缺氧性肺血管收缩对兔肺组织药物浓度的影响及对策
作者：王明月 刘 健 吕素华 牟春笋 葛 明 沈德炜 杨力群
单位：250001 济南铁路中心医院
关键词：肺血管收缩；缺氧；肺组织；药物浓度
中国微循环990208
【摘要】 目的 探讨慢性心衰时是否有心肌细胞凋亡。方法 利用末端转移酶介导的切口末端标记法(TUNEL)及TEM法，检测慢性压力负荷性心衰大鼠左、右心室心肌的凋亡细胞。结果 在心衰大鼠的左、右心室心肌组织中存在有凋亡的心肌细胞，而在对照组大鼠心肌组织中未见到心肌细胞调亡。结论 慢性心衰与心肌凋亡之间有紧密联系。
Study on Cardiac Myocyte Apoptosis in Rats with Pressure Overload-induced Chronic Heart Failure
, http://www.100md.com
Xing Hongtao，Bai Shuling，Zhang Liying
Department of Pathology，Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College，Shenyang 110024
【Abstact】 Objective To discuss the presence of apoptosis during chronic heart failure.Methods left and right ventricular myocardium of rats with chronic heart failure was used to study apoptosis by TUNEL and TEM methods.Results Apoptosis was detected in the myocardium of failing hearts of rats.No apoptosis was found in myocardium of rats in control group.Conclusion There exists close relationship between apoptosis and chronic heart failure.
, http://www.100md.com
【Key words】 Apoptosis Chronic heart failure Rats TUNEL
细胞凋亡(apoptosis)是细胞死亡的一种特殊形式，又称为细胞的程序性死亡(PCD)。它不同于细胞坏死，是一系列基因调控的细胞学过程，常采用TUNEL法辅以电泳或电镜技术来诊断细胞凋亡[1]。由于细胞凋亡在疾病的发生及发展过程中的作用并不十分明确，因而是近年来研究的热点。
人们注意到在心脏病时有心肌细胞凋亡，并证实[2]在心力衰竭的病 人心肌中存在心肌细胞凋亡。心肌细胞凋亡是导致细胞丢失及心 功能障碍的重要原因之一。至于升主动脉缩窄大鼠慢性心衰时是否存在细胞凋亡，目前还未见报导。本研究目的在于：通过对慢性升主动脉缩窄心衰大鼠的左、右心室心肌组织进行凋亡细胞的检测，从而揭示心肌细胞凋亡在慢性心衰时是否存在及其存在的意义。
材料和方法
, http://www.100md.com
1 慢性心衰动物模型的制备
取健康雌性Wistar鼠10只，体重125～150克。随机分成实验组(5只)，对照组(5只)。动物称重后，按40 mg/kg体重腹腔内戊巴比妥钠麻醉，气管内插管，接小动物呼吸机(潮气量2～3ml，频率90次/分)。开胸，暴露并分离升主动脉，用4号丝线穿过外径1mm，长7mm的泰夫隆塑料管缩窄升主动脉，关胸。对照组Wistar鼠只分离升主动脉，不进行缩窄。
2 心功能检测
经手术缩窄的大鼠在术后3～5个月内出现不同程度的呼吸困难、喘鸣、口唇发绀及活动下降等表现，参照Siri[3]等人的方法进行心功能检测。其中包括测定右颈总动脉血流量、主动脉插管测定左心室压力及dp/dt.
