PCR检测人巨细胞病毒感染的研究
作者：宋利琼 刘朝奇 韩 莉 张昌菊
单位：湖北三峡学院医学院微生物学教研室(宜昌 443003)
关键词：聚合酶链反应；人巨细胞病毒
家用医学进修杂志990208
摘 要 目的：建立快速简便的聚合酶链反应(PCR)方法检测人巨细胞病毒(HCMV-DNA)。方法：根据国外文献报道的HCMV基因序列，利用计算机辅助设计并选出一对寡核苷酸引物，扩增片段为370bp。结果：在370bp处出现DNA扩增带者为HCMV-DNA阳性。结论：PCR技术检测HCMV-DNA敏感、特异，有望应用于临床作为HCMV感染的早期诊断方法。
Research of PCR Measuring Human Cytomegalovirus Infection
, http://www.100md.com
Song Liqiong Liu Chaoqi Han Li,et al
Department of Microbiology,Hubei Three Gorges University Medical College,Yichang 443003
Abstract Objective:To institute a quick and simple method of Polymerase Chain Reaction(PCR),which can measure HCMV-DNA.Method:According to HCMV gene orders that foreign literatures reported,and with the computer we devise and choose out a pair of oligonucleotide primers,whose expanded fractions appear at 370bp.Result:That DNA expanded areas appear at 370bp is regard as HCMV-DNA positive reaction.Conclusion:The PCR technique measuring HCMV-DNA is sensitive,specific,and can be used as an early diagnostic method of HCMV infection in clinic.
, 百拇医药
Key Words Polymerase Chain Reaction;Human Cytomegalovirus
众所周知，人巨细胞病毒(HCMV)在全世界流行非常广泛，一般人群多数为隐性感染，但孕妇HCMV原发感染或激活再发感染可将HCMV传播至胎儿，可造成新生儿严重的巨细胞包涵体病或神经系统后遗症，即临床表现为低体重，黄疸，肝脾肿大，先心和小头畸形等，在孕早期原发HCMV感染者自发流产的危险性增加[1]，迄今尚缺乏防治HCMV感染的有效措施。就此，本室建立一种PCR技术来检测妊娠早中期胎儿宫内HCMV感染，有助于临床早期诊断。
1 材料和方法
1.1 材料
HCMV AD169病毒由湖北医科大学病毒所提供。Taq DNA聚合酶为Promega公司产品。dNTP等为美国Promega公司产品。10×Buffer的配制：500mM KCl,300mM Tris-Cl pH8.4,Tween20(0.8%)。25mM MgCl2：称取20.33g MgCl2.6H2O/100ml高压分装，然后进行40×稀释即可用。
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1.2 方法
1.2.1 引物设计 根据文献报道的HCMV基因序列，利用计算机辅助设计并选出一对寡核苷酸引物：
上游引物：5’GGGTGCTGTCCTGCT
ATGTCTTA3’
下游引物：5’CATCACTCTGCTCAC
TTTCTTCC3’
1.2.2 HCMV-DNA提取 Ⅰ液：冰醋酸∶甲醇=1∶3。Ⅱ液：灭菌ddH2O∶Ⅰ液=100ml∶2ml。
在1.5mlEP管中加入1ml的Ⅱ液，再取200ul抗凝胎儿脐带血加入混匀，4000rpm离心3分钟，弃上清。然后用灭菌ddH2O1ml加入沉淀中混匀后，4000rpm离心3分钟，弃上清，重复1～2次，直至沉淀变白为止。在沉淀中加入50ulDNA提取液，吹打均匀后100℃沸水浴15分钟，立即放入冰块中，再15000rpm离心10分钟备用。
, 百拇医药
1.2.3 PCR扩增 反应体积为50ul，模板DNA1ul(约含50ng病毒DNA)，引物4ul各2ul(约25pmol)，dNTP(200uM)4ul,10×Buffer5ul,MgCl2(25mM)5ul,ddH2O31ul，最后加Iul Taq酶，再滴入1～2滴石蜡油，总体积50ul。在PTC-150型基因扩增仪上(美国基因公司生产)按下列参数扩增：93℃预处理5min，94℃60S→54℃60S→72℃60S，35个循环，72℃再次延伸5min。
2 结果
取10ul扩增产物用15g/L琼脂糖凝胶电泳30min，电压120V，以pBR322/HinfⅠ作为分子标准，并设立阴、阳性对照，EB染色，在紫外反射仪下观察，在370bp处出现DNA扩增带为阳性。
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3 讨论
HCMV在全世界流行非常广泛，迄今尚缺乏防治HCMV感染的有效措施，有报道疫苗加免疫佐剂在小白鼠体内能产生有效的抗HCMV抗体[2]，但人体内疫苗试验结果欠佳[3]。
