生物素-亲合素斑点免疫金渗滤试验检测血清中登革病毒４型抗原
作者：姚海军 曹 虹 刘久来 段馥琴
单位：广州市卫生防疫站病毒室，广州，510080；第一军医大学微生物学教研室，广州，510515；河南省卫辉市人民医院，，453100
关键词：登革病毒；斑点免疫金渗滤试验(DIGFA)；病毒分离
摘要摘要：目的 建立用斑点免疫金渗滤试验(DIGFA)检测血请中登革病毒抗原的方法。方法 一株DV4型特异性单克隆抗体点加于硝酸纤维膜上，以捕获血清中的DV4抗原。借助黄病毒组反应性单克隆抗体、生物素化羊抗鼠IgG抗体、金标SPA和金标亲合素，建立用DIGFA检测血清中登革病毒抗原的方法。结果 常规DIGFA 检测的敏感性高于病毒分离， 而生物素-亲合素 DIGFA(BA-DIGFA)的敏感性又高于常规的DIGFA。常规DIGFA可检测到 5. 0 TCID50的病毒抗原，BA-DIGFA可检测到4.3 TCID50的病毒抗原。结论 作者建立的BA-DIGFA简便、快速、敏感、特异，可用于快速诊断登革病毒4型感染。
, 百拇医药
中图分类号：Q571；Q461
Detection of dengue-4 virus antigens in serum by biotin-avidin dot immunogold filtration assay
Yao Haijun1, Cao Hong2, Liu Jiulai3, Duan Fuqin1
1Department of Virology, Guangzhou Hygienic & Epidemic Prevention Station, Guangzhou, 510080; 2Department of Microbiology, First Military Medical University, Guangzhou, 510515; 3Weihui People's Hospital, Weihui, 453100Abstract: Objective To develop dot-immunogold filtration assay (DIGFA) to detect dengue virus antigens in serum. Methods One dengue-4 virus type-specific monoclonal antibody was fixed on nitrocellulose membranes to capture dengue-4 virus antigens in serum, With the help of flavivirus group-reactive monoclonal antibody, biotinylated goat anti-mouse IgG antibody, colloidal gold labeled SPA and avidin, DIGFA to detect dengue-4 antigens in serum was developed. Results Routine DIGFA was more sensitive than virus isolation, and biotin-avidin DIGFA (BA-DIGFA) was more sensitive than routine DIGFA. The sensitivity limits of routine DIGFA and BA-DIGFA was 5.0 TCID50 and 4.3 TCID50 respectively. Conclusion The BA-DIGFA is simple, rapid, sensitive, specific for detecting dengue virus in serum, and can be used to diagnose dengue-4 virus infection rapidly.
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Key words: dengue virus; dot-immunogold filtration assay (DIGFA); virus isolation
登革病毒(DV) 感染急性期的检测一般采用病毒分离和多聚酶链反应(PCR)。病毒分离费时费力，周期长， 一般需4～5 d才有结果，阳性率也不高。PCR技术条件要求严格，需有一定设备，操作人员需经过专门培训，所以，在基层实验室难以普及。DIGFA 作为一种简便、快速的免疫学诊断试验，已经在病原体感染的检测中得到了广泛应用[3]，我们建立的用DIGFA检测DV感染者急性期血清中DV抗原的方法简便、快速、适用于各级实验室采用的检测方法，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 DV4型特异单克隆抗体(McAb)1H10，效价1:2 560。黄病毒组反应性McAb4G2，效价1:1 280。以上McAb购自美国疾病控制中心，使用时稀释至适当浓度。
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1.2 生物素化羊抗鼠IgG抗体，效价1:1 000，使用时稀释至适当浓度。金标SPA和金标亲合素(胶体金颗粒直径15 nm)，使用时以去离子水稀释至适当浓度。
1.3 测定装置[1]购自广州万孚生物技术公司，内装的硝酸纤维素膜(NC膜)孔径0.45 μm。