3 取材及标本的制备
, http://www.100md.com 将经心功能检测后确认为心衰的大鼠及对照组鼠以腹腔内戊巴比妥钠麻醉(40mg/kgBW)，开胸，取出心脏，将左心室、右心室心肌分别固定于10%福尔马林溶液及1.5%戊二醛固定液内。
4 心肌细胞凋亡的检测
采用TdT介导的dUTP缺口未端标记法。检测药物由北京医科大学分子病理学实验室提供。将10%福尔马林固定标本行石蜡包埋，连续切片，厚4μm。切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精入水。TdT buffer，Did-dNTP及TdT混合液作用1.5～2小时，Dig buffer Ⅰ作用10分钟，Anti-dig抗体37℃下作用30分钟，Dig buffer Ⅰ作用10分钟，Dig buffer Ⅲ作用10钟，NBT+BCIP显色30分钟。水洗，甘油明胶封片，光镜下观察。
阴性对照片用PBS代替TdT buffer，Did-dNTP 及TdT 混合液。
, 百拇医药
5 透射电镜标本制备及观察
将用1.5%戊二醛固定的心肌组织经1%锇酸后固定2小时，系列酒精脱水，Epon812包埋，超薄切片，TEM下观察细胞超微结构。
结 果
从心功能检测结果可知，心衰组大鼠左心室收缩压下降了25.3%，舒张末期压上升了263.4%，左心室+dp/dt及-dp/dt分别下降了42.3%及45.3%，右颈总动脉血流量也下降了25.1%，所有差异都具有显著性(P<0.01)。
心衰鼠左、右心室心肌组织内可见有零星存在的凋亡细胞，其周围心肌细胞的大小及形态均正常(图1，2)
, http://www.100md.com
图1 实验组大鼠右心室心肌细胞凋亡染色(TUNEL) ×400箭头： 凋亡细胞
图2 实验组大鼠左心室心肌细胞凋亡染色(TUNEL) ×400箭头： 凋亡细胞
TEM下可见心衰鼠左、右心室心肌组织内有凋亡细胞存在，细胞核不规则，核内染色质边集，胞膜完整，细胞器结构无破坏，而对照组动物左、右心室心肌组织TEM下未见有凋亡细胞(图3，4，5，6)。
图3 对照组大鼠右心室心肌细胞TEM ×8000
图4 对照组大鼠左心室心肌细胞TEM ×8000
, http://www.100md.com
图5 心衰组大鼠右心室心肌细胞TEM，核染色质边集 ×12000
图6 心衰组大鼠左心室心肌细胞TEM，核染色质边集 ×10000
讨 论
细胞死亡有两 种主要机制：细胞凋亡和细胞坏死。细胞凋亡是指细胞发生的程序性死亡，是细胞的生理性死亡。它是一种主动过程，表现为细胞缩小，核染色质浓缩和边集，细胞骨架解体，核DNA断裂，凋亡小体形成，聚丙烯酰胺凝胶电泳时出现阶梯样电泳条带[4]。
细胞坏死是细胞的病理性死亡，是以细胞内器官的破坏、细胞肿胀、细胞膜破裂及细胞内容物溢出引起炎症反应为特征的[5]。一般情况下细胞凋亡不会发生在终分化细胞诸如心肌细胞及神经细胞上，凋亡的细胞最终将被巨噬细胞或相邻的细胞所吞噬[6]。
, 百拇医药
心肌对压力性负荷的反应是心肌细胞的肥大及非肌细胞的增生[7]，而心肌在失代偿情况下心功能减弱除了与细胞骨架蛋白改变等因素有关外，是否还与细胞凋亡有关呢？Oscar[8]的假说认为：在压力负荷性慢性心衰发生时，细胞凋亡可能是其发生机制之一。我们观察到在慢性压力负荷性心衰大鼠左、右心室心肌组织中都有凋亡细胞存在。由于凋亡发生非常迅速，组织切片中只能捕捉到零星存在的凋亡细胞。虽然凋亡细胞的数目很少，但确提示我们在心衰发生的过程中的确有心肌细胞凋亡的发生，其深刻意义尚待进一步研究。引发细胞凋亡的机制也是很复杂的，可能是各种因素综合作用的结果，这方面也需要从更深入的角度去探讨。
对照组动物左、右心室心肌组织内未发现凋亡的心肌细胞。Shrov[9]等在研究慢性心衰狗的心肌细胞凋亡时发现：对照组动物心肌组织中无心肌细胞凋亡发生。还有的学者[10]证实在正常兔的心肌组织中无细胞凋亡。由于我们实验观察的两组动物左右心室的心肌细胞凋亡数量是有显著性差异的 ，因而有重要的理论意义和临床应用价值。
, 百拇医药
我们的研究结果表明，在压力负荷性慢性心衰发生过程中，心肌细胞凋亡可能是一个重要的调节机制，它也是导致心衰时细胞丢失的主要原因之一。现已有文献报导细胞凋亡可被生长因子或细胞激酶所调控，也可被Bcl2及Bax基因所调控[11]。今后的进一步研究旨在探索防止凋亡发生和发展的方法，减少细胞的丢失，进而阻止或延缓心功能障碍的发展与恶化，这也是研究如何防治心力衰竭的新课题。
参考文献
1 Yael G.Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragementation.J Cell Biol.1992，119(3)：493
2 Hament PL，Richard TV，Dam E，et al.Apoptosis in target organs of hypertension.Hypertension.1995，26：642
, 百拇医药
