应激与免疫：烧伤早期犬外周血淋巴细胞转化率与糖皮质激素及其受体变化的关系
作者：吴永恒 周一平 方之扬
单位：第一军医大学南方医院烧伤科，广州，510515；第二军医大学长海医院烧伤研究所，上海，200433)
关键词：烧伤；应激；糖皮质激素受体；免疫
第一军医大学学报990208 摘要：目的 研究烧伤早期犬外周血淋巴细胞转化率与血中糖皮质激素浓度及外周血淋巴细胞糖皮质激素受体变化间的关系，探讨强烈应激状态下的免疫改变。方法 抽取烧伤前1 d，伤后2、6、12、24、48及72 h血液为测定样本。用试剂盒测定血浆中皮质醇浓度，[3H]-TdR 掺入法测定植物血凝素(PHA)淋巴细胞转化率，放射配体结合法测定淋巴细胞糖皮质激素受体。结果 烧伤后2、6、12 h淋巴细胞转化率降低，与血浆皮质醇浓度呈反向变化，与糖皮质激素受体呈正相关。结论 烧伤早期的强烈应激反应是淋巴细胞免疫功能损害的重要原因，也可能是烧伤早期全身性感染的重要原因之一。
, 百拇医药
中图分类号：Q571；R644
Stress and immune: the relationship between lymphocyte transformation rate and the changes of plasma glucocorticoid and its receptor in dog peripheral blood lymphocyte in early stage of burn injury
Wu Yongheng1, Zhou Yiping1, Fang Zhiyang2
1Department of Burn, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515; 2Institute of Burn, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433Abstract: Objective To investigate the early immunosupress changes occurred in burn stress, and the relationship between immunosupression and stress. Methods Sixteen dogs were used as burn models. Blood samples were taken at the day before burn and 2, 6, 12, 24, 48 and 72 h post-burn. Plasma cortisol concentrations were determined with radioimmune assay box. Phytohemagglutinin (PHA)-stimulated lymphocyte transformatiom rate were determined by [3H]-TdR mixing. Lymphocyte glucocorticoid receptors were determined by radio-ligand binding assay. Results Lymphocyte responses to PHA were reduced at 2, 6 and 12 h post-burn while the concentration of plasma cortisol increased. There was a significant positive relationship between the change of lymphocyte response to PHA and the change in number of glucocorticoid receptors. Conclusion The strong stress reaction in the early period of burn is a important reason for lymphocyte immunosupression, and may be the one of the most important reasons of severe infection occurred in the early post-burn period.
, http://www.100md.com
Key words: burn; stress; glucocorticoid receptor; immune
烧伤使机体的细胞免疫功能及体液免疫功能均受到不同程度的抑制，以细胞免疫功能的损害更为明显[1]。这是引起烧伤全身性感染的重要原因之一。烧伤又是一种强烈的应激反应，烧伤后的应激反应是否与细胞免疫功能有关引起了我们的兴趣。本文研究了烧伤犬72 h内外周血淋巴细胞转化率的变化，以及48 h内血浆皮质醇浓度及淋巴细胞糖皮质激素受体的变化，并对淋巴细胞转化率与糖皮质激素及其受体之间的关系作了分析。
1材料与方法
