复方丹参注射液治疗类风湿性关节炎的实验研究
作者：黄清春沈鹰杨太成田野王捷刘正民孙维峰
单位：广州军医广州总医院中医科，广州市流花路111号(510010)
关键词：关节炎；类风湿性；中药疗法；；超氧化物类；疾病模型；动物
新中医990220 提 要 为了探讨丹参治疗类风湿性关节炎(RA)的作用机理，建立了Ⅱ型胶原诱导性大鼠关节炎模型(CIA)，并进行了自由基、血浆粘度及病理学等方面的研究，结果证实丹参具有调节免疫、激活SOD活性、降低血粘度的作用。
我们用大剂量复方丹参注射液静滴治疗类风湿性关节炎(RA)在临床上取得了较好的疗效〔1.2〕，为了探讨复方丹参的作用机制，我们建立了Ⅱ型胶原诱导性大鼠关节炎模型(CIA)，并进行了丹参治疗前后的自由基、血液流变学与病理学的研究，现报道如下。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验分组 选用120g左右的 wistar大白鼠42只，雌性，随机分为正常对照组7只，造模组7只，造模后28只(盐水组7只，地塞米松组7只，大剂量丹参组7只，小剂量丹参组7只)。
1.2 小牛Ⅱ型胶原的制备 参考国内外文献〔3、4、5〕，并加以适当改进，用胃蛋白酶法，从新鲜小牛关节软骨中提取Ⅱ型胶原蛋白，真空冷冻干燥，-20℃备用。
1.3 CIA 的建立 用0.1M醋酸溶解Ⅱ型胶原蛋白(2mg/ml，4℃，过夜)，再与等量的IFA(sigma公司生产)混合，加入卡介苗(3mg/ml)于冰浴中充分乳化，每只大鼠尾根部多点注射胶原蛋白0.75mg，1周后再次注射相同剂量，以加强免疫。
1.4 方法 造模2周后治疗组开始分组腹腔注射给药。盐水组：生理盐水0.3ml/d；激素组：地塞米松0.075mg/d；大剂量丹参组：0.3ml/d；小剂量丹参组0.15ml/d，连续注射3周，全部动物5周后睛眶及断头取血，断头处死后，取膝、踝关节作病理切片，取左膝膑骨下滑膜组织液氮冷冻，免疫荧光检测。
, 百拇医药
1.5 检测方法 用改良八木国夫法测丙二醛(MDA)；用邻苯三酚自氧化法(上海生物化学研究所提供的SOD试剂盒)测SOD；用全自动粘度分析仪(第四军医大学研制)测全血粘度。
2 结果
2.1 大鼠血清SOD含量 丹参组与对照组、盐水组比较均有显著性差异；MDA含量丹参组与对照组差异显著，与盐水组、地塞米松组无差异。见表1。
表1 各组大鼠血清MDA，SOD含量(
±s) 组别
鼠数
MDA(nmol/l)
SOD(u/ml)
, 百拇医药
SOD/MDA
对照组
7
4.744±0.61
33.2±11.79
6.998
造模组
7
7.157±1.87※
盐水组
7
6.066±1.50
, 百拇医药
19.625±9.60※
3.235
地塞米松组
7
6.714±1.43※
67.528±16.3※△△
10.06※△△
大剂量丹参组
7
6.08±2.21※
49.655±12.3※△
, http://www.100md.com
8.167△△
小剂量丹参组
7
7.827±2.00※
49.921±9.45※△
6.377△△
注：与对照组比较※P<0.01，与盐水组比较△P<0.05△△P<0.01
2.2 大鼠全血粘度 丹参组与对照组、地塞米松组在高切范围有差异，在中切、低切无差异。见表2。
表2 大鼠全血粘度的变化(±s) 组别
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鼠数
高切(200/s)
中切(30/s)
低切(3/s)
对照组
7
4.40±0.56
5.95±0.48
12.40±1.46
地塞米松组
7
4.42±0.23
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5.90±0.30
11.45±1.40
大剂量丹参组
7
4.00±0.20※ △
5.23±0.32
11.40±1.20
注：与对照组比较※P<0.05，与地塞米松组比较△P<0.05
2.3 关节的病理改变 造模组：主要表现为大鼠关节滑膜组织的充血，水肿，滑膜细胞轻度增生，排列不规则，可见大量的淋巴细胞和单核细胞浸润及纤维组织渗出，但未见软骨组织的破坏。发病关节膝关节为 4/7，踝关节为 5/7。盐水组病理变化同造模组。
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丹参组其病理表现为淋巴细胞和纤维组织渗出明显减少，软骨组织完整，关节发病率类似造模组。正常对照组则未见明显滑膜组织炎症改变。
2.4 免疫荧光检测 造模组与各治疗组在大鼠关节滑膜组织中均发现有黄绿色荧光，表明在滑膜组织中有Ⅱ型胶原抗体或抗原抗体复合物的存在。
3 讨论