1.4 40份临床诊断为登革热患者的急性期血清(发病5 d以内)，-70 ℃冻存。5份乙型脑炎急性期血清，-70 ℃冻存。以上血清由中山医科大学微生物学教研室提供。10份正常人血清标本，由本站检验科提供。
1.5 病毒株DV4(H-241)，乙型脑炎病毒P3株分别感染白纹伊蚊C6/36细胞株，待细胞病变达++～+++时，收集培养上清液，并且滴定DV4的滴度，分装，-70 ℃冻存。
1.6 DIGFA操作步骤
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1.6.1 常规DIGFA步骤 在测定装置的NC膜中央点加1 μg DV4型特异McAb1H10，室温待干。滴加100 μl封闭液(含0.05%吐温-20和0.5%牛血清白蛋白的PBS)，待渗入；滴加50 μl血清标本或病毒上清液，待渗入；滴加50μl封闭液，待渗入；滴加黄病毒组McAb 4G2 50 μl，待渗入。滴加100 μl封闭液，待渗入；滴加50 μl金标SPA，待渗入；滴加100 μl去离子水，待渗入；结果观察，在NC膜中央出现红色斑点者为阳性，否则为阴性。
1.6.2 BA-DIGFA步骤 在NC膜中央点加1μg DV4型特异 McAb 1H10，室温待干；滴加100 μl封闭液(同上)，待渗入；滴加50 μl血清标本或病毒上清液，待渗入；滴加100 μl封闭液，待渗入；滴加黄病毒组 McAb4G2 50 μl，待渗入；滴加100μl封闭液，待渗入；滴加50 μl生物素化羊抗鼠IgG抗体,待渗入；滴加100 μl封闭滴，待渗入；滴加50 μl金标亲合素， 待渗入；滴加去离子水100 μl，待渗入。结果观察同上。
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1.7 病毒分离 操作按本室常规进行，所用细胞为白纹伊蚊C6/36细胞株(分离阳性标本进一步用IFA鉴定，本文所用DV血清经鉴定均为DV4型)。
2 结果
2.1 常规DIGFA、BA-DIGFA与病毒分离结果比较(表1、2)。
表1 常规DIGFA与病毒分离结果比较
Tab.1 Comparison between routine DIGFA and virus isolation
Virus isolation
Routine DIGFA
Total
, http://www.100md.com
+ -
+
11
1
12
-
9
19
28
Total
20
20
40
表2 BA-DIGFA与病毒分离结果比较
, http://www.100md.com
Tab.2 Comparison between BA-DIGFA and virus isolation
Virus isolation
BA-DIGFA
Total
+ -
+
12
0
12
-
10
, http://www.100md.com
18
28
Total
22
18
40
表1经统计学处理，Χ2=6.4，P<0.025；表2经统计学处理，Χ2=10，P<0.005。说明两种DIGFA检测的敏感性与病毒分离比较均有统计学意义。而且，BA-DIGFA敏感性又高于常规DIGFA。
2.2 敏感性 10倍系列稀释已滴定TCID50的DV4病毒液，进行DIGFA检测，结果发现常规DIGFA检测的敏感性是5.0 TCID50，BA-DIGFA检测的敏感性是4.3 TCID50。
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2.3 特异性 乙脑病毒液、5份乙脑急性期血清、10份正常人血清经常规DIGFA和BA-DIGFA检测，均为阴性。
2.4 稳定性 点加了DV4型特异McAb的膜片在4℃冰箱中放置6个月后，重新用来抽检DIGFA阳性标本，结果没有变化。
3 讨论
在DV感染发病的4～5 d内，患者血液中病毒滴度很高[2]，这是用DIGFA检测DV抗原的理论依据。首先将常规DIGFA与病毒分离比较，发现二者检测敏感性有显著差异，DIGFA敏感性高于病毒分离。因为常规DIGFA敏感性略低于ELISA[3]，为了提高DIGFA的敏感性，尝试用生物素-亲合素系统进行放大，结果敏感性确实得到了提高。通过对DV4标准毒株病毒液的检测，发现常规DIGFA检测的敏感性是5.0 TCID50，BA-DIGFA敏感性是4.3 TCID50。对乙型脑炎病毒液和急性期血清进行检测，两种DIGFA法均阴性，说明该法有良好的特异性。点加了抗体的膜片在4 ℃放置6个月检测结果没有变化，说明点加抗体的膜片稳定性亦好。
, 百拇医药
DIGFA法简便、快速，适用于各级实验室。虽然我们仅建立了用DIGFA和BA-DIGFA检测DV4抗原的方法，但将该法作不同改进，可用于检测DV1-4型或DV其他三个型抗原。
参考文献
1 曹锡坤，陶义训，韩 松等. 滴金免疫测定法在检测血清甲胎蛋白中的应用. 上海免疫学杂志，1991，11(3)：154
2 Gubler DJ, Suharyono W, Tan R et al. Varia in patients with naturally acquired dengue infection. Bulletin of World Health Organization, 1981,59(4):623
3 韩 松. 快速斑点免疫结合试验的进展. 中华医学检验杂志，1994，17(4)：249
(收稿日期：1998-10-02), 百拇医药