1.1 实验动物与分组 成年家犬16只，随机分成两组，实验组9只，麻醉对照组7只。
1.2 动物准备及动物模型制作 动物于实验前驯化两周，烧伤前3 d作颈外静脉导管留置术。实验动物用2.5%硫贲妥钠(2.5 mg/kg)作一次性静脉麻醉后，用5 000 W溴钨灯，距离75 ㎝，照射25 s致面积25%深Ⅱ度到Ⅲ度烧伤。烧伤犬不予治疗，置室内观察，饮食不限。麻醉对照组除不予烧伤外，其余处理同烧伤组。
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1.3 血液样本处理 分别于伤前1 d，伤后2、6、12、24、48和72 h采集血样。血样采集后离心，血浆置于-40℃低温冰箱中保存待测。血淋巴细胞分离后测定[3H]-DeX的特异结合。每次测定均在采血后1 h内开始。 测定方法 血浆皮质醇浓度测定 按试剂盒要求测定。
1.4 测定方法
1.4.1 血浆皮质醇浓度测定 按试剂盒要求测定。
1.4.2 外周血植物血凝素(PHA)刺激下淋巴细胞转化率([3H]-TdR掺入)的测定 全血标本用肝素抗凝，每个培养管中加入全血0.2 ml、培养液3 ml、PHA 0.4 mg，对照管中不加PHA，加盖盖紧。每份样本同时作三组平行管。培养管摇匀后放入38℃培养箱中培养78 h后，每培养管中加入[3H]-TdR 0.1 ml，继续培养16 h。培养结束后加入蒸馏水5 ml破坏血细胞，10 min后残渣收集在49型玻璃纤维纸片上，60℃烤干后放入液闪瓶中，加入闪烁液测定每分钟计数(min-1)，用PHA刺激管减去对照管，取三组结果平均值。
, 百拇医药
1.4.3 淋巴细胞分离及糖皮质激素受体测定 血液样本肝素抗凝后离心出血浆，用淋巴细胞分离液分得淋巴细胞并用Hank液调成3~10×109 /L的浓度，取1 ml该细胞悬液，加入一定量的[3H]-DeX(作Scatchard分析时，于10~20 nmol之间作6~7个浓度；作一点分析时用10 nmol)，另一管中加入等量的[3H]-DeX和1 000倍浓度的非标记DeX作为非特异结合对照管，放入21℃温育3 h后，迅速加入冷PBS 3 ml，中止反应，再用漩涡混匀器混匀后，离心弃上清，如此反复洗涤3次。细胞残渣用甲酸消化后加入闪烁液5 ml，转移到闪烁瓶中计数，结果换算成位点/细胞。
2 结果
2.1 烧伤后糖皮质激素受体的变化 烧伤后2 h淋巴细胞糖皮质激素受体降低，6 h降至最低，48 h恢复到伤前的78.9%。而麻醉几乎不影响糖皮质激素受体的变化。结果见表1。
, 百拇医药
表1 淋巴细胞[H]-DEX特异结合的变化(位点/细胞)
Tab.1 Changes of the lymphocyte special bindings with [3H]-DeX (sites/cell) Group
Pre-burn
Post-burn or post-anesthesia (h)
2
6
12
24
48
, http://www.100md.com
Burn
4531±396
2804±254**
2501±460**
2777±393*
2675±741
3574±387
(n=16)
(n=8)
(n=8)
(n=8)
, 百拇医药
(n=7)
(n=6)
Anesthesia
(n=16)
4309±880
6025±1129
4317±371
4751±265
4401±262
(n=16)
(n=6)
(n=6)
, 百拇医药
(n=6)
(n=6)
(n=6)
p
(n=16)
>0.05
<0.01
<0.05
<0.05
>0.05
* P <0.05, ** P <0.01 vs pre-burn
2.2 烧伤后血浆皮质醇的变化 烧伤后血浆皮质醇升高，6 h达到高峰，为(169±56)μg/L，是伤前的6倍多，以后逐渐恢复，48 h测定值已接近伤前正常值。结果见表2。
, 百拇医药
表2 血浆皮质醇浓度的变化(μg/L)
Tab.2 Changes of plasma cortisol concentration (μg/L) Group
Pre-burn
Post-burn or post-anesthesia (h)
2
6
12
24
48
Burn
, 百拇医药
28±4
162±37**
169±56**
87±27*
70±34
38±22
(n=16)
(n=9)
(n=9)
(n=8)
(n=8)
(n=6)
, 百拇医药
Anesthesia
(n=16)
12±4
25±9
14±3
18±5
22±3
(n=16)
(n=6)
(n=6)
(n=5)
(n=6)
(n=6)
, 百拇医药
P
(n=16)
<0.01
<0.02
>0.05
>0.05
>0.05
* P<0.05, ** P<0.01 vs pre-burn P<0.05, ** P<0.01 vs pre-burn
2.3 烧伤后淋巴细胞转化率的变化 烧伤后2 h淋巴细胞转化率即降低，伤后6 、12 h降低最明显，72 h已恢复到正常值的80.2%。结果见表3。
