流式细胞仪在小鼠造血干细胞基因转移效率测定中的应用
作者：王存邦 达万明 钱其军 魏亚明 白海
单位：兰州军区总医院血液科730050
关键词：流式细胞术；造血干细胞；基因转移；细胞活素类
中国激光医学杂志990213摘要：目的：探讨流式细胞仪在造血干细胞基因转移效率测定中的应用价值。
方法：以干细胞因子(SCF)、白细胞介素(IL)-3、IL-6单独或联合作用(SCF/IL-3、SCF/IL-6、IL-3/IL-6、SCF/IL-3/IL-6)后的Balb/c小鼠造血干细胞作为靶细胞，应用含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的逆转录病毒载体GCGPXSN介导的基因转移技术实施基因转移，采用FACS型流式细胞仪测定基因转移效率。
结果：病毒上清转染的阳性对照组基因转移率为0.06%，以不同细胞因子作用后基因转移效率提高至0.07%～0.20%，细胞因子作用前后比较，除SCF/IL-6组外，差异均有显著或非常显著意义(P<0.05或P<0.01)。其中以SCF/IL-3组与SCF/IL-3/IL-6组的提高最为明显，均达0.20%，与其他各细胞因子组比较，差异也有非常显著意义(P<0.01)。
结论：应用流式细胞仪可测定出SCF、IL-3、IL-6单独或联合作用对小鼠造血干细胞基因转移效率的不同影响，具有快速、方便、准确的优点。
Application of Flow Cytometry in Determination of the Efficiency of Gene Transfer into Mouse Hematopoietic Stem Cells
WANG Cunbang, DA Wanming, QIAN Qijun, WEI Yaming, BAI Hai
Department of Hematology, Lanzhou General Hospital of PLA, Lanzhou 730050
ABSTRACT Objecctive To explore the value of flow cytometry technique in determination of gene transfer efficiency.
Methods Balb/c mouse hematopoietic stem cells were treated with SCF, IL-3，IL-6 separately or in combination. Then gene transfer mediated by retroviral vector containing GFP and Neo gene was made. The efficiency of gene transfer was determined by flow cytometry.
Results Gene transfer efficiency of positive control group is 0.06%. The experiment groups using some cytokine may rise to 0.07%-0.20%. There is a significant difference (P<0.05 or P<0.01) between the experiment groups except SCF/IL-6 group and positive control group. SCF/IL-3 group and SCF/IL-3/IL-6 group may enhance gene transfer efficiency to 0.20%, showing a very significant difference (P<0.01) comparison with other experiment groups.
Conclusions The use of cytokine may enhance gene transfer efficiency of mouse hematopoietic stem cells. Flow cytometry has many
advantages than other methods, such as fast, convenient performance and accurate measurement.
Key words Flow cytometry; Hematopoietic stem cells; Gene transfer; Cytokines
目前基因转移技术中常采用新霉素磷酸转移酶基因(neo gene)作为标记基因。这种标记基因需用G 418来进行筛选，筛选周期较长，且造血干细胞基因转移效率测定方法繁琐，临床应用有所不便。绿色荧光蛋白(GFP)基因来源于Aequorea Victoria水母，这种基因表达的蛋白能在紫外或蓝光激发下发射出绿色荧光，类似异硫氰酸荧光素(FITC)。GFP基因在哺乳动物细胞内的表达可通过荧光显微镜进行观察，并可直接经流式细胞仪进行测定及分选[1,2]。鉴于此，我们应用含有GFP基因的逆转录病毒载体GCGPXSN介导的基因转移技术，采用流式细胞仪测定干细胞因子(SCF)、白细胞介素(IL)-3、IL-6单独或联合作用后小鼠造血干细胞基因转移效率，探讨流式细胞仪在造血干细胞基因转移效率测定中的应用价值。
材料和方法
1.包装细胞系及细胞因子 已转染逆转录病毒载体GCGPXSN且经G 418筛选到的产生高滴度病毒的包装细胞株PA 317-PCGPXSN及检测病毒滴度的细胞株NIH3T3均由第二军医大学东方肝胆外科医院惠赠。重组人(rh)IL-3、rhIL-6由日本Kirin公司惠赠，重组鼠(rm)SCF由军事医学科学院沈倍奋教授惠赠。
2.病毒滴度测定[3] 将长满单层的抗性PA 317-PCGPXSN包装细胞按1∶3传代，用不含G 418的培养液置37℃、5% CO2培养箱培养48 h，当细胞达70%～80%汇合后，弃上清，换用新鲜的完全培养基，置37℃、5% CO2培养箱培养24 h后，收集培养液上清。将7.5×105个NIH3T3细胞接种于9 cm细胞培养皿中培养24 h后，加20 μl病毒上清及终浓度为8 μg/ml的polybrene，培养2 h后去除病毒上清及polybrene，加入新鲜培养液。24 h后加入G 418筛选。以后每4天换液1次，14天后进行克隆计数。病毒滴度以集落形成单位(CFU)/ml表示。