PCR技术是利用DNA聚合酶，将特异的DNA片段通过变性-复性-延伸3个步骤的循环，使模板NDA以指数级扩增。由于其灵敏度高，特异好，得到广泛的应用。本室用PCR技术检测临床标本72例，其阳性率为13.8%，与国内外多数报道的2%～13%基本一致[4]。此外，国外已有RT-PCR技术检测IE基因的mRNA早期诊断活动感染的研究报道[5]。
1988年PCP开始被用于HCMV检测，PCR敏感性达ifgDNA，具有高度特异性和简便快速的特点：而人巨细胞病毒(HCMV)特异性和敏感性均很高，极易出现HCMV-DNA扩增带，从而可探讨HCMV与许多严重病症的关系，尤其对孕期监测及宫内感染的诊断更有意义。而且PCR检测指标稳定，还可进行半定量分析，可作为评论各种抗病毒药物疗效的手段。
, http://www.100md.com
PCR实验技术要求高，应严格遵循无菌操作，力求避免因交叉污染和酶失活所引起的假阳性和假阴性。为此，我们在每次标本DNA提取及进行每批PCR扩增进设立阴，阳性模板对照，同时采取各种防污染措施，如注意一次性使用反应管，吸头等，未发现阴性对照出现阳性结果。
孕妇原发感染和继发感染均可引起胎儿的先天性感染，宫内HCMV感染可引起流产，早产，死胎，胎儿宫内发育迟缓及迟发的智力低下，视力，听力损害等后遗症[1]。因此，建议在临床应用PCR技术检测孕妇宫内早、中期HCMV感染，有助于采取相应的措施，预防或降低缺陷儿的出生，对提高人口素质，实现优生保健均具有重要的社会和经济意义。因此，PCR技术检测HCMV-DNA敏感，特异，有望应用于临床作为HCMV感染的早期诊断方法。
参考文献
1 卢彦平，翁霞云，谷志远，等。人巨细胞病毒感染与先天畸形关系的探讨。中华妇产科杂志 1998；33(3)：132
, http://www.100md.com
2 Britt W,Fay J,Formulation of an immunogenic human cytomegalovirus vsccine:responses in mice.J infect Dis 1995；171：18
3 Adler SP,Starr SE,Plotkin SA,et al.Immunity induced by promary among women of children-bearing age.J infect Dis 1995；171：26
4 张睿，刘新质。应用PCR和ELISA检测孕妇和胎儿HCMV感染的研究。中华妇产科杂志 1998；33(9)：529
5 Velzing J,Rothbarth,Kroes ACM,et al.Detection of cytomegalovirus mRNA and DNA encoding the immediate early gene in peripheral blood leukocytes from immunocompromised patiects.J Med,virol 1994；42：164
(1999-01-27 收稿), http://www.100md.com
单位：湖北三峡学院医学院微生物学教研室(宜昌 443003)
关键词：聚合酶链反应；人巨细胞病毒
家用医学进修杂志990208
摘 要 目的：建立快速简便的聚合酶链反应(PCR)方法检测人巨细胞病毒(HCMV-DNA)。方法：根据国外文献报道的HCMV基因序列，利用计算机辅助设计并选出一对寡核苷酸引物，扩增片段为370bp。结果：在370bp处出现DNA扩增带者为HCMV-DNA阳性。结论：PCR技术检测HCMV-DNA敏感、特异，有望应用于临床作为HCMV感染的早期诊断方法。
Research of PCR Measuring Human Cytomegalovirus Infection
, http://www.100md.com
Song Liqiong Liu Chaoqi Han Li,et al
Department of Microbiology,Hubei Three Gorges University Medical College,Yichang 443003
Abstract Objective:To institute a quick and simple method of Polymerase Chain Reaction(PCR),which can measure HCMV-DNA.Method:According to HCMV gene orders that foreign literatures reported,and with the computer we devise and choose out a pair of oligonucleotide primers,whose expanded fractions appear at 370bp.Result:That DNA expanded areas appear at 370bp is regard as HCMV-DNA positive reaction.Conclusion:The PCR technique measuring HCMV-DNA is sensitive,specific,and can be used as an early diagnostic method of HCMV infection in clinic.
