和脂质过氧化物含量。结果 发现氟中毒组大鼠肝细胞凋亡小体百分率较对照组明显升高(P=0.01～0.05)，加钙可使这种改变更为明显(P<0.01)；而GSH-px活性则明显降低。结论 氟化物的毒性可导致肝细胞凋亡，对机体抗氧化能力的降低可能起一定作用。
分类号：R599.9 O246 文献标识码：A 论文编号：1000-4955(1999)02-0084—86
, 百拇医药
Hepatocyte apoptosis in fluorosis rats
JING Ling,SHAO Zongjun,REN Liqun,et al
Institute of Endemic Diseases in Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021
【Abstract】 Objective To study the influence of fluoride and F+Ca on the hepatocyte apoptosis in rats.Methods The hepatocyte apoptosis was investigated by using flow cytometry and the GSH-px activity was measured at the same time.Results The percentage of hepatocyte apoptosis bodies was higher in the group added fluoride (P=0.01～0.05) and much higher in the group added F+Ca (P<0.01) than that of control;the GSH-px activity was reduced in rats fed with F or F+Ca.Conclusions The hepatocyte apoptosis can be induced by fluoride and the change of GSH-px may play an important role in the mechanism of hepatocyte apoptosis.
, 百拇医药
【Key words】 Fluorosis Apoptosis
氟化物对肝脏的毒性作用已有一些报道[1，2]，光镜可见肝细胞索排列紊乱，胞浆结构疏松；电镜下发现肝细胞变形、细胞核膜皱折、固缩，核仁边集等，并发现超氧化物歧化酶可明显阻断上述改变。本文将通过检查氟中毒大鼠肝细胞凋亡及和脂质过氧化之间的关系、加钙后的影响，研究氟化物肝脏毒性的机制。
1 材料和方法
1.1 动物和分组 雄性Wistar大鼠30只，分为三组，对照组大鼠饲偏食饲料，饮自来水；加氟组大鼠饲偏食饲料，饮水加氟化钠100mg/L。氟加钙组大鼠除在偏食饲料中加CaCO3 3200mg/kg饲料外，其余实验条件同加氟组。动物自由进食水，实验周期为2个月。
1.2 自由基代谢检查 颈血管取血，测全血GSH-px活性和血清LPO含量。
, 百拇医药
1.3 流式细胞术检测凋亡小体 颈血管取血后，处死动物，取肝脏约100mg,用毛玻璃研磨制备单细胞悬液，取肝细胞悬液(细胞数为2×106/ml)250μl加入同等体积RNA酶(500μl/ml),37℃消化30min，50μg/ml碘化丙啶(PI)4℃染色1h，FACScan流式细胞仪检测，Cellfit软件收集10 000个细胞，1ysys软件分析数据，记录Ap区亚峰细胞百分率，即为细胞凋亡百分率。并根据DAN含量进行细胞周期分析。
2 结果
2.1 凋亡小体百分率 对照组凋亡小体百分率为33.75±2.83,加氟组为45.92±4.93，加氟加钙组为49.92±15.73，均较对照组有明显差异,分别为P=0.01～0.05,P<0.05(表1)。
表1 各组大鼠肝细胞凋亡小体百分率 组别
凋亡小体百分率(x±s)
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对照组
加氟组
加氟加钙组
33.75±2.83
45.92±4.93*
49.92±15.73**
注：和对照组相比，*P=0.01～0.05;**P<0.01
2.2 细胞周期分析 和对照组相比，加氟组大鼠S期细胞有所增加，G2/M期细胞减少，加氟加钙组除G0/G1期细胞稍有增多外，S期和G2/M期细胞有所增加，差异均未达显著程度。但从趋势上看S期向G2/M期转变过程受到影响，使细胞停滞在S期(表2)。
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表2 加氟和加氟加钙对肝细胞周期的影响 组别
G0/G1(%)
S(%)
G2/M(%)
对照组
加氟组
加氟加钙组
55.14±15.4
60.43±16.88
50.18±19.79
28.06±7.92
, 百拇医药
50.70±16.43
43.34±24.2
5.70±3.32
4.95±2.21
6.48±4.59
2.3 全血GSH-px和血清LPO活力测定 加氟组和加氟加钙组大鼠GSH-px活性较对照组明显降低，LPO含量无明显差异(表3)。 表3 各组大鼠GSH-px和LPO测定结果 组别