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表3 淋巴细胞转化率的变化(min-1)
Tab.3 Changes of lymphocyte transform rate (min-1) Group
Pre-burn
Post-burn or post-anesthesia(h)
2 6 12 24 48 72
Burn
27872±8242
13337±4277*
1628±575*
, http://www.100md.com
2410±465*
8194±2619
12272±3632
22347
(n=13)
(n=9)
(n=9)
(n=8)
(n=8)
(n=7)
(n=3)
Anesthesia
, http://www.100md.com
(n=13)
38540±20292
26397±15908
13030±8064
17089±8823
10653±3505
10653±3505
(n=13)
(n=4)
(n=4)
(n=3)
(n=4)
, 百拇医药
(n=4)
(n=4)
P
(n=13)
>0.05
<0.05
<0.05
>0.05
>0.05
>0.05
* P<0.05, ** P<0.01 vs pre-burn P<0.05, ** P<0.01 vs pre-burn
, 百拇医药
2.4 烧伤后血浆皮质醇浓度与淋巴细胞转化率的关系 相关分析表明两组数据无相关关系(r=-0.550， n=6，P>0.05)，但两组数据的变化趋势是负相关的。
2.5 烧伤后淋巴细胞糖皮质激素受体与淋巴细胞转化率的关系 相关分析显示两组数据间有显著的相关关系(r=0.906，n=6，P<0.05)。
3 讨论
烧伤后机体免疫功能的降低是机体容易发生全身性感染的重要原因之一。我们在实验中预先驯化实验用家犬，预先留置静脉导管，设立麻醉对照组，排除了手术、麻醉和抽血操作带来的影响。结果表明，烧伤后2 h淋巴细胞转化率降低，6 h和12 h降低最明显，72 h恢复到正常值的80.2%。提示烧伤早期就有细胞免疫功能的抑制。这种早期免疫功能的改变很可能就是机体早期易发感染的重要原因。
淋巴细胞是重要的免疫细胞。我们在实验中发现，它的免疫功能在烧伤早期的改变，与血浆中糖皮质激素的变化呈现一种反向的关系，与它本身的糖皮质激素受体呈现相关的改变，显示了它们之间的密切联系。提示烧伤早期细胞免疫功能的变化与烧伤早期的应激状态有着密切的关系。Crabtree[2]发现糖皮质激素抑制了T淋巴细胞生长因子的产生和Fc受体的表达，而几乎所有的糖皮质激素的作用都是通过糖皮质激素受体来实现的[3]。说明糖皮质激素通过改变其受体来调节T淋巴细胞生长因子的产生和Fc受体的表达，从而影响淋巴细胞的免疫功能。
, 百拇医药
一般认为，早期全身性感染多与肠源性感染有关，与肠道内的细菌大量移位进入血流有关[4]。而大量的应激激素是引起肠道粘膜屏障功能改变的重要因素。另一方面，应激激素又降低了淋巴细胞的免疫功能[5,6]。我们由此推测烧伤早期的感染与烧伤强烈的应激状态有着十分密切的关系。
参考文献
1 Winkelstein A. What are the immunological alterations induced by burn injury? J Trauma, 1984,24(9 suppl):s72
2 Crabtree GR, Gillis S, Smith KA et al. Mechanisms of glucocorticoid-induced immunosuppression: inhibitory effects on expression of Fc receptors and production of T-cell growth factor. J Steroid Biochem, 1980,12:445
, http://www.100md.com
3 Lan NC, Karin M, Nguyen T et al. Mechanisms of glucocorticoid hormone action. J Steroid Biochem, 1984,20:77
4 黎 鳌主编. 烧伤治疗学. 第二版. 北京：人民卫生出版社，1995.231～235
5 Yehuda R, lowy MT, Southwick SM et al. Lymphocyte glucocorticoid receptor number in posttraumatic stress disorder. Am J Psychiatry, 1991,148(4):499
6 Glaser R, Lafuse WP, Bonneau RH et al. Stress-associated modulation of proto-oncogene expression in human peripheral blood leukocytes. Behav Neurosci, 1993,107(3):525
(收稿日期：1998-12-01), http://www.100md.com