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Key Words Polymerase Chain Reaction;Human Cytomegalovirus
众所周知，人巨细胞病毒(HCMV)在全世界流行非常广泛，一般人群多数为隐性感染，但孕妇HCMV原发感染或激活再发感染可将HCMV传播至胎儿，可造成新生儿严重的巨细胞包涵体病或神经系统后遗症，即临床表现为低体重，黄疸，肝脾肿大，先心和小头畸形等，在孕早期原发HCMV感染者自发流产的危险性增加[1]，迄今尚缺乏防治HCMV感染的有效措施。就此，本室建立一种PCR技术来检测妊娠早中期胎儿宫内HCMV感染，有助于临床早期诊断。
1 材料和方法
1.1 材料
HCMV AD169病毒由湖北医科大学病毒所提供。Taq DNA聚合酶为Promega公司产品。dNTP等为美国Promega公司产品。10×Buffer的配制：500mM KCl,300mM Tris-Cl pH8.4,Tween20(0.8%)。25mM MgCl2：称取20.33g MgCl2.6H2O/100ml高压分装，然后进行40×稀释即可用。
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1.2 方法
1.2.1 引物设计 根据文献报道的HCMV基因序列，利用计算机辅助设计并选出一对寡核苷酸引物：
上游引物：5’GGGTGCTGTCCTGCT
ATGTCTTA3’
下游引物：5’CATCACTCTGCTCAC
TTTCTTCC3’
1.2.2 HCMV-DNA提取 Ⅰ液：冰醋酸∶甲醇=1∶3。Ⅱ液：灭菌ddH2O∶Ⅰ液=100ml∶2ml。
在1.5mlEP管中加入1ml的Ⅱ液，再取200ul抗凝胎儿脐带血加入混匀，4000rpm离心3分钟，弃上清。然后用灭菌ddH2O1ml加入沉淀中混匀后，4000rpm离心3分钟，弃上清，重复1～2次，直至沉淀变白为止。在沉淀中加入50ulDNA提取液，吹打均匀后100℃沸水浴15分钟，立即放入冰块中，再15000rpm离心10分钟备用。
, 百拇医药
1.2.3 PCR扩增 反应体积为50ul，模板DNA1ul(约含50ng病毒DNA)，引物4ul各2ul(约25pmol)，dNTP(200uM)4ul,10×Buffer5ul,MgCl2(25mM)5ul,ddH2O31ul，最后加Iul Taq酶，再滴入1～2滴石蜡油，总体积50ul。在PTC-150型基因扩增仪上(美国基因公司生产)按下列参数扩增：93℃预处理5min，94℃60S→54℃60S→72℃60S，35个循环，72℃再次延伸5min。
2 结果
取10ul扩增产物用15g/L琼脂糖凝胶电泳30min，电压120V，以pBR322/HinfⅠ作为分子标准，并设立阴、阳性对照，EB染色，在紫外反射仪下观察，在370bp处出现DNA扩增带为阳性。
, http://www.100md.com
3 讨论
HCMV在全世界流行非常广泛，迄今尚缺乏防治HCMV感染的有效措施，有报道疫苗加免疫佐剂在小白鼠体内能产生有效的抗HCMV抗体[2]，但人体内疫苗试验结果欠佳[3]。
PCR技术是利用DNA聚合酶，将特异的DNA片段通过变性-复性-延伸3个步骤的循环，使模板NDA以指数级扩增。由于其灵敏度高，特异好，得到广泛的应用。本室用PCR技术检测临床标本72例，其阳性率为13.8%，与国内外多数报道的2%～13%基本一致[4]。此外，国外已有RT-PCR技术检测IE基因的mRNA早期诊断活动感染的研究报道[5]。
1988年PCP开始被用于HCMV检测，PCR敏感性达ifgDNA，具有高度特异性和简便快速的特点：而人巨细胞病毒(HCMV)特异性和敏感性均很高，极易出现HCMV-DNA扩增带，从而可探讨HCMV与许多严重病症的关系，尤其对孕期监测及宫内感染的诊断更有意义。而且PCR检测指标稳定，还可进行半定量分析，可作为评论各种抗病毒药物疗效的手段。
, http://www.100md.com
PCR实验技术要求高，应严格遵循无菌操作，力求避免因交叉污染和酶失活所引起的假阳性和假阴性。为此，我们在每次标本DNA提取及进行每批PCR扩增进设立阴，阳性模板对照，同时采取各种防污染措施，如注意一次性使用反应管，吸头等，未发现阴性对照出现阳性结果。
孕妇原发感染和继发感染均可引起胎儿的先天性感染，宫内HCMV感染可引起流产，早产，死胎，胎儿宫内发育迟缓及迟发的智力低下，视力，听力损害等后遗症[1]。因此，建议在临床应用PCR技术检测孕妇宫内早、中期HCMV感染，有助于采取相应的措施，预防或降低缺陷儿的出生，对提高人口素质，实现优生保健均具有重要的社会和经济意义。因此，PCR技术检测HCMV-DNA敏感，特异，有望应用于临床作为HCMV感染的早期诊断方法。
参考文献
1 卢彦平，翁霞云，谷志远，等。人巨细胞病毒感染与先天畸形关系的探讨。中华妇产科杂志 1998；33(3)：132
, http://www.100md.com
2 Britt W,Fay J,Formulation of an immunogenic human cytomegalovirus vsccine:responses in mice.J infect Dis 1995；171：18
3 Adler SP,Starr SE,Plotkin SA,et al.Immunity induced by promary among women of children-bearing age.J infect Dis 1995；171：26
4 张睿，刘新质。应用PCR和ELISA检测孕妇和胎儿HCMV感染的研究。中华妇产科杂志 1998；33(9)：529
5 Velzing J,Rothbarth,Kroes ACM,et al.Detection of cytomegalovirus mRNA and DNA encoding the immediate early gene in peripheral blood leukocytes from immunocompromised patiects.J Med,virol 1994；42：164
(1999-01-27 收稿), http://www.100md.com