单位：广州市卫生防疫站病毒室，广州，510080；第一军医大学微生物学教研室，广州，510515；河南省卫辉市人民医院，，453100
关键词：登革病毒；斑点免疫金渗滤试验(DIGFA)；病毒分离
摘要摘要：目的 建立用斑点免疫金渗滤试验(DIGFA)检测血请中登革病毒抗原的方法。方法 一株DV4型特异性单克隆抗体点加于硝酸纤维膜上，以捕获血清中的DV4抗原。借助黄病毒组反应性单克隆抗体、生物素化羊抗鼠IgG抗体、金标SPA和金标亲合素，建立用DIGFA检测血清中登革病毒抗原的方法。结果 常规DIGFA 检测的敏感性高于病毒分离， 而生物素-亲合素 DIGFA(BA-DIGFA)的敏感性又高于常规的DIGFA。常规DIGFA可检测到 5. 0 TCID50的病毒抗原，BA-DIGFA可检测到4.3 TCID50的病毒抗原。结论 作者建立的BA-DIGFA简便、快速、敏感、特异，可用于快速诊断登革病毒4型感染。
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中图分类号：Q571；Q461
Detection of dengue-4 virus antigens in serum by biotin-avidin dot immunogold filtration assay
Yao Haijun1, Cao Hong2, Liu Jiulai3, Duan Fuqin1
1Department of Virology, Guangzhou Hygienic & Epidemic Prevention Station, Guangzhou, 510080; 2Department of Microbiology, First Military Medical University, Guangzhou, 510515; 3Weihui People's Hospital, Weihui, 453100Abstract: Objective To develop dot-immunogold filtration assay (DIGFA) to detect dengue virus antigens in serum. Methods One dengue-4 virus type-specific monoclonal antibody was fixed on nitrocellulose membranes to capture dengue-4 virus antigens in serum, With the help of flavivirus group-reactive monoclonal antibody, biotinylated goat anti-mouse IgG antibody, colloidal gold labeled SPA and avidin, DIGFA to detect dengue-4 antigens in serum was developed. Results Routine DIGFA was more sensitive than virus isolation, and biotin-avidin DIGFA (BA-DIGFA) was more sensitive than routine DIGFA. The sensitivity limits of routine DIGFA and BA-DIGFA was 5.0 TCID50 and 4.3 TCID50 respectively. Conclusion The BA-DIGFA is simple, rapid, sensitive, specific for detecting dengue virus in serum, and can be used to diagnose dengue-4 virus infection rapidly.
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Key words: dengue virus; dot-immunogold filtration assay (DIGFA); virus isolation
登革病毒(DV) 感染急性期的检测一般采用病毒分离和多聚酶链反应(PCR)。病毒分离费时费力，周期长， 一般需4～5 d才有结果，阳性率也不高。PCR技术条件要求严格，需有一定设备，操作人员需经过专门培训，所以，在基层实验室难以普及。DIGFA 作为一种简便、快速的免疫学诊断试验，已经在病原体感染的检测中得到了广泛应用[3]，我们建立的用DIGFA检测DV感染者急性期血清中DV抗原的方法简便、快速、适用于各级实验室采用的检测方法，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 DV4型特异单克隆抗体(McAb)1H10，效价1:2 560。黄病毒组反应性McAb4G2，效价1:1 280。以上McAb购自美国疾病控制中心，使用时稀释至适当浓度。
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1.2 生物素化羊抗鼠IgG抗体，效价1:1 000，使用时稀释至适当浓度。金标SPA和金标亲合素(胶体金颗粒直径15 nm)，使用时以去离子水稀释至适当浓度。
1.3 测定装置[1]购自广州万孚生物技术公司，内装的硝酸纤维素膜(NC膜)孔径0.45 μm。
