微卫星不稳定性—遗传性非息肉病性大肠癌诊断的分子标志：附4例报告*

http://www.100md.com 《第一军医大学学报》 1999年第2期

     作者：徐 宁 邱红明 丁彦青 徐 莉

    单位：第一军医大学1南方医院病理科，寄生虫学教研室，广州, 510515

    关键词：MSI；HNPCC；生物学特性；随访

    摘要摘要：目的 探讨微卫星DNA不稳定性(Microsatellite instability, MSI)与遗传性非息肉病性大肠癌(Hereditary nonpolysis colorectal cancer，HNPCC)的关系。方法 采用银染PCR-SSCP方法，检测4例遗传性非息肉病性大肠癌及其相应正常组织的第2、5、17号染色体的4个位点的MSI 。结果 4例HNPCC均存在至少一个位点的MSI。 HNPCC多位于右半结肠，低分化，粘液腺癌多见。结论 MSI是HNPCC常见的分子学事件。HNPCC有其特有的生物学特性。

    中图分类号：Q571；Q461

    MSI- a useful molecular indicator of Hereditary nonpolysis colorectal cancer: a report of 4 cases

    Xu Ning¹, Qiu Hongming¹, Ding Yanqing¹, Xu Li<sup>2

    1</sup>Department of pathology, Nanfang Hospital, ²Department of parasitology, First Military Medical University, Guangzhou, 510515Abstract: Objective To study the relationship between microsatellite instability (MSI) and Hereditary nonpolysis colorectal cancer (HNPCC). Methods Silver staining PCR-SSCP method was used to detect MSI at 4 loci on chromosomes 2,5 and 17 in paraffin-embedded specimens of 4 HNPCC and their paired normal tissue. Results MSI was observed in all 4 HNPCC. It was predominantly a feature of right-sided tumor, of poorly differentiated mucous adenocarcinoma. Conclusion The results indicated that MSI is a common molecular hereditary event in HNPCC. HNPCC has characteristic special biological feature.

    Key words: MSI; HNPCC; biological feature; follow-up

    在世界范围内，大肠癌发病率在各类恶性肿瘤中位居第三，每年新发病例约37万。其中5%~10%属于遗传性非息肉病性大肠癌(HNPCC)。由于其无形态学特点，以往在临床上均未引起重视，而被忽略。最近研究表明，HNPCC大多数均有基因组微卫星DNA不稳定性(MSI)^[1,2]，与散发性大肠癌比较P<0.001^[3,4]。这为HNPCC的研究，及临床诊断提供了一有效分子标记。本文选择4例HNPCC患者，检测其MSI，分析 HNPCC与MSI的关系及 HNPCC肿瘤的生物学特性。

    1 材料和方法

    1.1 HNPCC的诊断标准 (1) Amsterdam标准 HNPCC按1990年国际HNPCC合作组意见，应具备以下三点：家族中至少有3例组织学证实的大肠癌，而且其中一例应为其他2例的一等亲属(包括父母，兄弟姐妹，子女)，家族性腺瘤病应除外；至少有连续2代发病；有一例应在50岁前被诊断^[5]。(2) 临床标准 1993年日本大肠癌研究会对HNPCC诊断标准作了一些修改。符合以下两组标准之一的皆可诊断为本病。Ⅰ. 家族中一等亲属中有3个或3个以上大肠癌患者；Ⅱ. 一家族中有两个大肠癌患者并伴有以下情况之一：癌发病年龄在50岁以下；右侧结肠癌；有同时或异时大肠癌；有其他器官癌^[6]。

    1.2 标本 在南方医院1995年~1997年大肠癌患者中，随意选取年龄小于或大于50岁的大肠癌各30人，左半结肠或右半结肠各30人。用上述标准复查该60例大肠癌患者，发现有4例HNPCC患者。选取该4例HNPCC 存档石蜡包埋组织，每例均取癌组织与正常切缘，所有标本均经病理证实。

    1.3 银染PCR-SSCP检测 MSI DNA模板的提取参照王申五主编《基因诊断技术—非放射性操作手册》一书中方法进行。

    1.3.1 引物 微卫星DNA的引物参照文献[7]设计，由加拿大真达基因公司协助合成，其序列如下：

    D2S123 (1)5′-AAACAGGATGCCTGCCTTTA-3′扩增片段为197-227 bp， (2)5′-GGACTTTCCA-CCTATGGGAC-3′；D5S107 (1)5′-GATC-CACTTTAACCCAAATAC-3′扩增片段为133-155 bp，(2)5′-GGACTTTCCACCTATGGGAC-3′；D17S250 (1)5′-GGAAGAATCAAATAGA-CAAT-3′扩增片段为53-169 bp，(2)5′-GCTG-GCCATATATATATTTAAACCC-3′；D2S119 (1)5′-CTTGGGGAACAGAGGTCATT-3′扩增片段为214-232 bp，(2)5′-GAGAATCCCT-CAATTTCTTTGGA-3′。

