雷藤甲素和亚硒酸钠对人白血病细胞系HL60生长抑制作用的协同效应
作者：魏一生 叶庆林 金静君 何萍 龙瑞斌 曹祖蕊
单位：魏一生 金静君 何萍 龙瑞斌 曹祖蕊 (福建省医学科学研究所 福州 350001)；叶庆林 (福建医科大学生物化学教研室 福州 350004)
关键词：雷藤甲素；亚硒酸钠；HL60细胞株；协同效应
福建医科大学学报990206
目的 针对雷藤甲素治疗宽度窄的缺点，探讨与亚硒酸钠联合用药以减低雷藤甲素剂量的可能性。方法 以MTT试验观察不同浓度雷藤甲素、亚硒酸钠单独或组合对HL60细胞的生长抑制作用，以基于中效原理的药物量效作用分析软件分析协同、相加、拮抗作用。CI<1时为协同，=1时为相加，>1时为拮抗。结果 半数(18/36)组合呈现协同效应，其中7个生长抑制率>
70%。含雷藤甲素100nmol.L-1或含亚硒酸钠100μmol.L-1的所有组合CI均<1。结论 提示在该两药联合用药方案中减低雷藤甲素的剂量而仍保持原水平疗效的可能性是存在的，值得进一步研究。
, 百拇医药
Synergistic Inhibitory Effects of Sodium Selenite and Triptolide on the Growth of Human Leukemia Cell Line(HL60)
Wei Yisheng Jin Jingjunet al
(Fujian Institute of Medical Sciences,Fuzhou,350001)
Ye Qinglin
(Department of Biochemistry,Fujian Medical University,Fuzhou,350004)
Objective To probe into the possibility if combination of triptolide and sodium selenite can result synergism and diminish the dosage of triptolide whose high toxicity limits its clinic application.Methods MTT assay was used to evaluate the inhibitory effect of triptolide,sodium selenite(in various concentration respectively),and combination of both agents(in various concentration) on the growth of HL60 cell.The drug interactions were analyzed by the dose-effect analysis software (DOSE).The effects were regarded as synergistic,addictive or antagonistic when the CI value<1,=1,or >1 respectively.Results A half of combination(18/36) of both agents showed synergistic effect and 7 combinations among them showed the inhibitory rates >70%.All combinations containing 100 nmol of triptolide or 100μmol of sod.selenite get CI values<1.Conclusion There is possibility that the combination of both agents may show synergistic effect.
, 百拇医药
Key words triptolide;sodium selenite;HL60 cell;synergism
雷藤甲素(triptolide)是Kupchan等由卫茅科植物雷公藤
(Tripterygium wilfordii Hook F.)中分离出的一种二萜内酯三环化合物，作为抗白血病药物申请了专利[1,2]。国内在雷藤甲素的药化、药理上已做了较系统的工作[3,4]，并已进入临床试用，但国内外至今未见临床试用的正式文献报告。毒性大、治疗宽度窄是阻碍雷藤甲素临床应用的“瓶颈”之一。硒则是与肿瘤发生发展有密切关系的微量元素[5,6]，有报告称亚硒酸钠与丝裂霉素联用对肝癌细胞的生长抑制有协同效应[7]。本文以人白血病细胞系HL60为模型，探讨雷藤甲素和亚硒酸钠在抑制人白血病细胞时的相互作用。
, http://www.100md.com 1 材料与方法
1.1 肿瘤细胞系 人白血病细胞系HL60由中国科学院上海药物研究所引入。在我室以添加10%热灭活新生小牛血清的RPMI1640培养液培养于37℃、5%CO2、饱和湿度环境。每3天常规传代一次。
1.2 药物 雷藤甲素由我所药物研究室提供，(批号920520,标示量200μg.ml-1)，临用前经我所中心测试室红外法测其浓度，实测值196.1μg.ml-1。按实测值计算实验剂量。
1.3 试剂及主要仪器 RPMI 1640为Life Tech产品，新生小牛血清为杭州四季青生物技术材料研究所产品。MTT为Fluka产品，二甲基亚砜(DMSO)为上海试剂供应站提供。其他试剂均为国产AR试剂。96孔细胞培养板为美国Becton Dickinson产品(Falcon 3072)。CO2培养箱为美国Forma产品(Forma 3336型)。倒置显微镜为日本Olympus IMT221型。酶联免疫检测仪为美宝特产品(EL311S型)。
, 百拇医药