1.4 40份临床诊断为登革热患者的急性期血清(发病5 d以内)，-70 ℃冻存。5份乙型脑炎急性期血清，-70 ℃冻存。以上血清由中山医科大学微生物学教研室提供。10份正常人血清标本，由本站检验科提供。
1.5 病毒株DV4(H-241)，乙型脑炎病毒P3株分别感染白纹伊蚊C6/36细胞株，待细胞病变达++～+++时，收集培养上清液，并且滴定DV4的滴度，分装，-70 ℃冻存。
1.6 DIGFA操作步骤
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1.6.1 常规DIGFA步骤 在测定装置的NC膜中央点加1 μg DV4型特异McAb1H10，室温待干。滴加100 μl封闭液(含0.05%吐温-20和0.5%牛血清白蛋白的PBS)，待渗入；滴加50 μl血清标本或病毒上清液，待渗入；滴加50μl封闭液，待渗入；滴加黄病毒组McAb 4G2 50 μl，待渗入。滴加100 μl封闭液，待渗入；滴加50 μl金标SPA，待渗入；滴加100 μl去离子水，待渗入；结果观察，在NC膜中央出现红色斑点者为阳性，否则为阴性。
1.6.2 BA-DIGFA步骤 在NC膜中央点加1μg DV4型特异 McAb 1H10，室温待干；滴加100 μl封闭液(同上)，待渗入；滴加50 μl血清标本或病毒上清液，待渗入；滴加100 μl封闭液，待渗入；滴加黄病毒组 McAb4G2 50 μl，待渗入；滴加100μl封闭液，待渗入；滴加50 μl生物素化羊抗鼠IgG抗体,待渗入；滴加100 μl封闭滴，待渗入；滴加50 μl金标亲合素， 待渗入；滴加去离子水100 μl，待渗入。结果观察同上。
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1.7 病毒分离 操作按本室常规进行，所用细胞为白纹伊蚊C6/36细胞株(分离阳性标本进一步用IFA鉴定，本文所用DV血清经鉴定均为DV4型)。
2 结果
2.1 常规DIGFA、BA-DIGFA与病毒分离结果比较(表1、2)。
表1 常规DIGFA与病毒分离结果比较
Tab.1 Comparison between routine DIGFA and virus isolation
Virus isolation
Routine DIGFA
Total
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表2 BA-DIGFA与病毒分离结果比较
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Tab.2 Comparison between BA-DIGFA and virus isolation
Virus isolation
BA-DIGFA
Total
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表1经统计学处理，Χ2=6.4，P<0.025；表2经统计学处理，Χ2=10，P<0.005。说明两种DIGFA检测的敏感性与病毒分离比较均有统计学意义。而且，BA-DIGFA敏感性又高于常规DIGFA。
2.2 敏感性 10倍系列稀释已滴定TCID50的DV4病毒液，进行DIGFA检测，结果发现常规DIGFA检测的敏感性是5.0 TCID50，BA-DIGFA检测的敏感性是4.3 TCID50。
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2.3 特异性 乙脑病毒液、5份乙脑急性期血清、10份正常人血清经常规DIGFA和BA-DIGFA检测，均为阴性。
2.4 稳定性 点加了DV4型特异McAb的膜片在4℃冰箱中放置6个月后，重新用来抽检DIGFA阳性标本，结果没有变化。
3 讨论
在DV感染发病的4～5 d内，患者血液中病毒滴度很高[2]，这是用DIGFA检测DV抗原的理论依据。首先将常规DIGFA与病毒分离比较，发现二者检测敏感性有显著差异，DIGFA敏感性高于病毒分离。因为常规DIGFA敏感性略低于ELISA[3]，为了提高DIGFA的敏感性，尝试用生物素-亲合素系统进行放大，结果敏感性确实得到了提高。通过对DV4标准毒株病毒液的检测，发现常规DIGFA检测的敏感性是5.0 TCID50，BA-DIGFA敏感性是4.3 TCID50。对乙型脑炎病毒液和急性期血清进行检测，两种DIGFA法均阴性，说明该法有良好的特异性。点加了抗体的膜片在4 ℃放置6个月检测结果没有变化，说明点加抗体的膜片稳定性亦好。
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DIGFA法简便、快速，适用于各级实验室。虽然我们仅建立了用DIGFA和BA-DIGFA检测DV4抗原的方法，但将该法作不同改进，可用于检测DV1-4型或DV其他三个型抗原。
参考文献
1 曹锡坤，陶义训，韩 松等. 滴金免疫测定法在检测血清甲胎蛋白中的应用. 上海免疫学杂志，1991，11(3)：154
2 Gubler DJ, Suharyono W, Tan R et al. Varia in patients with naturally acquired dengue infection. Bulletin of World Health Organization, 1981,59(4):623
3 韩 松. 快速斑点免疫结合试验的进展. 中华医学检验杂志，1994，17(4)：249
(收稿日期：1998-10-02), 百拇医药