    1.3.2 扩增条件 取0.5 ml无菌Eppendof管，反应体积为25μl。按下列次序加样：无菌水10.5μl，10×扩增缓冲剂2.5μl，4种dNTP混合物(10 mmol，Sangon公司)1μl，引物Ⅰ、Ⅱ(100 mg/L)各2μl，模板DNA4μl。于97℃加热8 min使DNA完全变性。将3μl Tag酶(0.75 U，Sangog公司)加入处于80℃的反应混合液中。进行PCR扩增：94℃变性反应45 s，55℃退火反应1 min，72℃延伸反应1 min。依次进行35个循环，72℃延伸反应5 min。反应结束后琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，阳性标本用于SSCP分析。

    1.3.3 微卫星DNA不稳定性分析 取上述PCR产物6μl加入18μl测序加样缓冲液(含98%去离子甲酰胺、10 mmol EDTA, pH 8.0、0.025%二甲苯青、0.025%溴酚蓝)混匀于97℃变性8 min，置40%乙醇碎冰中冰浴5 min，再快速加样于预冷1℃的8%非变性聚丙烯酰胺凝胶板(含5%甘油，丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺之比为19:1)上。13℃，400V恒压电泳2~3 h。电泳缓冲液为0.5×TBE。银染，干胶。肿瘤组织和对应正常组织DNA在同一条件下进行PCR扩增，电泳，银染。如果出现完全一致的电泳条带，则MSI阴性；如果在比较中发现肿瘤标本条带出现增多，丢失或移位，则MSI阳性。

    2 结果

    4例HNPCC均存在至少一个位点的MSI。 HNPCC多位于右半结肠，低分化，粘液腺癌多见(表1、2)。4例HNPCC家族大肠癌发病情况见表3。

    表1 4例HNPCC与散发性大肠癌^[1]生物学特性比较

    Tab. 1 Comparison of biologic features between HNPCC and sporadic CRC^[27]

    Biologic feature

    HNPCC

    Sporadic CRC

    Average age(yr)

    46

    65-70

    Sex

    Female=male

    Male>female

    Right colon

    100%

    30%

    MSI

    100%

    10-15%

    Poorly differentiation

    25%

    10%

    Mucinous cancer

    50%

    10-20%

    表2 4例HNPCC的MSI检测情况

    Tab. 2 MSI incidence of different chromosome loci of 4 HNPCC

    Case number

    D5S107

    D17S250

    D2S123

    D2S119

    1

    +

    +

    +

    2

    +

    3

    +

    +

    +

    4

    +

    +

    +

    表3 4例HNPCC家族大肠癌发病情况

    Tab. 3 A report of CRCS of 4 HNPCC families

    Case number

    Age of the first CRC

    Location

    Family history

    1

    40

    Transverse colon by liver

    Aunt: CRC at 45 years

    2

    43

    Ascending colon

    Father: died of CRC at 50 years old or so

    3

    63

    Ascending colon

    Two brothers: died of CRC at 60 years old or so

    4

    38

    Transverse

    Father: died of CRC at 60 years old or so

    编号1：女，横结肠肝曲高分化乳头状腺癌，部分区域粘液腺癌改变，累及卵巢及淋巴结，出现3个位点MSI。其姑45岁患大肠癌。编号2：男，升结肠高分化乳头状腺癌，有淋巴结转移。出现1个位点MSI，其父50岁左右死于大肠癌。编号3：女，升结肠中分化腺癌，部分区域粘液腺癌改变，Dukes分期A期。出现3个位点MSI。大哥，二哥均于60岁左右死于大肠癌。编号4：男，横结肠低分化腺癌，Dukes分期A期。出现3个位点MSI。父60岁左右死于大肠癌。

    3 讨论

    最近研究发现几乎所有的HNPCC肿瘤，存在着贯穿整个基因组的重复序列的多位点的突变。HNPCC又称“Lynch综合征”，本病为常染色体显性遗传病，患者的子女50%将发病。本病特点为：(1)不伴有息肉病，无明显特征性形态特点而与散发性大肠癌不易区别；(2)大肠癌发病年龄早,平均年龄44岁，比一般大肠癌提前约20年，70%为近侧结肠癌，手术易切除，早期发现及时治疗将改善患者预后；(3)同时或异时大肠癌多见，及在第一癌诊断后10年，多原发大肠癌，发生率可达40%以上；(4)对某些化疗药物(如顺铂)有原发耐药性；(5)具有高突变性，许多癌基因及抑癌基因(如RAS，P53，APC等)突变数目明显增多；(6)粘液腺癌多见，组织分化差，多浸润生长，肿块较大，但较少发生淋巴结转移，预后较好。本病又可分成两型，Ⅰ型病人具以上特点，Ⅱ型病人除上述特点外，其他器官癌的发生率也高，尤其是子宫内膜癌、卵巢癌、乳癌。此外胃癌、胰腺癌、小肠癌、胆道癌、输尿管癌、肾盂移行细胞癌等^[5]。