单位：第一军医大学南方医院烧伤科，广州，510515；第二军医大学长海医院烧伤研究所，上海，200433)
关键词：烧伤；应激；糖皮质激素受体；免疫
第一军医大学学报990208 摘要：目的 研究烧伤早期犬外周血淋巴细胞转化率与血中糖皮质激素浓度及外周血淋巴细胞糖皮质激素受体变化间的关系，探讨强烈应激状态下的免疫改变。方法 抽取烧伤前1 d，伤后2、6、12、24、48及72 h血液为测定样本。用试剂盒测定血浆中皮质醇浓度，[3H]-TdR 掺入法测定植物血凝素(PHA)淋巴细胞转化率，放射配体结合法测定淋巴细胞糖皮质激素受体。结果 烧伤后2、6、12 h淋巴细胞转化率降低，与血浆皮质醇浓度呈反向变化，与糖皮质激素受体呈正相关。结论 烧伤早期的强烈应激反应是淋巴细胞免疫功能损害的重要原因，也可能是烧伤早期全身性感染的重要原因之一。
, 百拇医药
中图分类号：Q571；R644
Stress and immune: the relationship between lymphocyte transformation rate and the changes of plasma glucocorticoid and its receptor in dog peripheral blood lymphocyte in early stage of burn injury
Wu Yongheng1, Zhou Yiping1, Fang Zhiyang2
1Department of Burn, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515; 2Institute of Burn, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433Abstract: Objective To investigate the early immunosupress changes occurred in burn stress, and the relationship between immunosupression and stress. Methods Sixteen dogs were used as burn models. Blood samples were taken at the day before burn and 2, 6, 12, 24, 48 and 72 h post-burn. Plasma cortisol concentrations were determined with radioimmune assay box. Phytohemagglutinin (PHA)-stimulated lymphocyte transformatiom rate were determined by [3H]-TdR mixing. Lymphocyte glucocorticoid receptors were determined by radio-ligand binding assay. Results Lymphocyte responses to PHA were reduced at 2, 6 and 12 h post-burn while the concentration of plasma cortisol increased. There was a significant positive relationship between the change of lymphocyte response to PHA and the change in number of glucocorticoid receptors. Conclusion The strong stress reaction in the early period of burn is a important reason for lymphocyte immunosupression, and may be the one of the most important reasons of severe infection occurred in the early post-burn period.
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Key words: burn; stress; glucocorticoid receptor; immune
烧伤使机体的细胞免疫功能及体液免疫功能均受到不同程度的抑制，以细胞免疫功能的损害更为明显[1]。这是引起烧伤全身性感染的重要原因之一。烧伤又是一种强烈的应激反应，烧伤后的应激反应是否与细胞免疫功能有关引起了我们的兴趣。本文研究了烧伤犬72 h内外周血淋巴细胞转化率的变化，以及48 h内血浆皮质醇浓度及淋巴细胞糖皮质激素受体的变化，并对淋巴细胞转化率与糖皮质激素及其受体之间的关系作了分析。
1材料与方法
1.1 实验动物与分组 成年家犬16只，随机分成两组，实验组9只，麻醉对照组7只。