RA是一种慢性非特异性炎症，早期以关节滑膜的病变为主，后期发生软骨和骨的破坏。本实验在CIA模型中测定的血清内脂质过氧化的终末产物MDA，造模组与对照组比较明显增多，表明在CIA中由于大鼠关节的慢性炎症反应，引起组织和体内的过氧化损伤。
国内有用自由基清除剂，如SOD治疗RA病人的报告。本实验表明，丹参组与地塞米松组均比盐水组SOD含量明显增多。提示丹参与激素对SOD活性有较强的影响。通过激活SOD，加快组织内自由基的清除，起到保护关节滑膜组织免受损害的作用，这可能是丹参治疗RA的机制之一。从丹参的量效关系分析，丹参对SOD的影响与剂量大小无相关性，说明常规剂量亦能起到类似的效果。
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RA在病理过程中伴有的高凝状态可加重关节疼痛、肿胀和功能障碍。现代药理研究发现丹参可改善血液流变性，降低血浆粘度。实验表明，在CIA模型注射丹参3周，在高切范围能显著降低全血粘度，改变高凝状态，从而起到缓解关节炎症的作用。
病理结果表明，注射丹参的治疗组，大鼠关节滑膜的炎症改变明显减轻，淋巴细胞浸润和纤维组织渗出明显减少，但关节发病率与造模组类似，表明丹参对CIA的关节炎症有一定的保护和治疗作用。其机制可能与丹参的药理作用有关。药理研究发现丹参可调节机体的体液免疫和细胞免疫功能，可使SLE血中的抗核抗体、IgG水平下降，通过调节免疫，达到抗炎目的。在造模组及治疗组滑膜组织中检测出抗原抗体或抗原抗体复合物，也证实了CIA与人类RA的类似性。
参考文献
1 沈 鹰，刘正民，黄清春，等.中西医结合治疗类风湿性关节炎27例.中国中西医结合杂志，1994，14(10)∶630
, 百拇医药
2 黄清春，沈 鹰，刘正民，等.复方丹参治疗类风湿性关节炎的临床研究.中医研究，1996，9(5)∶20
3 Williams，et al.Anti-type Ⅱ collagen ELISA Increased disease Specificity following removed of anionic contaminants from selffractionated Ⅱ collagen.J Immuno Meth，1992，147∶93
4 王安民，吕爱萍，曾晓莲.大鼠实验性痹证模型建立与其病理学研究.中华中医骨伤科杂志，1988，4(2)∶8
5 肖长虹，顾为望，李留洋，等.类风湿性关节炎风寒湿痹与风湿热痹模型的研究.中医杂志，1996，37(6)∶361
(修回日期：1998-03-02), 百拇医药
单位：广州军医广州总医院中医科，广州市流花路111号(510010)
关键词：关节炎；类风湿性；中药疗法；；超氧化物类；疾病模型；动物
新中医990220 提 要 为了探讨丹参治疗类风湿性关节炎(RA)的作用机理，建立了Ⅱ型胶原诱导性大鼠关节炎模型(CIA)，并进行了自由基、血浆粘度及病理学等方面的研究，结果证实丹参具有调节免疫、激活SOD活性、降低血粘度的作用。
我们用大剂量复方丹参注射液静滴治疗类风湿性关节炎(RA)在临床上取得了较好的疗效〔1.2〕，为了探讨复方丹参的作用机制，我们建立了Ⅱ型胶原诱导性大鼠关节炎模型(CIA)，并进行了丹参治疗前后的自由基、血液流变学与病理学的研究，现报道如下。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验分组 选用120g左右的 wistar大白鼠42只，雌性，随机分为正常对照组7只，造模组7只，造模后28只(盐水组7只，地塞米松组7只，大剂量丹参组7只，小剂量丹参组7只)。
1.2 小牛Ⅱ型胶原的制备 参考国内外文献〔3、4、5〕，并加以适当改进，用胃蛋白酶法，从新鲜小牛关节软骨中提取Ⅱ型胶原蛋白，真空冷冻干燥，-20℃备用。
1.3 CIA 的建立 用0.1M醋酸溶解Ⅱ型胶原蛋白(2mg/ml，4℃，过夜)，再与等量的IFA(sigma公司生产)混合，加入卡介苗(3mg/ml)于冰浴中充分乳化，每只大鼠尾根部多点注射胶原蛋白0.75mg，1周后再次注射相同剂量，以加强免疫。
1.4 方法 造模2周后治疗组开始分组腹腔注射给药。盐水组：生理盐水0.3ml/d；激素组：地塞米松0.075mg/d；大剂量丹参组：0.3ml/d；小剂量丹参组0.15ml/d，连续注射3周，全部动物5周后睛眶及断头取血，断头处死后，取膝、踝关节作病理切片，取左膝膑骨下滑膜组织液氮冷冻，免疫荧光检测。
, 百拇医药
1.5 检测方法 用改良八木国夫法测丙二醛(MDA)；用邻苯三酚自氧化法(上海生物化学研究所提供的SOD试剂盒)测SOD；用全自动粘度分析仪(第四军医大学研制)测全血粘度。
2 结果
2.1 大鼠血清SOD含量 丹参组与对照组、盐水组比较均有显著性差异；MDA含量丹参组与对照组差异显著，与盐水组、地塞米松组无差异。见表1。