    由于本病患者多为原发大肠癌，因此术前应作全结肠镜检查以了解有无同时多原发大肠癌或另有腺瘤存在的情况。无结肠镜检查条件时可作钡灌肠检查，但欠可靠，漏诊机会可达60%以上^[8]。有主张本病患者应作大肠次全切除，以避免日后发生异时大肠癌^[5]。Mecklin^[9]报道：Lynch综合征患者作大肠次全切除术(保留大肠长度<35 cm)，术后随访再患大肠肿瘤(腺瘤或癌)的可能性为24%，而做一般大肠癌根治术后再患大肠癌的机会为41%，二者有差异，但无显著性。Lynch综合征Ⅱ型患者由于患子宫、卵巢癌的机会明显升高，因此有人主张此类患者在大肠癌手术时，应一并性作预防性全子宫及双侧附件切除。本病患者术后应每年做结肠镜检查与长期随访。如发现腺瘤应摘除并作病理检查，且应每年至少作一次肠镜检查。Mecklin对40例Lynch综合征患者每2年肠镜检查一次，随访7年发现大肠癌10例，其中5例为Duckes A期、3例为B期，有2例已属C期。Lynch综合征Ⅱ型患者其他器官癌也高发，为及早发现，应定期做食管、胃、十二指肠纤维镜检查，腹部超声检查(包括子宫、卵巢、胰、胆、肾等部位)，肺X线检查与尿细胞学检查。女性除检查乳房外，从30岁开始应每3年妇科盆腔检查加诊断性刮宫检查^[9]。

    本文60例大肠癌中，有4例HNPCC，占6.7%，与文献报道的5%~10%相符。MSI-仅有1%可能属于HNPCC，MSI+有20%属于HNPCC。临床上HNPCC的诊断标准仍未确定，很难判断哪个家族是癌易感家族或仅是一偶然的聚集。虽然大约只有一半HNPCC亲属遗传连锁分析阳性，但约77%家族有MSI+的肿瘤，与预计的HNPCC的大肠癌发病率相近。伴有MSI+肿瘤的患者的亲属有可能是大肠癌或其他肿瘤的高危人群。通过这些简单的检测方法可预测这种危险性且可指导临床用药。在诊治Lynch综合征患者时，还有责任告之患者的一等亲属(患者的兄弟姐妹、子女和年龄70岁以下的父母^[5])，使他们充分了解他们属患大肠癌危险性最大的高危人群(Ⅱ型患者的一等亲属则除大肠癌外，子宫、卵巢、乳腺、胃、胰、胆、肾、输尿管、肺等癌也高发，相对危险上升，分别达2~5左右^[10])，应建议他们从20~25岁开始参加大肠癌(或其他有关癌)的检查^[11,12]。其方法可参照上述Lynch综合征患者术后随访方法。

    参考文献

    1 Lynch HT, Smyrk T. Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer (Lynch syndrome). Cancer, 1996,78(6):1149.

    2 Liu B, Nicoluides NC, Markowitz S et al. Mismatch repair gene defects in sporadic colorectal cancers with microsatellite instability. Nat Genet, 1995, 9(1):48

    3 Brentnal TA. Microsatellite Instabillity in Nonneoplastic Mucosa from Patients with Chronic Ulcerative Colitis. Cancer Res, 1996, 56(6):1237

    4 Aaltonen LA, Peltomaki P, Leach FS et al. Clues to the Pathogenesis of Familial Colorectal Cancer. Science, 1993,260 (5109):812

    5 Jass JR. Current problems in diagnosis and management of hereditary bowel cancer. Asian J Surg, 1995,18(1):166

    6 Muta H, Nogychi M, Peruch M et al. Clinical Implications of Microsatellite Instability in Colorectal Cancers, Cancer, 1996, 77(2): 265

    7 郭 文，张亚历. 微卫星DNA不稳定性与胃癌相关性研究. 现代消化病及内镜杂志，1996，1(3)：229

    8 莫善兢，蔡 宏. 遗传性非息肉病性大肠癌(附10个家族报告). 中华消化杂志，1996，16(6):326

    9 Mecklin JP, Jarvinen H. Treatment and follow-up strategies in HNPCC. Dis Colon Rectum.1993,36(10):927

    10 Honlston IH, Slack J. Risk of cancer in first-degree relatives of patients with hereditary nonpolyposis cancer syndrome(lynbch typeⅡ)。Br J Surg, 1990,77(112):1367

    11 Nomizn T. Clinical features of HNPCC. J Jpn Soc Coloproctol,1993, 46(3):649

    12 Vasen HF, Mecklin JP, Watson P et al. Serveillance in HNPCC: An internatoinal co-operative study of 165 families. Dis Colon Rectum, 1993,36(1):1

    (收稿日期：1998-10-02)

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