3 Siri FM，Nordin C，Factor SM，et al.Compensatory hypertrophy and failure in gradual pressure -overloaded guinea pig heart. Am J
Physiol 1989，(Heart Circ.Physiol.26)H1016～H1024
4 郭玉庆，朱兆华，黎锦芸.细胞凋亡的检测方法.国外医学内科分册.1997，24(7)：145
5 Searle J，Kerr JFR，Bishop CJ.Necrosis and apoptosis：distinct models of cell death with fundamentally different significance.Pathol Annu.1982，17：229
, http://www.100md.com
6 Narula J，Haider N，Virmani R，et al.Apoptosis in myocytes in end-stage heart failure. N Eng1 J Med.1996，17：1182
7 Korecky B，Rakusan K.Normal and hypertrophic growth of the rat heart：change in cell dimensions and number.Am J Physiol.1978，3(2)：H123
8 Oscar HLB.Hypothesis：Apoptosis may be a mechanism for the transition to heart failure with chronic pressure overload.J Mol Cell Cardiol.1994，26：943
, http://www.100md.com 9 Sharov VG，Sabbah HN，Shimoyama H，et al.Evidence of cardiocyte apoptosis in myocardium of dogs with chronic heart failure.Am J Pathol.1996，148(1)：141
10 Gottlieb RA，Burleson KO，Kloner RA，et al.Reperfusion injury induces apoptosis in rabbit cardiomyocytes.J Clin Invest.1994，94：1621
11 Olivelti G，Abbi R，Quaini F，et al.Apoptosis in the failing human heart.N Engl J Med.1997，336(16)：1131
收稿： 1998-08-17 修回： 1998-11-03, 百拇医药
单位：250001 济南铁路中心医院
关键词：肺血管收缩；缺氧；肺组织；药物浓度
中国微循环990208
【摘要】 目的 探讨慢性心衰时是否有心肌细胞凋亡。方法 利用末端转移酶介导的切口末端标记法(TUNEL)及TEM法，检测慢性压力负荷性心衰大鼠左、右心室心肌的凋亡细胞。结果 在心衰大鼠的左、右心室心肌组织中存在有凋亡的心肌细胞，而在对照组大鼠心肌组织中未见到心肌细胞调亡。结论 慢性心衰与心肌凋亡之间有紧密联系。
Study on Cardiac Myocyte Apoptosis in Rats with Pressure Overload-induced Chronic Heart Failure
, http://www.100md.com
Xing Hongtao，Bai Shuling，Zhang Liying
Department of Pathology，Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College，Shenyang 110024
【Abstact】 Objective To discuss the presence of apoptosis during chronic heart failure.Methods left and right ventricular myocardium of rats with chronic heart failure was used to study apoptosis by TUNEL and TEM methods.Results Apoptosis was detected in the myocardium of failing hearts of rats.No apoptosis was found in myocardium of rats in control group.Conclusion There exists close relationship between apoptosis and chronic heart failure.