1.4 MTT试验 按文献[8]略作修改。96孔细胞培养板每孔接种指数生长期HL60细胞2×104/100μl培养液,添加含不同浓度雷藤甲素的培养液50μl/孔和含不同浓度亚硒酸钠的培养液50μl/孔，使雷藤甲素和亚硒酸钠终浓度分别达实验设计要求(见实验设计部分)，作3平行孔，对照孔6孔不加药物，仅添加培养液使培养体系总量达200μl/孔。37℃、5%CO2、饱和湿度培养5天。快翻法除去培养液，加5mg/ml MTT溶液20μl/孔，再培养4h后，加DMSO 100μl/孔振荡15min，于酶联免疫检测仪测A570值。取平行孔读数均值。生长抑制率＝1-(加药平行孔A570均值/对照孔A570均值)。
1.5 实验设计 雷藤甲素设6组终浓度：1000,100, 10,1,0.1,0.01nmol.L-1，从培养板第1至第12行浓度由高到低渐降，亚硒酸钠亦设6组终浓度：100,10,1,0.1,0.01,0.001μmol.L-1，从培养板A列至H列浓度亦由高到低渐降，纵横方向的两梯度组成6×6拉丁方共36种不同浓度的两药组合。每组合3平行孔。同时设仅含不同梯度雷藤甲素的雷藤甲素单独作用组、仅含不同梯度亚硒酸钠的亚硒酸钠单独作用组及不加药物的对照组，以MTT试验定量判定细胞生长抑制程度，以基于中效原理的药物量效作用分析软件(DOSE)[9]分析协同、相加或拮抗效应，其CI值<1时为协同，＝1时为相加，>1时为拮抗。所用计算机为奔腾5/100兼容机。实验重复3次。
, 百拇医药
2 结 果
雷藤甲素及亚硒酸钠不同浓度组合对HL60细胞系的生长抑制率见表1(MTT试验,3次实验均值)。药物量效作用计算机分析结果的CI值见表2。在本实验条件下(MTT试验第5日A570值)雷藤甲素单用时IC50值为28.53nmol.L-1，亚硒酸钠单用时IC50值为1.58mmol.L-1。
表1 雷藤甲素及亚硒酸钠不同浓度联用时HL60细胞生长抑制率(
±s) 雷藤甲素
(nmol.L-1)
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亚硒酸钠(μmol.L-1)
100
10
1
0.1
0.01
0.001
0.000
1000
0.79±0.03
0.74±0.03
0.74±0.04
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0.72±0.04
0.75±0.07
0.73±0.04
0.74±0.05
100
0.79±0.02
0.78±0.01
0.74±0.02
0.74±0.03
0.77±0.02
0.75±0.06
0.74±0.07
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10
0.66±0.03
0.44±0.09
0.41±0.12
0.38±0.14
0.36±0.014
0.32±0.09
0.32±0.13
1
0.59±0.09
0.23±0.05
0.17±0.08
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0.09±0.02
0.11±0.07
0.18±0.09
0.17±0.06
0.1
0.5±10.15
0.20±0.08
0.10±0.06
0.17 *
0.20±0.015
0.14±0.09
0.17±0.013
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0.01
0.60±0.12
0.17±0.05
0.24 *
0.06±0.04
0.09
0.07±0.08
0.07±0.06
0.00
0.62±0.14
0.09±0.05
0.13±0.02
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0.05 *
0.13±0.02
0.04±0.01
*:部分数据缺失,仅为1次数据,无s.
表2 雷藤甲素及亚硒酸钠不同浓度联用对HL60细胞生长抑制的CI值 雷藤甲素
(nmol.L-1)
亚硒酸钠(μmol.L-1)
100
10
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1
0.1
0.01
0.001
1000
0.62
1.54
1.47
1.89
1.29
1.72
(0.62
1.54
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1.47
1.89
1.29
1.72)
100
0.06
0.07
0.14
0.15
0.09
0.12
(0.06
0.07
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0.14
0.15
0.09
0.12)
10
0.05
0.71
1.05
1.44
1.88
3.54
(0.05
0.72
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1.06
1.44
1.88
3.54)
1
0.02
2.76
5.29
30.32
20.43
3.53
(0.02
4.67
, http://www.100md.com
8.68
62.71
21.77
3.53)
0.1
0.05
2.74
11.66
0.47
0.22
0.86
(0.05
3.29
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34.91
0.49
0.22
0.86)
0.01
0.01
6.21
0.10
16.69
0.40
0.91
(0.01
6.45
, 百拇医药
0.10
42.83
0.43
0.95)
无括号数字行为相互排斥性作用模式数据,括号内数字行为相互非排斥性作用模式数据.