1.2 动物准备及动物模型制作 动物于实验前驯化两周，烧伤前3 d作颈外静脉导管留置术。实验动物用2.5%硫贲妥钠(2.5 mg/kg)作一次性静脉麻醉后，用5 000 W溴钨灯，距离75 ㎝，照射25 s致面积25%深Ⅱ度到Ⅲ度烧伤。烧伤犬不予治疗，置室内观察，饮食不限。麻醉对照组除不予烧伤外，其余处理同烧伤组。
, http://www.100md.com
1.3 血液样本处理 分别于伤前1 d，伤后2、6、12、24、48和72 h采集血样。血样采集后离心，血浆置于-40℃低温冰箱中保存待测。血淋巴细胞分离后测定[3H]-DeX的特异结合。每次测定均在采血后1 h内开始。 测定方法 血浆皮质醇浓度测定 按试剂盒要求测定。
1.4 测定方法
1.4.1 血浆皮质醇浓度测定 按试剂盒要求测定。
1.4.2 外周血植物血凝素(PHA)刺激下淋巴细胞转化率([3H]-TdR掺入)的测定 全血标本用肝素抗凝，每个培养管中加入全血0.2 ml、培养液3 ml、PHA 0.4 mg，对照管中不加PHA，加盖盖紧。每份样本同时作三组平行管。培养管摇匀后放入38℃培养箱中培养78 h后，每培养管中加入[3H]-TdR 0.1 ml，继续培养16 h。培养结束后加入蒸馏水5 ml破坏血细胞，10 min后残渣收集在49型玻璃纤维纸片上，60℃烤干后放入液闪瓶中，加入闪烁液测定每分钟计数(min-1)，用PHA刺激管减去对照管，取三组结果平均值。
, 百拇医药
1.4.3 淋巴细胞分离及糖皮质激素受体测定 血液样本肝素抗凝后离心出血浆，用淋巴细胞分离液分得淋巴细胞并用Hank液调成3~10×109 /L的浓度，取1 ml该细胞悬液，加入一定量的[3H]-DeX(作Scatchard分析时，于10~20 nmol之间作6~7个浓度；作一点分析时用10 nmol)，另一管中加入等量的[3H]-DeX和1 000倍浓度的非标记DeX作为非特异结合对照管，放入21℃温育3 h后，迅速加入冷PBS 3 ml，中止反应，再用漩涡混匀器混匀后，离心弃上清，如此反复洗涤3次。细胞残渣用甲酸消化后加入闪烁液5 ml，转移到闪烁瓶中计数，结果换算成位点/细胞。
2 结果
2.1 烧伤后糖皮质激素受体的变化 烧伤后2 h淋巴细胞糖皮质激素受体降低，6 h降至最低，48 h恢复到伤前的78.9%。而麻醉几乎不影响糖皮质激素受体的变化。结果见表1。
, 百拇医药
表1 淋巴细胞[H]-DEX特异结合的变化(位点/细胞)
Tab.1 Changes of the lymphocyte special bindings with [3H]-DeX (sites/cell) Group
Pre-burn
Post-burn or post-anesthesia (h)
2
6
12
24
48
, http://www.100md.com
Burn
4531±396
2804±254**
2501±460**
2777±393*
2675±741
3574±387
(n=16)
(n=8)
(n=8)
(n=8)
, 百拇医药
(n=7)
(n=6)
Anesthesia
(n=16)
4309±880
6025±1129
4317±371
4751±265
4401±262
(n=16)
(n=6)
(n=6)
, 百拇医药
(n=6)
(n=6)
(n=6)
p
(n=16)
>0.05
<0.01
<0.05
<0.05
>0.05
* P <0.05, ** P <0.01 vs pre-burn
2.2 烧伤后血浆皮质醇的变化 烧伤后血浆皮质醇升高，6 h达到高峰，为(169±56)μg/L，是伤前的6倍多，以后逐渐恢复，48 h测定值已接近伤前正常值。结果见表2。
, 百拇医药
表2 血浆皮质醇浓度的变化(μg/L)
Tab.2 Changes of plasma cortisol concentration (μg/L) Group
Pre-burn
Post-burn or post-anesthesia (h)
2
6
12
24
48
Burn
, 百拇医药
28±4
162±37**
169±56**
87±27*
70±34
38±22
(n=16)
(n=9)
(n=9)
(n=8)
(n=8)
(n=6)
, 百拇医药
Anesthesia
(n=16)
12±4
25±9
14±3
18±5
22±3
(n=16)
(n=6)
(n=6)
(n=5)
(n=6)
(n=6)
, 百拇医药
P
(n=16)
<0.01
<0.02
>0.05
>0.05
>0.05
* P<0.05, ** P<0.01 vs pre-burn P<0.05, ** P<0.01 vs pre-burn
2.3 烧伤后淋巴细胞转化率的变化 烧伤后2 h淋巴细胞转化率即降低，伤后6 、12 h降低最明显，72 h已恢复到正常值的80.2%。结果见表3。
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表3 淋巴细胞转化率的变化(min-1)