3.基因转移实验分组 处死Balb/c小鼠(购自兰州生物制品研究所)，取股骨以DMEM培养基冲出骨髓细胞，制备成2×106/ml的细胞悬液。骨髓细胞培养体系为20%胎牛血清(FCS)+DMEM。在37℃、5% CO2培养箱培养24 h，离心弃上清后分9组：1组为阴性对照，加入新鲜DMEM完全培养基；1组为阳性对照，加入病毒上清4 ml、polybrene 8 μg/ml和20%FCS；另7组为阳性对照基础上再分别加入单一细胞因子或以不同组合方式加入细胞因子(IL-3、IL-6终浓度为200 U/ml，SCF终浓度为100 ng/ml)。再继续培养24 h，收集细胞用FACS型流式细胞仪检测基因转移效率。
4.基因转移效率测定 将上述完成基因转移工作的骨髓细胞制备成2×106/ml的细胞悬液，参照检测FITC的常规方法(激发光波长475 nm，发射波长490 nm)，调整流式细胞仪工作条件至绿色荧光(FL)-1，按1～9组分别获取细胞，每组获取细胞总数10 000个。基因转移效率计算公式为：基因转移效率(%)=实验组测定值(%)-阴性对照组测定值(%)。式中测定值是指流式细胞仪测出的含荧光细胞占总获取细胞的百分率。
5.统计学处理 用 χ2 检验进行统计学处理。
结果
1.病毒上清滴度 本组制备的病毒上清，病毒滴度为1.9×105 CFU/ml。
2.基因转移效率 经流式细胞术测定，病毒上清转染的阳性对照组基因转移率为0.06%，以不同细胞因子作用后，基因转移效率提高至0.07%～0.20%(表1)，细胞因子作用前后比较，除SCF/IL-6组外，差异均有显著或非常显著意义(P<0.05或P<0.01)。以SCF/IL-3组与SCF/IL-3/IL-6联合组基因转移效率的提高最为明显，均为0.20%，与其他
表1 用流式细胞仪测定的各组小鼠造血干细胞
基因转移效率
Tab.1 The gene transfer efficiency of mouse hematopoietic
stem cells determined by flow cytometry 组别
Groups
测定值
Determined
values
(%)
基因转移
效率
Gene transfer
efficiency
(%)
与阳性对照组
比较χ2值
χ2 value(Compared
with positive
control group)
阴性对照
Negative control
0.05
-
阳性对照
Positive control
0.11
0.06
2.446
SCF
0.16
0.11
6.438*
IL-3
0.14
0.09
4.711*
IL-6
0.17
0.12
7.354**
SCF/IL-3
0.25
0.20
15.686**
SCF/IL-6
0.12
0.07
3.150
IL-3/IL-6
0.14
0.09
4.711*
SCF/IL-3/IL-6
0.25
0.20
15.686**
注：各组细胞数均为10 000个 n=10 000 in each group *P<0.05 **P<0.01
细胞因子组比较，差异有非常显著意义(P<0.01)。
讨论
已知造血干细胞大多数处于静止期。应用某些细胞因子可使其进入增殖期，提高逆转录病毒载体介导的造血干细胞基因转移效率[4]。SCF、IL-3、IL-6可不同程度地作用于造血干细胞和多能造血祖细胞，促进其增殖，且SCF与IL-3可协同刺激多能造血祖细胞生长[5]。我们已往的实验证明SCF、IL-3、IL-6单独或联合应用对基因转移效率的影响不同。根据上述特点，本实验研究中采用流式细胞仪，测定了SCF、IL-3、IL-6单独或联合应用对基因转移效率的影响。结果显示，阳性对照组转移率为0.06%，SCF、IL-3、IL-6单用及IL-3/IL-6联合应用可使基因转移效率提高至0.07%～0.12%，与阳性对照组比较差异有显著意义(P<0.05)；而SCF/IL-3及SCF/IL-3/IL-6联合应用可使转移效率进一步提高，达到0.20%，差异有非常显著意义(P<0.01)。此结果与在完全相同实验条件下应用经典方法测定的基因转移效率的实验结果[6]相一致，提示应用流式细胞仪可测定出SCF、IL-3、IL-6单独或联合作用对小鼠造血干细胞基因转移效率的不同影响，测定方法较经典方法快速、简便、准确，且能测定出不同实验条件下基因转移效率的微小差别。
本实验用流式细胞术获取的细胞中，造血干细胞和多能造血祖细胞仅占极少数，而外源基因只有可能转入这部分在细胞因子作用下处于增殖分化期的细胞及少数尚处于分化之中的未成熟细胞，占绝大多数的分化结束的成熟细胞中并不能转入外源基因，因此测定值偏低，如考虑到这一因素，则真正的转移率可能并不低。
从本研究所得结果可以看到，逆转录病毒载体GCGPXSN由于含有GFP基因，较之经典的逆转录病毒载体，具有很大的优越性。首先，它不需要在体外进行长时间培养；其次，它不需要药物处理；第三，可以应用流式细胞仪测定基因转移效率，在体外及体内观察转染基因后细胞特征的变化情况；第四，可以应用流式细胞术筛选到目的基因高表达的细胞。应用流式细胞仪测定逆转录病毒载体GCGPXSN介导的造血干细胞基因转移效率，与经典的逆转录病毒载体介导的造血干细胞基因转移效率测定方法相比较，具有快速、方便、准确的优点。 参考文献
[1] Chalfie M, Tu YT, Euskirchen G, et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science, 1994, 263:802-805.
[2] Kain SR, Adams M, Kondepudi A, et al. Green fluorescent protein as a reporter of gene expression and protein localization. Biotechniques, 1995, 19:650-655.
[3] Miller AD, Law MF, Verma IM. Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene. Mol Cell Biol, 1985, 5:431-437.
[4] Correll PH, Colilla S, Karlsson S. Retroviral vector design for long-term expression in murine hematopoietic cells in vivo. Blood, 1994, 84:1812-1822.
[5] 侯健，王东星，胥军民，主编。人类细胞因子手册。上海：同济大学出版社，1996. 79, 124, 243.
[6] 王存邦，达万明，冀孟菊，等。细胞因子对逆转录病毒载体介导的小鼠造血干细胞基因转移效率的影响。中国实验血液学杂志, 1998, 3：182-186.
收稿日期：1998-03-17