3 讨 论
雷藤甲素有很强的抗癌活性，但因较大的毒性限制了它的临床使用。在临床实践中，肿瘤化疗均采用多药联合用药方案，方案的设计选定是一项复杂细致的工作，首先涉及的就是药物相互作用分析。在理想的联合用
药方案中，各药的治疗作用可望获得协同效应，可用较小的剂量获得同样的疗效，毒副作用得以减轻。雷藤甲素强效高毒的特性在恰当的联合用药方案中可望扬长避短，因而雷藤甲素联合用药方案的设计是一项实用性很强的、有意义的工作，但难度颇大。
, 百拇医药
药物相互作用分析研究是药理学的经典话题，方法学难度较大。数十年来众多学者提出多种分析方法，但均不尽如人意。有时甚至令人无所适从[10,11]。Chou等[9,12]建立基于中效原理的药物量效作用分析研究方法，并开发了相应的计算机分析软件(DOSE)，简化了分析操作与过程，得出的结果十分简洁明了，且不论药物相互作用属相互排斥性还是非排斥性均可分析，因而近年来得到了广泛的重视与应用。本文用该法初步分析了雷藤甲素和亚硒酸钠联用时的协同或拮抗效应，发现在若干浓度组合呈现明显的协同效应，半数(18/36)组合的CI值<1，其中生长抑制率>0.7的有7个，含雷藤甲素100nmol.L-1或含亚硒酸钠100μmol.L-1的所有组合CI<1。上述结果有可重复性，3次重复实验结果趋势完全相同，提示在联用方案中降低雷藤甲素剂量而保持原水平疗效的可能性是存在的，值得进一步深入研究。
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参考文献
1 Kupchan SM,Court WA,Dailey RG,et al.Triptolide and tripdiolide,novel antileukemic diterpenoid triepoxides from Tripterygium wilfordii.J Am Chem Soc,1972;94:7194
2 Kupchan SM. Diterpenoid tripoxides their isolation and use.Br Patent 1431336.1973;Apr 3.
3 Wei YS,Isamu A.Inhibitory effect of triptolide on colony formation of breast and stomach cancer cell.lines.Acta Pharm Sin,1991;12:406
, 百拇医药
4 夏志林，郑幼兰.雷公藤内酯醇的药理和临床研究.中国药理学通报,1992;8:427
5 Willett WC,Stampter MJ.Selenium and cancer.Br Med J,1988;297:573
6 Stewart MS,Davis RL,Walsh LP,et al.Induction of differentiation and apoptosis by sodium selenite in human colonic carcinoma cells(HT29).Cancer Lett,1997;117:35
7 孙 耳，朱忠斌，吴 燕.亚硒酸钠和丝裂霉素抑制人肝癌细胞生长的协同效应.天津医药,1993;(11):678
8 温汉平，王小宁，孙华蕴，等.肿瘤细胞体外药敏试验MTT分析法.中华肿瘤杂志,1993；15:470
, http://www.100md.com
9 Chou J,Chou TC.Dose-effect analysis with microcomputers.Cambridge:Biosoft,1987:19～64
10 Berenbaum MC.What is synergy?Pharmacol Rev,1989;41:93
11 罗 非，韩念霖，韩济生.关于药物协同作用的几种计算方法.生理科学进展,1995;26:276
12 Chou TC,Talalay P.Quantitative analysis of dose-effects relationships:the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors.Adv Enzyme Regul,1984;22:27
(收稿:1998-11-18 修回:1999-01-22), 百拇医药
单位：魏一生 金静君 何萍 龙瑞斌 曹祖蕊 (福建省医学科学研究所 福州 350001)；叶庆林 (福建医科大学生物化学教研室 福州 350004)
关键词：雷藤甲素；亚硒酸钠；HL60细胞株；协同效应
福建医科大学学报990206
目的 针对雷藤甲素治疗宽度窄的缺点，探讨与亚硒酸钠联合用药以减低雷藤甲素剂量的可能性。方法 以MTT试验观察不同浓度雷藤甲素、亚硒酸钠单独或组合对HL60细胞的生长抑制作用，以基于中效原理的药物量效作用分析软件分析协同、相加、拮抗作用。CI<1时为协同，=1时为相加，>1时为拮抗。结果 半数(18/36)组合呈现协同效应，其中7个生长抑制率>
70%。含雷藤甲素100nmol.L-1或含亚硒酸钠100μmol.L-1的所有组合CI均<1。结论 提示在该两药联合用药方案中减低雷藤甲素的剂量而仍保持原水平疗效的可能性是存在的，值得进一步研究。
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Synergistic Inhibitory Effects of Sodium Selenite and Triptolide on the Growth of Human Leukemia Cell Line(HL60)
Wei Yisheng Jin Jingjunet al
(Fujian Institute of Medical Sciences,Fuzhou,350001)
Ye Qinglin
(Department of Biochemistry,Fujian Medical University,Fuzhou,350004)
Objective To probe into the possibility if combination of triptolide and sodium selenite can result synergism and diminish the dosage of triptolide whose high toxicity limits its clinic application.Methods MTT assay was used to evaluate the inhibitory effect of triptolide,sodium selenite(in various concentration respectively),and combination of both agents(in various concentration) on the growth of HL60 cell.The drug interactions were analyzed by the dose-effect analysis software (DOSE).The effects were regarded as synergistic,addictive or antagonistic when the CI value<1,=1,or >1 respectively.Results A half of combination(18/36) of both agents showed synergistic effect and 7 combinations among them showed the inhibitory rates >70%.All combinations containing 100 nmol of triptolide or 100μmol of sod.selenite get CI values<1.Conclusion There is possibility that the combination of both agents may show synergistic effect.
