肾癌 c-myc癌基因产物p62的表达与临床意义
作者：付绍杰 徐开芹
单位：第一军医大学南方医院1肾移植科，理疗科，广州，510515
关键词：肾肿瘤；致癌基因
第一军医大学学报990214 摘要: 采用ABC法免疫组化技术，检测8例正常肾组织，46例肾癌石蜡包埋标本中p62的表达，并用显微分光光度计测得每例肾癌标本p62的表达强度。结果发现正常肾组织标本中p62染色阴性，46例肾癌标本中29例p62染色阳性，p62的表达位于细胞核内。P62的表达强度与肾癌的病理分级、临床分期呈正相关，与预后呈负相关。
中图分类号：Q571；Q461
The clinic value of c-myc oncogene product p62 expression in human renal cell cancer
, 百拇医药
Fu Shaojie1, Xu Kaiqin2
Departments of 1Kidney Transplantation and 2Physiotherapy, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515Abstract: p62 McAb was used to detect the expression of p62 by immunohistochemical assay, in the paraffin-embedded specimens from normal renal tissues in 8 subjects and tumor tissues in 46 patients with kidney cancer. Microspectrophotometer was used to detect the density of p62 in the every specimen, and the densities of p62 were compared with the pathological grading, clinical staging and prognosis of the patients. The immunohistochemical assay showed that p62 was not found in the normal renal tissues, but detected in some of renal tumor tissues. 29 of 46 renal tumor tissues showed positive expression of p62, Staining was observed in the nucleus. Comparing the results from microspectrophotometer assay and the clinical follow up also showed that the density of p62 expression was parallel with the pathological grading and the clinical staging. The expression of p62 in cases of recurrence was more remarkable.
, 百拇医药
Key words: renal tumor; oncogene
c-myc癌基因产物p62具有结合DNA的作用并参与细胞的分化、增殖的调控[1]，p62的过度表达与肿瘤的生长有密切关系。我们用p62单克隆抗体、抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)法免疫组化技术对肾癌p62的表达进行了定位定量研究并探讨了p62表达与肾癌的病理分级、临床分期及预后的关系，报告如下。
1 材料与方法
1.1实验材料 8 份正常肾组织为泌尿外科其它疾病的肾脏活检石蜡包埋标本。46份肾癌组织均为原发性肾透明细胞癌手术切除的石蜡包埋标本，病人年龄35～67岁，术前均未进行过其它治疗；术后随访3～7年，平均随访5年。所有标本均经10%甲醛固定，常规石蜡包埋切片，连续切片，片厚4～5 μm。一份重行HE染色和病理组织学检查，核实诊断，按照WHO病理分级和Robson临床分期标准对肿瘤的分化程度和浸润范围进行评估。病理1级15例，2级16例，3级15例，临床Ⅰ期12例，Ⅱ期20例，Ⅲ～Ⅳ期14例。
, 百拇医药
1.2 主要试剂与仪器 鼠抗人c-myc癌基因产物p62单克隆抗体(军事医学科学院提供)、ABC试剂盒(抗鼠)(美国Vector公司提供)，MPV-Ⅲ型显微分光光度计(西德Leitz公司)。
1.3 实验方法 免疫组化染色：(1)石蜡标本常规脱蜡至水；(2)0.3% H2O2—甲醇和1%小牛血清处理，PBS洗涤；(3)加P62单抗室温过夜，PBS洗涤。4、加生物素标记的马抗鼠IgG(1:200)37℃ 0.5 h，PBS洗涤；(5)(1:100)ABC复合物37℃1 h，PBS洗涤；(6)DAB显色2 min；(7)苏木素复染30 s；(8)常规脱水、透明、封片、显微镜下观察。用PBS液代替p62单抗作为替代对照。以细胞染成黄色或棕黄色为阳性细胞判断标准。将所有肾癌切片在显微分光光度计上以460 nm棕色光波进行检测，以浅黄色阳性切片为标准；设单个细胞总吸光度临界值为30，每个标本随机检测50个癌细胞，求出每个癌细胞吸光度的平均值，就是每个标本p62染色强度。与肿瘤的病理分级、临床分期对比作方差分析，与患者预后对比进行t检验。
