乳腺癌相关基因和雌激素受体的表达状态及PJCZ30等位基因缺失分析
作者：朱明华 祁文 马福成
单位：
朱明华 第二军医大学病理学教研室(上海，200433)；祁文 新疆伊宁市解放军第11医院；马福成 第四军医大学西京医院病理科
关键词：乳腺肿瘤；相关基因；雌激素受体；免疫组织化学；杂合型丢失
癌症/990238
中图号：R737.9 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(1999)02-0225-02
近几年的研究表明，多种肿瘤基因均与乳腺癌相关，其中以p53、C-erbB-2、BRCA、NM23等较为重要，并作了较为深入的研究。在等位基因杂合型丢失的研究方面，对p53基因的研究最多，其等位基因丢失频率达50%左右。本文对187例临床手术切除标本，分别进行了p53、C-erbB-2、PCNA和雌激素受体表达状态的免疫组化分析，并对42例肿瘤组织的PJCZ30位点基因进行了等位基因杂合型丢失分析，以探讨其与乳腺癌发生的关系及意义。
1 材料和方法
1.1 组织标本
187例乳腺癌组织来源于西京医院病理科1992～1995年间的存档蜡块，10%福尔马林固定，石蜡包埋。42例癌与癌旁乳腺组织取自手术切除新鲜标本，-80℃冻存备用。全部病例均经病理确诊，并按世界卫生组织分类标准进行病理分型。187例乳腺癌中浸润性癌165例(浸润性导管癌138例，浸润性小叶癌27例)，导管内癌14例，小叶内癌8例。124例伴有同侧腋下淋巴结转移。
1.2 免疫组化和亲和组化染色
抗p53蛋白抗体，抗C-erbB-2和抗PCNA抗体均为兔源性多克隆抗体(DaKo公司)，按说明书推荐的稀释度使用。免疫组化染色采用ABC法。雌激素受体采用亲和组织化学，酶标记雌激素购自上海肿瘤医院。已知阳性切片重复染色为阳性对照。PBS缓冲液和正常羊血清替代第一抗体为阴性对照。阳性判断标准：阳性细胞数占25%以上，p53和PCNA以细胞核呈棕黄色为阳性，C-erbB-2以细胞膜呈棕黄色为阳性，雌激素受体以细胞浆和/或细胞核呈棕黄色为阳性。
1.3 PJCZ30等位基因杂合型丢失分析
分别取-80℃冻存标本的癌及癌旁组织各10克，应用蛋白酶K(Sigma)消化，酚-氯仿抽提法提取基因组DNA。各取DNA6μg，应用TaqI(Gibcol)酶切过夜。0.8%琼酯糖凝胶电泳，转印DNA至尼龙膜(Life Science)，按常规固定DNA并预杂交。PJCZ30基因质粒由Fox Chase癌症中心提供，探针标记采用α-[32P] dCTP (Dupont)随机引物延伸法(Amersham)。标记的探针置杂交液中与转印尼龙膜杂交，42℃18小时，洗膜后对KodaK X线底片放射自显影。
2 结果
2.1 免疫组化染色
187例乳腺癌中p53阳性94例(50.3%)，C-erbB-2阳性66例(35.3%)，PCNA阳性87例(46.5%)，ER阳性70例(37.4%)。124例伴有淋巴结转移者p53阳性72例(58.1%)，无转移者63例中p53阳性22例(34.9%)(P<0.05)。在p53阳性的94例中，ER阳性25例(26.6%)，而p53阴性的93例中，ER阳性45例(48.4%)(P<0.05)。p53与C-erbB-2二者同时阳性者44例(23.5%)，其中ER阳性仅9例(20.5%)，44例均伴有淋巴结转移。p53，C-erbB-2和PCNA三种蛋白表达之间无显著关系，而三种蛋白的表达与ER之间呈负相关。
2.2 PJCZ30等位基因杂合型丢失分析
42例中29例为杂合型，占69.0%，在29例杂合型中14例出现等位基因丢失，丢失频率为48.3%(图1)。
图1 Southern杂交，箭头示肿瘤组织pJCZ30
等位基因丢失 (T=肿瘤，N=瘤旁组织)
3 讨论
乳腺癌的确切发病机制仍不完全清楚，除与饮食、生育等因素有关外，还有多种肿瘤基因的参与，其中以肿瘤抑制基因p53的突变和等位基因丢失最为密切〔1～2〕，其频率可达50%左右，如包括p53蛋白过度表达等变化，则可达86%〔2〕。目前已将p53、C-erbB-2和ER的表达状态，作为乳腺癌的临床治疗方法的选择和预后评估的重要指标〔3～7〕。本研究结果表明，在伴有淋巴结转移的乳腺癌病例中，p53阳性率增高，而ER表达减低，在全组病例中，p53与ER阳性率之间呈现负相关关系，p53与C-erbB-2均阳性的病例皆为伴有淋巴结转移者。p53和C-erbB-2可分别或共同与ER作为乳腺癌生物学行为的判断指标，对乳腺癌的治疗方法选择和判断预后具有重要的指导价值。
有关人类乳腺癌的分子遗传学研究，已有的结果表明在23对染色体中有22对均存在不同程度的等位基因丢失，其中主要集中于第1和17对染色体。PJCZ30是位于第6对染色体长臂(6q21)的具有多态性变化的位点基因，Devilee等〔8〕曾对54例乳腺癌进行了等位基因杂合型丢失分析，发现有50%病例出现杂合型丢失，认为该位点可能存在一个与乳腺癌发生关系十分密切的肿瘤抑制基因。本文作者研究了42例乳腺癌的PJCZ30位点基因的变化，在29例为杂合型的病例中，14例出现PJCZ30等位基因丢失，提示该位点的基因变化与乳腺癌存在密切的关系，对其确切的意义需进一步的研究和探讨。
参考文献
1 Hendrix MJC, Muschel RJ. Recent advances in breast cancer research fromgenes to management〔J〕. Am J Pathol,1997， 151：883
2 Varley JM. Loss of chromosome 17p13 sequences and mutation of p53 in human breast carcinomas〔J〕. Oncogene, 1991， 6：413.
3 Mack L, Kerkvliet N, Doig G, et al. Relationship of a new histologicat categorization of ductal carcinoma in situ of the breast with size and the immunohistochemical expression of p53, C-erbB-2, bcl-2, and ki67〔J〕. Hum Pathol, 1997， 28：974.
4 Allred DC, Clark GM, Elledge R, et al. Association of p53 protein expression with tumor cell proliferation rate and clinical outcome in node negative breast cancer〔J〕. J Natl Cancer Inst, 1993， 85：200.
5 Davidoff AM, Herndon JE, Glover NS, et al. Relation between p53 overexpression and established prognostic factors in breast cancer〔J〕. Surgery, 1991， 110：259.
6 Isola J, Visakorpi T, Holli K, et al. Association of overexpression of tumor suppressor protein p53 with rapid cell proliferation and poor prognosis in node-negative breast cancer patients〔J〕. J Natl Cancer Inst, 1992， 84：1109.
7 皋岚湘，丁华野，邓永江，等.乳腺癌组织bcl-2，p53和C-erbB-2蛋白表达和相互关系及意义〔J〕.中华病理学杂志，1996，25：165.
8 Devilee P, Van vliet M, Van sloun P, et al. Allelotype of human breast carcinoma, a second major site for loss of heterozygosity on chromosome 6q〔J〕. Oncogene, 1991， 6：1705.
收稿日期：1998-06-16；修回日期：1998-08-11