Tab.3 Changes of lymphocyte transform rate (min-1) Group
Pre-burn
Post-burn or post-anesthesia(h)
2 6 12 24 48 72
Burn
27872±8242
13337±4277*
1628±575*
, http://www.100md.com
2410±465*
8194±2619
12272±3632
22347
(n=13)
(n=9)
(n=9)
(n=8)
(n=8)
(n=7)
(n=3)
Anesthesia
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(n=13)
38540±20292
26397±15908
13030±8064
17089±8823
10653±3505
10653±3505
(n=13)
(n=4)
(n=4)
(n=3)
(n=4)
, 百拇医药
(n=4)
(n=4)
P
(n=13)
>0.05
<0.05
<0.05
>0.05
>0.05
>0.05
* P<0.05, ** P<0.01 vs pre-burn P<0.05, ** P<0.01 vs pre-burn
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2.4 烧伤后血浆皮质醇浓度与淋巴细胞转化率的关系 相关分析表明两组数据无相关关系(r=-0.550， n=6，P>0.05)，但两组数据的变化趋势是负相关的。
2.5 烧伤后淋巴细胞糖皮质激素受体与淋巴细胞转化率的关系 相关分析显示两组数据间有显著的相关关系(r=0.906，n=6，P<0.05)。
3 讨论
烧伤后机体免疫功能的降低是机体容易发生全身性感染的重要原因之一。我们在实验中预先驯化实验用家犬，预先留置静脉导管，设立麻醉对照组，排除了手术、麻醉和抽血操作带来的影响。结果表明，烧伤后2 h淋巴细胞转化率降低，6 h和12 h降低最明显，72 h恢复到正常值的80.2%。提示烧伤早期就有细胞免疫功能的抑制。这种早期免疫功能的改变很可能就是机体早期易发感染的重要原因。
淋巴细胞是重要的免疫细胞。我们在实验中发现，它的免疫功能在烧伤早期的改变，与血浆中糖皮质激素的变化呈现一种反向的关系，与它本身的糖皮质激素受体呈现相关的改变，显示了它们之间的密切联系。提示烧伤早期细胞免疫功能的变化与烧伤早期的应激状态有着密切的关系。Crabtree[2]发现糖皮质激素抑制了T淋巴细胞生长因子的产生和Fc受体的表达，而几乎所有的糖皮质激素的作用都是通过糖皮质激素受体来实现的[3]。说明糖皮质激素通过改变其受体来调节T淋巴细胞生长因子的产生和Fc受体的表达，从而影响淋巴细胞的免疫功能。
, 百拇医药
一般认为，早期全身性感染多与肠源性感染有关，与肠道内的细菌大量移位进入血流有关[4]。而大量的应激激素是引起肠道粘膜屏障功能改变的重要因素。另一方面，应激激素又降低了淋巴细胞的免疫功能[5,6]。我们由此推测烧伤早期的感染与烧伤强烈的应激状态有着十分密切的关系。
参考文献
1 Winkelstein A. What are the immunological alterations induced by burn injury? J Trauma, 1984,24(9 suppl):s72
2 Crabtree GR, Gillis S, Smith KA et al. Mechanisms of glucocorticoid-induced immunosuppression: inhibitory effects on expression of Fc receptors and production of T-cell growth factor. J Steroid Biochem, 1980,12:445
, http://www.100md.com
3 Lan NC, Karin M, Nguyen T et al. Mechanisms of glucocorticoid hormone action. J Steroid Biochem, 1984,20:77
4 黎 鳌主编. 烧伤治疗学. 第二版. 北京：人民卫生出版社，1995.231～235
5 Yehuda R, lowy MT, Southwick SM et al. Lymphocyte glucocorticoid receptor number in posttraumatic stress disorder. Am J Psychiatry, 1991,148(4):499
6 Glaser R, Lafuse WP, Bonneau RH et al. Stress-associated modulation of proto-oncogene expression in human peripheral blood leukocytes. Behav Neurosci, 1993,107(3):525
(收稿日期：1998-12-01), http://www.100md.com