, 百拇医药
2 结果
免疫组化染色结果显示8例正常肾组织标本染色为阴性，46例肾癌标本中29例染色阳性，呈细胞核阳性染色。其中15例病理1级肾癌中2例阳性(13.3%)，16例2级肾癌中12例阳性(75%)，15例3级肾癌中15例阳性(100%)，12例临床Ⅰ期标本中3例阳性 (25%)，20例Ⅱ期标本中12例阳性(60%)，14例Ⅲ ～Ⅳ期标本中14例阳性(100%)。29例p62阳性的患者中有23例复发(79.3%)，17例p62阴性的患者中有9例复发(52.9%)。
46例肾癌标本的p62表达的强度与病理学分级及临床分期的关系通过方差分析P<0.01(表1、表2)。p62的表达强度与肿瘤的复发关系通过t检验P<0.01(表3)。
表1 46例肾癌p62表达强度与病理分级的关系
Tab. 1 Relationship of p62 expression intensity with the pathological grading in the 46 kidney cancer tissues Pathological grading
, 百拇医药
n
M±SD
grade 1
15
12.88±13.20
grade 2
16
49.02±26.76
grade 3
15
81.42±10.99
Variance analysis, P< 0.01
, 百拇医药
表2 46例肾癌p62表达强度与临床分期关系
Tab. 2 Relationship of p62 expression intensity with the clinical staging in the 46 kidney cancer tissues Robson clinical stages
n
M±SD
SⅠ
12
19.48±16.11
SⅡ
20
, 百拇医药
40.31±30.55
SⅢ
14
89.86±6.32
Variance analysis, P<0.01
表3 46例肾癌p62表达强度与肿瘤复发关系
Tab. 3 Relationship of p62 expression intensity with prognosis of patients in the 46 kidney cancer tissues
Group
n
, 百拇医药
M±SD
Recurrence
32
59.08±43.20
Unrecurrence
9
34.87±21.29
t-test, P<0.01
3 讨论
c-myc癌基因由三个外显子和两个内含子组成，2、3外显子共同编码439氨基酸的c-myc蛋白[2]。c-myc蛋白定位于细胞核，通过DNA亲合层析法检测发现纯化过的c-myc蛋白主要位于细胞核，并结合在双链或单链 DNA上[3]。有人用抗人c-myc蛋白的抗体作用于分离的多种细胞核，能特异地抑制DNA的合成；将c-myc蛋白注入细胞核内可启动DNA的复制[4]。因此，c-myc蛋白的作用位点在细胞核内并参与细胞分化、增殖的调控。本实验在p62阳性染色的标本中的p62的表达位于肾癌的细胞核内。
, http://www.100md.com
c-myc蛋白是细胞增殖和分化的调控蛋白，可以识别和结合到基因组中特定的调控序列，激活那些与细胞的增殖和分化有关的基因，可与ras癌基因及生长因子等一起共同维持正常细胞的分裂增殖过程，一旦受某种致癌因素的影响发生c-myc癌基因的活化，将破坏细胞内刺激系统的控制，导致细胞癌变。ras癌基因产物可诱导生长因子的产生，而c-myc癌基因产物增加细胞对生长因子的反应[5]。在8例正常肾组织标本中p62染色阴性，表明在正常肾细胞中除了调节正常的分化增殖外，p62不过量表达。46例肾癌标本中有29例p62阳性，故推测c-myc癌基因产物p62在人类肾癌的发病过程中起重要作用。
Kinouchi等[6]用免疫组化方法检测41例原发性肾癌c-myc蛋白的表达，结果17例病理1级肾癌中2例阳性(12%)，21例2级肾癌17例阳性(81%)，3例3级肾癌均为阳性 (100%)。本实验结果表明p62的表达强度与肾癌的病理分级成正比，随着肾癌恶性程度的增高p62的表达越强。Spandidos等[7]用免疫组化法检测 88例胃癌标本中p62的表达，结果正常胃粘膜无反应。p62的表达与肿瘤的浸润深度有关，4例局限于胃粘膜或粘膜下层的胃癌p62表达均阴性。6例浸润到肌层的胃癌有2例p62表达阳性，47例浸润及胃浆膜层的胃癌标本中有25例p62表达阳性。该作者认为p62单克隆抗体可作为测知胃癌浸润深度的一种标记。本实验证明肾癌浸润越深，p62表达越强。
, 百拇医药
近年来肿瘤分子生物学发展的特点之一就是把癌基因与肿瘤的病期与预后联系起来以指导临床工作，本实验显示p62的表达强度在肿瘤的复发与未复发组之间有显著差异(P<0.01)。复发组p62的表达强度明显高于未复发组，为临床评估个体肾癌复发转移机率提供了依据。
总之，我们认为p62的表达在肾癌的发生发展过程中起一定作用并与肿瘤的分化状态、浸润深度及预后的关系十分密切，是判定肿瘤恶性程度及预后的一项重要指标。
参考文献
1 Kaczmarek L, Hyland JK, Watt R et al. Microinjected c-myc as a competence factor. Science, 1985,228:1313