表1 各组大鼠血清MDA，SOD含量(
±s) 组别鼠数
MDA(nmol/l)
SOD(u/ml)
, 百拇医药
SOD/MDA
对照组
7
4.744±0.61
33.2±11.79
6.998
造模组
7
7.157±1.87※
盐水组
7
6.066±1.50
, 百拇医药
19.625±9.60※
3.235
地塞米松组
7
6.714±1.43※
67.528±16.3※△△
10.06※△△
大剂量丹参组
7
6.08±2.21※
49.655±12.3※△
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8.167△△
小剂量丹参组
7
7.827±2.00※
49.921±9.45※△
6.377△△
注：与对照组比较※P<0.01，与盐水组比较△P<0.05△△P<0.01
2.2 大鼠全血粘度 丹参组与对照组、地塞米松组在高切范围有差异，在中切、低切无差异。见表2。
表2 大鼠全血粘度的变化(
±s) 组别, http://www.100md.com
鼠数
高切(200/s)
中切(30/s)
低切(3/s)
对照组
7
4.40±0.56
5.95±0.48
12.40±1.46
地塞米松组
7
4.42±0.23
, http://www.100md.com
5.90±0.30
11.45±1.40
大剂量丹参组
7
4.00±0.20※ △
5.23±0.32
11.40±1.20
注：与对照组比较※P<0.05，与地塞米松组比较△P<0.05
2.3 关节的病理改变 造模组：主要表现为大鼠关节滑膜组织的充血，水肿，滑膜细胞轻度增生，排列不规则，可见大量的淋巴细胞和单核细胞浸润及纤维组织渗出，但未见软骨组织的破坏。发病关节膝关节为 4/7，踝关节为 5/7。盐水组病理变化同造模组。
, http://www.100md.com
丹参组其病理表现为淋巴细胞和纤维组织渗出明显减少，软骨组织完整，关节发病率类似造模组。正常对照组则未见明显滑膜组织炎症改变。
2.4 免疫荧光检测 造模组与各治疗组在大鼠关节滑膜组织中均发现有黄绿色荧光，表明在滑膜组织中有Ⅱ型胶原抗体或抗原抗体复合物的存在。
3 讨论
RA是一种慢性非特异性炎症，早期以关节滑膜的病变为主，后期发生软骨和骨的破坏。本实验在CIA模型中测定的血清内脂质过氧化的终末产物MDA，造模组与对照组比较明显增多，表明在CIA中由于大鼠关节的慢性炎症反应，引起组织和体内的过氧化损伤。
国内有用自由基清除剂，如SOD治疗RA病人的报告。本实验表明，丹参组与地塞米松组均比盐水组SOD含量明显增多。提示丹参与激素对SOD活性有较强的影响。通过激活SOD，加快组织内自由基的清除，起到保护关节滑膜组织免受损害的作用，这可能是丹参治疗RA的机制之一。从丹参的量效关系分析，丹参对SOD的影响与剂量大小无相关性，说明常规剂量亦能起到类似的效果。
, http://www.100md.com
RA在病理过程中伴有的高凝状态可加重关节疼痛、肿胀和功能障碍。现代药理研究发现丹参可改善血液流变性，降低血浆粘度。实验表明，在CIA模型注射丹参3周，在高切范围能显著降低全血粘度，改变高凝状态，从而起到缓解关节炎症的作用。
病理结果表明，注射丹参的治疗组，大鼠关节滑膜的炎症改变明显减轻，淋巴细胞浸润和纤维组织渗出明显减少，但关节发病率与造模组类似，表明丹参对CIA的关节炎症有一定的保护和治疗作用。其机制可能与丹参的药理作用有关。药理研究发现丹参可调节机体的体液免疫和细胞免疫功能，可使SLE血中的抗核抗体、IgG水平下降，通过调节免疫，达到抗炎目的。在造模组及治疗组滑膜组织中检测出抗原抗体或抗原抗体复合物，也证实了CIA与人类RA的类似性。
参考文献
1 沈 鹰，刘正民，黄清春，等.中西医结合治疗类风湿性关节炎27例.中国中西医结合杂志，1994，14(10)∶630
, 百拇医药
2 黄清春，沈 鹰，刘正民，等.复方丹参治疗类风湿性关节炎的临床研究.中医研究，1996，9(5)∶20
3 Williams，et al.Anti-type Ⅱ collagen ELISA Increased disease Specificity following removed of anionic contaminants from selffractionated Ⅱ collagen.J Immuno Meth，1992，147∶93
4 王安民，吕爱萍，曾晓莲.大鼠实验性痹证模型建立与其病理学研究.中华中医骨伤科杂志，1988，4(2)∶8
5 肖长虹，顾为望，李留洋，等.类风湿性关节炎风寒湿痹与风湿热痹模型的研究.中医杂志，1996，37(6)∶361
(修回日期：1998-03-02), 百拇医药