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Key words triptolide;sodium selenite;HL60 cell;synergism
雷藤甲素(triptolide)是Kupchan等由卫茅科植物雷公藤
(Tripterygium wilfordii Hook F.)中分离出的一种二萜内酯三环化合物，作为抗白血病药物申请了专利[1,2]。国内在雷藤甲素的药化、药理上已做了较系统的工作[3,4]，并已进入临床试用，但国内外至今未见临床试用的正式文献报告。毒性大、治疗宽度窄是阻碍雷藤甲素临床应用的“瓶颈”之一。硒则是与肿瘤发生发展有密切关系的微量元素[5,6]，有报告称亚硒酸钠与丝裂霉素联用对肝癌细胞的生长抑制有协同效应[7]。本文以人白血病细胞系HL60为模型，探讨雷藤甲素和亚硒酸钠在抑制人白血病细胞时的相互作用。
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1.1 肿瘤细胞系 人白血病细胞系HL60由中国科学院上海药物研究所引入。在我室以添加10%热灭活新生小牛血清的RPMI1640培养液培养于37℃、5%CO2、饱和湿度环境。每3天常规传代一次。
1.2 药物 雷藤甲素由我所药物研究室提供，(批号920520,标示量200μg.ml-1)，临用前经我所中心测试室红外法测其浓度，实测值196.1μg.ml-1。按实测值计算实验剂量。
1.3 试剂及主要仪器 RPMI 1640为Life Tech产品，新生小牛血清为杭州四季青生物技术材料研究所产品。MTT为Fluka产品，二甲基亚砜(DMSO)为上海试剂供应站提供。其他试剂均为国产AR试剂。96孔细胞培养板为美国Becton Dickinson产品(Falcon 3072)。CO2培养箱为美国Forma产品(Forma 3336型)。倒置显微镜为日本Olympus IMT221型。酶联免疫检测仪为美宝特产品(EL311S型)。
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1.4 MTT试验 按文献[8]略作修改。96孔细胞培养板每孔接种指数生长期HL60细胞2×104/100μl培养液,添加含不同浓度雷藤甲素的培养液50μl/孔和含不同浓度亚硒酸钠的培养液50μl/孔，使雷藤甲素和亚硒酸钠终浓度分别达实验设计要求(见实验设计部分)，作3平行孔，对照孔6孔不加药物，仅添加培养液使培养体系总量达200μl/孔。37℃、5%CO2、饱和湿度培养5天。快翻法除去培养液，加5mg/ml MTT溶液20μl/孔，再培养4h后，加DMSO 100μl/孔振荡15min，于酶联免疫检测仪测A570值。取平行孔读数均值。生长抑制率＝1-(加药平行孔A570均值/对照孔A570均值)。
1.5 实验设计 雷藤甲素设6组终浓度：1000,100, 10,1,0.1,0.01nmol.L-1，从培养板第1至第12行浓度由高到低渐降，亚硒酸钠亦设6组终浓度：100,10,1,0.1,0.01,0.001μmol.L-1，从培养板A列至H列浓度亦由高到低渐降，纵横方向的两梯度组成6×6拉丁方共36种不同浓度的两药组合。每组合3平行孔。同时设仅含不同梯度雷藤甲素的雷藤甲素单独作用组、仅含不同梯度亚硒酸钠的亚硒酸钠单独作用组及不加药物的对照组，以MTT试验定量判定细胞生长抑制程度，以基于中效原理的药物量效作用分析软件(DOSE)[9]分析协同、相加或拮抗效应，其CI值<1时为协同，＝1时为相加，>1时为拮抗。所用计算机为奔腾5/100兼容机。实验重复3次。
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2 结 果
雷藤甲素及亚硒酸钠不同浓度组合对HL60细胞系的生长抑制率见表1(MTT试验,3次实验均值)。药物量效作用计算机分析结果的CI值见表2。在本实验条件下(MTT试验第5日A570值)雷藤甲素单用时IC50值为28.53nmol.L-1，亚硒酸钠单用时IC50值为1.58mmol.L-1。
表1 雷藤甲素及亚硒酸钠不同浓度联用时HL60细胞生长抑制率(
±s) 雷藤甲素(nmol.L-1)
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亚硒酸钠(μmol.L-1)
100
10
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0.13±0.02
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0.13±0.02
0.04±0.01
*:部分数据缺失,仅为1次数据,无s.