2 Battey J, Moulding C, Taub R et al. The human c-myc oncogene: structural consequences of translocation into the IgA locus in Burkitt lymphoma. Cell, 1983,34:779
, 百拇医药
3 Pcarsson H, Leder P. Nuclear localization and DNA binding properties of a protein expressed by human c-myc oncogene. Science, 1989,225:718
4 Studzinski GP. Brelvi ZS, Feldman SG et al. Participation of c-myc protein in DNA, synthesis of human cells. Science, 1986,234:467
5 Sterm DF, Roberts AB, Roche NS et al. Differential responsiveness of myc-and ras- transfected cells to growth factors:selective stimulation of myc-transfected cells by epidermal growth factor. Mol Cell Biol, 1986,6:870
, 百拇医药
6 Kinouchi T, Saiki S, Naoe T et al. Correlatlon of c-myc expression with nuclear pleomorphism in human renal cell carcinoma. Cancer Res, 1989,49:3627
7 Spandidos DA, Karayiannis M, Yiangnisis M et al. Immunohistoche-mical analysis of the expression of the c-myc oncoprotein in human stomach cancers. Digestion, 1991,50:127
(收稿日期：1998-10-30), 百拇医药
单位：第一军医大学南方医院1肾移植科，理疗科，广州，510515
关键词：肾肿瘤；致癌基因
第一军医大学学报990214 摘要: 采用ABC法免疫组化技术，检测8例正常肾组织，46例肾癌石蜡包埋标本中p62的表达，并用显微分光光度计测得每例肾癌标本p62的表达强度。结果发现正常肾组织标本中p62染色阴性，46例肾癌标本中29例p62染色阳性，p62的表达位于细胞核内。P62的表达强度与肾癌的病理分级、临床分期呈正相关，与预后呈负相关。
中图分类号：Q571；Q461
The clinic value of c-myc oncogene product p62 expression in human renal cell cancer
, 百拇医药
Fu Shaojie1, Xu Kaiqin2
Departments of 1Kidney Transplantation and 2Physiotherapy, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515Abstract: p62 McAb was used to detect the expression of p62 by immunohistochemical assay, in the paraffin-embedded specimens from normal renal tissues in 8 subjects and tumor tissues in 46 patients with kidney cancer. Microspectrophotometer was used to detect the density of p62 in the every specimen, and the densities of p62 were compared with the pathological grading, clinical staging and prognosis of the patients. The immunohistochemical assay showed that p62 was not found in the normal renal tissues, but detected in some of renal tumor tissues. 29 of 46 renal tumor tissues showed positive expression of p62, Staining was observed in the nucleus. Comparing the results from microspectrophotometer assay and the clinical follow up also showed that the density of p62 expression was parallel with the pathological grading and the clinical staging. The expression of p62 in cases of recurrence was more remarkable.