, http://www.100md.com
【Key words】 Apoptosis Chronic heart failure Rats TUNEL
细胞凋亡(apoptosis)是细胞死亡的一种特殊形式，又称为细胞的程序性死亡(PCD)。它不同于细胞坏死，是一系列基因调控的细胞学过程，常采用TUNEL法辅以电泳或电镜技术来诊断细胞凋亡[1]。由于细胞凋亡在疾病的发生及发展过程中的作用并不十分明确，因而是近年来研究的热点。
人们注意到在心脏病时有心肌细胞凋亡，并证实[2]在心力衰竭的病 人心肌中存在心肌细胞凋亡。心肌细胞凋亡是导致细胞丢失及心 功能障碍的重要原因之一。至于升主动脉缩窄大鼠慢性心衰时是否存在细胞凋亡，目前还未见报导。本研究目的在于：通过对慢性升主动脉缩窄心衰大鼠的左、右心室心肌组织进行凋亡细胞的检测，从而揭示心肌细胞凋亡在慢性心衰时是否存在及其存在的意义。
材料和方法
, http://www.100md.com
1 慢性心衰动物模型的制备
取健康雌性Wistar鼠10只，体重125～150克。随机分成实验组(5只)，对照组(5只)。动物称重后，按40 mg/kg体重腹腔内戊巴比妥钠麻醉，气管内插管，接小动物呼吸机(潮气量2～3ml，频率90次/分)。开胸，暴露并分离升主动脉，用4号丝线穿过外径1mm，长7mm的泰夫隆塑料管缩窄升主动脉，关胸。对照组Wistar鼠只分离升主动脉，不进行缩窄。
2 心功能检测
经手术缩窄的大鼠在术后3～5个月内出现不同程度的呼吸困难、喘鸣、口唇发绀及活动下降等表现，参照Siri[3]等人的方法进行心功能检测。其中包括测定右颈总动脉血流量、主动脉插管测定左心室压力及dp/dt.
3 取材及标本的制备
, http://www.100md.com 将经心功能检测后确认为心衰的大鼠及对照组鼠以腹腔内戊巴比妥钠麻醉(40mg/kgBW)，开胸，取出心脏，将左心室、右心室心肌分别固定于10%福尔马林溶液及1.5%戊二醛固定液内。
4 心肌细胞凋亡的检测
采用TdT介导的dUTP缺口未端标记法。检测药物由北京医科大学分子病理学实验室提供。将10%福尔马林固定标本行石蜡包埋，连续切片，厚4μm。切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精入水。TdT buffer，Did-dNTP及TdT混合液作用1.5～2小时，Dig buffer Ⅰ作用10分钟，Anti-dig抗体37℃下作用30分钟，Dig buffer Ⅰ作用10分钟，Dig buffer Ⅲ作用10钟，NBT+BCIP显色30分钟。水洗，甘油明胶封片，光镜下观察。
阴性对照片用PBS代替TdT buffer，Did-dNTP 及TdT 混合液。
, 百拇医药
5 透射电镜标本制备及观察
将用1.5%戊二醛固定的心肌组织经1%锇酸后固定2小时，系列酒精脱水，Epon812包埋，超薄切片，TEM下观察细胞超微结构。
结 果
从心功能检测结果可知，心衰组大鼠左心室收缩压下降了25.3%，舒张末期压上升了263.4%，左心室+dp/dt及-dp/dt分别下降了42.3%及45.3%，右颈总动脉血流量也下降了25.1%，所有差异都具有显著性(P<0.01)。
心衰鼠左、右心室心肌组织内可见有零星存在的凋亡细胞，其周围心肌细胞的大小及形态均正常(图1，2)
, http://www.100md.com
图1 实验组大鼠右心室心肌细胞凋亡染色(TUNEL) ×400箭头： 凋亡细胞
图2 实验组大鼠左心室心肌细胞凋亡染色(TUNEL) ×400箭头： 凋亡细胞
TEM下可见心衰鼠左、右心室心肌组织内有凋亡细胞存在，细胞核不规则，核内染色质边集，胞膜完整，细胞器结构无破坏，而对照组动物左、右心室心肌组织TEM下未见有凋亡细胞(图3，4，5，6)。
图3 对照组大鼠右心室心肌细胞TEM ×8000
图4 对照组大鼠左心室心肌细胞TEM ×8000
, http://www.100md.com
图5 心衰组大鼠右心室心肌细胞TEM，核染色质边集 ×12000
图6 心衰组大鼠左心室心肌细胞TEM，核染色质边集 ×10000
讨 论
细胞死亡有两 种主要机制：细胞凋亡和细胞坏死。细胞凋亡是指细胞发生的程序性死亡，是细胞的生理性死亡。它是一种主动过程，表现为细胞缩小，核染色质浓缩和边集，细胞骨架解体，核DNA断裂，凋亡小体形成，聚丙烯酰胺凝胶电泳时出现阶梯样电泳条带[4]。
细胞坏死是细胞的病理性死亡，是以细胞内器官的破坏、细胞肿胀、细胞膜破裂及细胞内容物溢出引起炎症反应为特征的[5]。一般情况下细胞凋亡不会发生在终分化细胞诸如心肌细胞及神经细胞上，凋亡的细胞最终将被巨噬细胞或相邻的细胞所吞噬[6]。
, 百拇医药