表2 雷藤甲素及亚硒酸钠不同浓度联用对HL60细胞生长抑制的CI值 雷藤甲素
(nmol.L-1)
亚硒酸钠(μmol.L-1)
100
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1.89
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无括号数字行为相互排斥性作用模式数据,括号内数字行为相互非排斥性作用模式数据.
3 讨 论
雷藤甲素有很强的抗癌活性，但因较大的毒性限制了它的临床使用。在临床实践中，肿瘤化疗均采用多药联合用药方案，方案的设计选定是一项复杂细致的工作，首先涉及的就是药物相互作用分析。在理想的联合用
药方案中，各药的治疗作用可望获得协同效应，可用较小的剂量获得同样的疗效，毒副作用得以减轻。雷藤甲素强效高毒的特性在恰当的联合用药方案中可望扬长避短，因而雷藤甲素联合用药方案的设计是一项实用性很强的、有意义的工作，但难度颇大。
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药物相互作用分析研究是药理学的经典话题，方法学难度较大。数十年来众多学者提出多种分析方法，但均不尽如人意。有时甚至令人无所适从[10,11]。Chou等[9,12]建立基于中效原理的药物量效作用分析研究方法，并开发了相应的计算机分析软件(DOSE)，简化了分析操作与过程，得出的结果十分简洁明了，且不论药物相互作用属相互排斥性还是非排斥性均可分析，因而近年来得到了广泛的重视与应用。本文用该法初步分析了雷藤甲素和亚硒酸钠联用时的协同或拮抗效应，发现在若干浓度组合呈现明显的协同效应，半数(18/36)组合的CI值<1，其中生长抑制率>0.7的有7个，含雷藤甲素100nmol.L-1或含亚硒酸钠100μmol.L-1的所有组合CI<1。上述结果有可重复性，3次重复实验结果趋势完全相同，提示在联用方案中降低雷藤甲素剂量而保持原水平疗效的可能性是存在的，值得进一步深入研究。
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参考文献
1 Kupchan SM,Court WA,Dailey RG,et al.Triptolide and tripdiolide,novel antileukemic diterpenoid triepoxides from Tripterygium wilfordii.J Am Chem Soc,1972;94:7194
2 Kupchan SM. Diterpenoid tripoxides their isolation and use.Br Patent 1431336.1973;Apr 3.
3 Wei YS,Isamu A.Inhibitory effect of triptolide on colony formation of breast and stomach cancer cell.lines.Acta Pharm Sin,1991;12:406
, 百拇医药
4 夏志林，郑幼兰.雷公藤内酯醇的药理和临床研究.中国药理学通报,1992;8:427
5 Willett WC,Stampter MJ.Selenium and cancer.Br Med J,1988;297:573
6 Stewart MS,Davis RL,Walsh LP,et al.Induction of differentiation and apoptosis by sodium selenite in human colonic carcinoma cells(HT29).Cancer Lett,1997;117:35
7 孙 耳，朱忠斌，吴 燕.亚硒酸钠和丝裂霉素抑制人肝癌细胞生长的协同效应.天津医药,1993;(11):678
8 温汉平，王小宁，孙华蕴，等.肿瘤细胞体外药敏试验MTT分析法.中华肿瘤杂志,1993；15:470
, http://www.100md.com
9 Chou J,Chou TC.Dose-effect analysis with microcomputers.Cambridge:Biosoft,1987:19～64
10 Berenbaum MC.What is synergy?Pharmacol Rev,1989;41:93
11 罗 非，韩念霖，韩济生.关于药物协同作用的几种计算方法.生理科学进展,1995;26:276
12 Chou TC,Talalay P.Quantitative analysis of dose-effects relationships:the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors.Adv Enzyme Regul,1984;22:27
(收稿:1998-11-18 修回:1999-01-22), 百拇医药