, 百拇医药
Key words: renal tumor; oncogene
c-myc癌基因产物p62具有结合DNA的作用并参与细胞的分化、增殖的调控[1]，p62的过度表达与肿瘤的生长有密切关系。我们用p62单克隆抗体、抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)法免疫组化技术对肾癌p62的表达进行了定位定量研究并探讨了p62表达与肾癌的病理分级、临床分期及预后的关系，报告如下。
1 材料与方法
1.1实验材料 8 份正常肾组织为泌尿外科其它疾病的肾脏活检石蜡包埋标本。46份肾癌组织均为原发性肾透明细胞癌手术切除的石蜡包埋标本，病人年龄35～67岁，术前均未进行过其它治疗；术后随访3～7年，平均随访5年。所有标本均经10%甲醛固定，常规石蜡包埋切片，连续切片，片厚4～5 μm。一份重行HE染色和病理组织学检查，核实诊断，按照WHO病理分级和Robson临床分期标准对肿瘤的分化程度和浸润范围进行评估。病理1级15例，2级16例，3级15例，临床Ⅰ期12例，Ⅱ期20例，Ⅲ～Ⅳ期14例。
, 百拇医药
1.2 主要试剂与仪器 鼠抗人c-myc癌基因产物p62单克隆抗体(军事医学科学院提供)、ABC试剂盒(抗鼠)(美国Vector公司提供)，MPV-Ⅲ型显微分光光度计(西德Leitz公司)。
1.3 实验方法 免疫组化染色：(1)石蜡标本常规脱蜡至水；(2)0.3% H2O2—甲醇和1%小牛血清处理，PBS洗涤；(3)加P62单抗室温过夜，PBS洗涤。4、加生物素标记的马抗鼠IgG(1:200)37℃ 0.5 h，PBS洗涤；(5)(1:100)ABC复合物37℃1 h，PBS洗涤；(6)DAB显色2 min；(7)苏木素复染30 s；(8)常规脱水、透明、封片、显微镜下观察。用PBS液代替p62单抗作为替代对照。以细胞染成黄色或棕黄色为阳性细胞判断标准。将所有肾癌切片在显微分光光度计上以460 nm棕色光波进行检测，以浅黄色阳性切片为标准；设单个细胞总吸光度临界值为30，每个标本随机检测50个癌细胞，求出每个癌细胞吸光度的平均值，就是每个标本p62染色强度。与肿瘤的病理分级、临床分期对比作方差分析，与患者预后对比进行t检验。
, 百拇医药
2 结果
免疫组化染色结果显示8例正常肾组织标本染色为阴性，46例肾癌标本中29例染色阳性，呈细胞核阳性染色。其中15例病理1级肾癌中2例阳性(13.3%)，16例2级肾癌中12例阳性(75%)，15例3级肾癌中15例阳性(100%)，12例临床Ⅰ期标本中3例阳性 (25%)，20例Ⅱ期标本中12例阳性(60%)，14例Ⅲ ～Ⅳ期标本中14例阳性(100%)。29例p62阳性的患者中有23例复发(79.3%)，17例p62阴性的患者中有9例复发(52.9%)。
46例肾癌标本的p62表达的强度与病理学分级及临床分期的关系通过方差分析P<0.01(表1、表2)。p62的表达强度与肿瘤的复发关系通过t检验P<0.01(表3)。
表1 46例肾癌p62表达强度与病理分级的关系
Tab. 1 Relationship of p62 expression intensity with the pathological grading in the 46 kidney cancer tissues Pathological grading
, 百拇医药
n
M±SD
grade 1
15
12.88±13.20
grade 2
16
49.02±26.76
grade 3
15
81.42±10.99
Variance analysis, P< 0.01
, 百拇医药
表2 46例肾癌p62表达强度与临床分期关系
Tab. 2 Relationship of p62 expression intensity with the clinical staging in the 46 kidney cancer tissues Robson clinical stages
n
M±SD
SⅠ
12
19.48±16.11
SⅡ
20
, 百拇医药
40.31±30.55
SⅢ
14
89.86±6.32
Variance analysis, P<0.01
表3 46例肾癌p62表达强度与肿瘤复发关系
Tab. 3 Relationship of p62 expression intensity with prognosis of patients in the 46 kidney cancer tissues
Group
n
, 百拇医药
M±SD
Recurrence
32
59.08±43.20
Unrecurrence
9
34.87±21.29
t-test, P<0.01
3 讨论
c-myc癌基因由三个外显子和两个内含子组成，2、3外显子共同编码439氨基酸的c-myc蛋白[2]。c-myc蛋白定位于细胞核，通过DNA亲合层析法检测发现纯化过的c-myc蛋白主要位于细胞核，并结合在双链或单链 DNA上[3]。有人用抗人c-myc蛋白的抗体作用于分离的多种细胞核，能特异地抑制DNA的合成；将c-myc蛋白注入细胞核内可启动DNA的复制[4]。因此，c-myc蛋白的作用位点在细胞核内并参与细胞分化、增殖的调控。本实验在p62阳性染色的标本中的p62的表达位于肾癌的细胞核内。