心肌对压力性负荷的反应是心肌细胞的肥大及非肌细胞的增生[7]，而心肌在失代偿情况下心功能减弱除了与细胞骨架蛋白改变等因素有关外，是否还与细胞凋亡有关呢？Oscar[8]的假说认为：在压力负荷性慢性心衰发生时，细胞凋亡可能是其发生机制之一。我们观察到在慢性压力负荷性心衰大鼠左、右心室心肌组织中都有凋亡细胞存在。由于凋亡发生非常迅速，组织切片中只能捕捉到零星存在的凋亡细胞。虽然凋亡细胞的数目很少，但确提示我们在心衰发生的过程中的确有心肌细胞凋亡的发生，其深刻意义尚待进一步研究。引发细胞凋亡的机制也是很复杂的，可能是各种因素综合作用的结果，这方面也需要从更深入的角度去探讨。
对照组动物左、右心室心肌组织内未发现凋亡的心肌细胞。Shrov[9]等在研究慢性心衰狗的心肌细胞凋亡时发现：对照组动物心肌组织中无心肌细胞凋亡发生。还有的学者[10]证实在正常兔的心肌组织中无细胞凋亡。由于我们实验观察的两组动物左右心室的心肌细胞凋亡数量是有显著性差异的 ，因而有重要的理论意义和临床应用价值。
, 百拇医药
我们的研究结果表明，在压力负荷性慢性心衰发生过程中，心肌细胞凋亡可能是一个重要的调节机制，它也是导致心衰时细胞丢失的主要原因之一。现已有文献报导细胞凋亡可被生长因子或细胞激酶所调控，也可被Bcl2及Bax基因所调控[11]。今后的进一步研究旨在探索防止凋亡发生和发展的方法，减少细胞的丢失，进而阻止或延缓心功能障碍的发展与恶化，这也是研究如何防治心力衰竭的新课题。
参考文献
1 Yael G.Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragementation.J Cell Biol.1992，119(3)：493
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, 百拇医药
3 Siri FM，Nordin C，Factor SM，et al.Compensatory hypertrophy and failure in gradual pressure -overloaded guinea pig heart. Am J
Physiol 1989，(Heart Circ.Physiol.26)H1016～H1024
4 郭玉庆，朱兆华，黎锦芸.细胞凋亡的检测方法.国外医学内科分册.1997，24(7)：145
5 Searle J，Kerr JFR，Bishop CJ.Necrosis and apoptosis：distinct models of cell death with fundamentally different significance.Pathol Annu.1982，17：229
, http://www.100md.com
6 Narula J，Haider N，Virmani R，et al.Apoptosis in myocytes in end-stage heart failure. N Eng1 J Med.1996，17：1182
7 Korecky B，Rakusan K.Normal and hypertrophic growth of the rat heart：change in cell dimensions and number.Am J Physiol.1978，3(2)：H123
8 Oscar HLB.Hypothesis：Apoptosis may be a mechanism for the transition to heart failure with chronic pressure overload.J Mol Cell Cardiol.1994，26：943
, http://www.100md.com 9 Sharov VG，Sabbah HN，Shimoyama H，et al.Evidence of cardiocyte apoptosis in myocardium of dogs with chronic heart failure.Am J Pathol.1996，148(1)：141
10 Gottlieb RA，Burleson KO，Kloner RA，et al.Reperfusion injury induces apoptosis in rabbit cardiomyocytes.J Clin Invest.1994，94：1621
11 Olivelti G，Abbi R，Quaini F，et al.Apoptosis in the failing human heart.N Engl J Med.1997，336(16)：1131
收稿： 1998-08-17 修回： 1998-11-03, 百拇医药