GSH-px(U/ml)
LPO(相对荧光强度)
对照组
加氟组
, 百拇医药
加氟加钙组
4.90±2.30
2.03±1.04**
2.28±1.30**
6.08±1.99
6.07±1.28
6.51±2.13
注：**和对照组相比，P<0.01
3 讨论
肝细胞凋亡很多见，在肝脏的免疫细胞介导的细胞毒作用、化学药物或毒物作用、病毒性疾病及自身免疫性病等病理损害中，细胞凋亡为肝细胞死亡的重要机制。如传染性病毒性肝炎的噬酸性体和碎屑坏死、黄热病的Councilman体是凋亡的肝细胞；酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、肝细胞肝癌、药物性肝损伤和某些抗癌药所致的肝细胞死亡等也大多是细胞凋亡[3,4]。肝细胞凋亡有两个形态变化过程：(1)核染色质凝聚、核和胞浆收缩、细胞表面微绒毛消失并逐渐形成大小不等的由膜包绕的凋亡小体，内含结构完整的细胞器，酸性磷酸酶染色阳性；(2)凋亡小体被周围的实质细胞或Kupffer细胞吞噬，胆管上皮细胞的凋亡小体也可脱落于胆管腔内自溶消失或排除。肝细胞局部不发生炎症反应、继发性组织损伤或诱发组织的再生修复。本研究中加氟组和加氟加钙组大鼠肝脏流式细胞术检查发现凋亡小体百分率较对照组明显升高(P=0.01～0.05,P<0.01)，细胞周期研究结果虽无明显差异,但从趋势上看加氟组大鼠S期细胞增多，而G0/M期细胞减少，说明氟可能影响了S期向G0/M期的转变过程。在我们过去的研究中曾发现钙可明显拮抗氟的肾毒性和骨毒性[5，6]，本研究也预期得出钙可拮抗氟所致的细胞凋亡，但结果相反。细胞浆中钙离子浓度增高激活钙依赖半胱氨酸蛋白酶，破坏细胞骨架等使细胞表面形成泡状突起是细胞凋亡的重要机制之一[7]，本研究结果似乎与此有关。同时探讨了关于氟化物所致细胞凋亡和脂质过氧化之间的关系，发现氟中毒虽然不影响脂质过氧化物的含量,但可使GSH-px活性明显降低，提示机体抗氧化能力的降低和细胞凋亡有一定的关系。关于细胞凋亡和脂质过氧化的关系已有报道[8，9]，但在氟中毒时二者的关系还需要做进一步的研究证明。氟导致细胞凋亡的报道很少，仅有一篇报道在培养骨肉瘤细胞中加入5nM氟化钠，用TUNEL法和凝胶电泳可检出凋亡细胞和梯状图谱核苷酸片段，首次论及了体外实验中氟中毒和细胞凋亡的关系[10]。本研究用流式细胞术证明了氟化物可导致大鼠肝细胞凋亡，提示过量氟在体内的毒性同样和细胞凋亡有关。且所致细胞凋亡在氟中毒肝脏病变中扮演重要角色，加钙虽然可以减轻氟的骨骼毒性，但并不能减轻肝脏细胞凋亡改变；另一方面我们将继续研究氟化物促进肝细胞凋亡的基因调控、生化机制和形态特点等，以探讨利用氟的这种功能使氟化物做为一种抗癌药物的可能性。
, http://www.100md.com
基金来源：国家自然科学基金(39730390)
作者简介：井玲，女，1961年生，副研究员
参考文献
[1] 边晓燕，吴振铎，李红，等.氟对大鼠肝细胞影响及SOD阻断因子的透射电镜研究[J].中国地方病学杂志，1993,12(3):136～137
[2] 李键学，全笑江，吴云鹏，等.氟对大鼠肝、肾、脑细胞活性氧代谢的影响[A].中国氟研究文 选[C].贵州科技出版社，73～75
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[4] 谈星旺综述，细胞凋亡与肝损伤[J].国外医学(生理、病理科学与临床分册)，1998，V18(1)：76～78
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[5] 邵忠俊，井玲，李广生，等.微量营养素缺乏对大鼠肝细胞凋亡影响的初步研究[J].白求恩医科大学学报，1998，24(2)：137～138
[6] 井玲，李广生，李成库，等.骨软化性氟骨症动物模型的研究[J].白求恩医科大学学报，1987，13(1)：79～81
[7] 徐铮，井玲，李广生，等.实验性氟中毒的肾脏损害及发生机理[J].中国地方病学杂志，1991,10(3):138～141
[8] Sen S.Programmed cell death:concept,mechanism and control[J] Biol Rev Camb Philos Soc 1992,67(3):287～319
[9] Greenspan HC,Aruma OI.Oxidative stress and apoptosis in HIV infection:a role for plant-drived metabolites with synergistic antioxidant activity[J].Immunol Today 1994,15:209～213
[10] Hirano SM.Fluoride mediates apoptosis in osteosarcoma UMR 106 and its cytoxicity depends on the PH[J].Arch Toxicol 1997,72(1):52～58
收日期：1998-08-20；修订日期：1998-10-27, 百拇医药