, http://www.100md.com
c-myc蛋白是细胞增殖和分化的调控蛋白，可以识别和结合到基因组中特定的调控序列，激活那些与细胞的增殖和分化有关的基因，可与ras癌基因及生长因子等一起共同维持正常细胞的分裂增殖过程，一旦受某种致癌因素的影响发生c-myc癌基因的活化，将破坏细胞内刺激系统的控制，导致细胞癌变。ras癌基因产物可诱导生长因子的产生，而c-myc癌基因产物增加细胞对生长因子的反应[5]。在8例正常肾组织标本中p62染色阴性，表明在正常肾细胞中除了调节正常的分化增殖外，p62不过量表达。46例肾癌标本中有29例p62阳性，故推测c-myc癌基因产物p62在人类肾癌的发病过程中起重要作用。
Kinouchi等[6]用免疫组化方法检测41例原发性肾癌c-myc蛋白的表达，结果17例病理1级肾癌中2例阳性(12%)，21例2级肾癌17例阳性(81%)，3例3级肾癌均为阳性 (100%)。本实验结果表明p62的表达强度与肾癌的病理分级成正比，随着肾癌恶性程度的增高p62的表达越强。Spandidos等[7]用免疫组化法检测 88例胃癌标本中p62的表达，结果正常胃粘膜无反应。p62的表达与肿瘤的浸润深度有关，4例局限于胃粘膜或粘膜下层的胃癌p62表达均阴性。6例浸润到肌层的胃癌有2例p62表达阳性，47例浸润及胃浆膜层的胃癌标本中有25例p62表达阳性。该作者认为p62单克隆抗体可作为测知胃癌浸润深度的一种标记。本实验证明肾癌浸润越深，p62表达越强。
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近年来肿瘤分子生物学发展的特点之一就是把癌基因与肿瘤的病期与预后联系起来以指导临床工作，本实验显示p62的表达强度在肿瘤的复发与未复发组之间有显著差异(P<0.01)。复发组p62的表达强度明显高于未复发组，为临床评估个体肾癌复发转移机率提供了依据。
总之，我们认为p62的表达在肾癌的发生发展过程中起一定作用并与肿瘤的分化状态、浸润深度及预后的关系十分密切，是判定肿瘤恶性程度及预后的一项重要指标。
参考文献
1 Kaczmarek L, Hyland JK, Watt R et al. Microinjected c-myc as a competence factor. Science, 1985,228:1313
2 Battey J, Moulding C, Taub R et al. The human c-myc oncogene: structural consequences of translocation into the IgA locus in Burkitt lymphoma. Cell, 1983,34:779
, 百拇医药
3 Pcarsson H, Leder P. Nuclear localization and DNA binding properties of a protein expressed by human c-myc oncogene. Science, 1989,225:718
4 Studzinski GP. Brelvi ZS, Feldman SG et al. Participation of c-myc protein in DNA, synthesis of human cells. Science, 1986,234:467
5 Sterm DF, Roberts AB, Roche NS et al. Differential responsiveness of myc-and ras- transfected cells to growth factors:selective stimulation of myc-transfected cells by epidermal growth factor. Mol Cell Biol, 1986,6:870
, 百拇医药
6 Kinouchi T, Saiki S, Naoe T et al. Correlatlon of c-myc expression with nuclear pleomorphism in human renal cell carcinoma. Cancer Res, 1989,49:3627
7 Spandidos DA, Karayiannis M, Yiangnisis M et al. Immunohistoche-mical analysis of the expression of the c-myc oncoprotein in human stomach cancers. Digestion, 1991,50:127
(收稿日期：1998-10-30), 百拇医药