用高效液相色谱法测定大鼠血浆中甘草次酸浓度
作者：项琪 程刚 陈济民
单位：沈阳药科大学药学系，沈阳 110015
关键词：高效液相色谱；甘草次酸；血浆
沈阳药科大学学报990208 摘 要 采用高效液相色谱法测定大鼠血浆中甘草次酸浓度.线性范围0.36～48 mg/L.精密度(RSD)日内小于15%，日间小于16%，回收率92.2%，最低检测浓度为0.3 mg/L.
分类号 R914.1
Determination of the Concentration of Glycyrrhetic Acid in Rat Plasma by HPLC
Xiang Qi,Cheng Gang,Chen Jimin
, http://www.100md.com
Department of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015
Abstract The contents of glycyrrhetic acid in plasma were determined by HPLC under following conditions:column ODS 5 μm，200 mm×4.6 mm；mobil phase methyl alcohol and 5 mmol/L tetrabutyl ammonium bromide aqueous solution(V∶V=90∶10，pH 3.6);flow rate 1.0 mL/min；λ=248 nm.The result showed the minimum determination concentration of glycyrrhetic acid was 0.3 mg/L.
, 百拇医药
Key words HPLC;glycyrrhetic acid;plasma
甘草次酸(glycyrrhetic acid,GA)为甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)主要成分甘草酸的水解产物.目前国内外对甘草次酸的血药浓度测定有酶免疫法〔1〕和HPLC〔2〕法.酶免疫法费用较高，HPLC法的流动相采用乙腈，也耗资较大.作者用甲醇-缓冲盐体系测定甘草次酸的血药浓度，具有价格低廉、方法简单、重复性好等特点，对含有甘草酸、甘草次酸的中药的药物代谢动力学研究十分有意义，也有利于传统中药的进一步深入研究与应用.
1 实验材料
1.1 实验仪器
Waters HPLC仪：510泵，484紫外检测器，U6k进样阀，Baseline 810色谱工作站；YKH-Ⅱ型液体快速混和器(江西医疗器械厂)；80-2离心沉淀器(上海手术器械厂)；pHS-2C型精密酸度计(上海雷磁仪器厂).
, 百拇医药
1.2 药品与化学试剂
甘草次酸对照品(中国药品生物制品检定所)；甘草次酸甲酯(GA-Me，本实验室自制)；四丁基溴化铵(分析纯，上海青浦新产品研究所)；甲醇(色谱纯，天津四友生物医学技术有限公司)；二氯甲烷(分析纯，沈阳化学试剂厂)；磷酸(分析纯，沈阳化学试剂厂).
2 实验方法
2.1 标准液的制备
甘草次酸标准溶液：精密称取甘草次酸12 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配成1.2 g/L的标准溶液.
内标溶液：以甘草次酸甲酯为内标物，配成甲醇溶液(20 mg/L).
2.2 血浆样品中甘草次酸的HPLC分析
, 百拇医药
色谱条件：色谱柱：ODS 5 μm,200 mm×4.6 mm(天津Turner科学仪器公司)；流动相为甲醇-5 mmol/L四丁基溴化铵水溶液(V∶V=90∶10，用20%磷酸调pH 3.6)；流速：1.0 mL/min；紫外检测波长：248 nm；进样20 μL.
在10 mL具塞离心试管中准确加入大鼠血浆200 μL及磷酸液(V∶V=1∶60)1 mL，摇匀后加5 mL二氯甲烷，密塞，振荡10 min，离心20 min(3 000 r/min)，吸取有机相置于60℃水浴中，N2吹干.残渣用500 μL甘草次酸甲酯甲醇溶液(20 mg/L)溶解.吸取上清液进样20 μL.
2.3 分析方法的确证(Validation)
2.3.1 HPLC分析方法的专属性
在上述色谱条件下，甘草次酸(GA)和内标物甘草次酸甲酯(GA-Me)的保留时间分别为9.99 min和14.9 min，分离度R=2.6.柱效(理论塔板数/米)：15 045(以甘草次酸计算).图1为空白血浆、空白血浆中加入GA和GA-Me后及给药后大鼠血浆样品色谱图.由图1可知在选定的色谱条件下，空白血浆中的内源性物质对待测物及内标物的测定均无干扰.
, 百拇医药
Fig.1 Chromatography of Glycyrrhetic acid(GA)
1—GA；2—GA-Me internal standard；
A—Blank plasma;B—Blank plasma spiked with GA and GA-Me；C—Rat plasma sample
2.3.2 标准曲线
取标准溶液，用甲醇稀释成浓度为0.12 g/L，准确吸取该溶液0.6，1 μL及1.20 g/L的标准溶液2，4，8 μL至10 mL具塞离心试管中，加入大鼠血浆 200μL，同“2.2”项下操作，制备标准曲线.线性范围：0.36～48 mg/L.
上述各系列标准溶液的每个浓度平行进行3个样本的分析，重复进行3个分析批(Run).分别将所得峰高比(纵坐标y)对待测物浓度(横坐标x)采用加权最小二乘法进行线性回归计算(权重因子Wi=1/c2i(ci为待测物浓度)，求得直线回归方程，即标准曲线〔3〕.表1列出了分析方法建立阶段(prestudy validation)全部3个分析批的标准曲线方程参数.
, 百拇医药
2.3.3 精密度与检测限
分别取血浆200 μL加入GA，配制成含GA 1.0、24、48 μg/mL3种浓度，按“2.3.2”项下操作，进行方法的精密度实验，实验结果见表2.RSD为相对标准偏差.
Tab.1 Parameters of the standard curve Run
A/×102
B/×102
r
1
2.567
5.700
, 百拇医药
0.998 1
2
3.181
5.749
0.998 9
3
2.154
5.867
0.998 0
线性回归方程形式为y=A+Bx，y为待测标准物质与内标的
峰面积比，x为血浆样品中待测标准物质(mg/L)配制的浓度Tab.2 Precision of the glycyrrhetic acid Conc./mg.L-1
, 百拇医药
RSD/%
Within day
Between day
1.0
14.7
15.6
24.0
2.0
6.5
48.0
1.0
3.2
最低检测浓度为0.3 mg/L2.3.4 回收率 空白血浆中加入甘草次酸标准溶液，测定1.0、24.0、48.0 mg/L 3种浓度的回收率，测得平均回收率为99.2.
, http://www.100md.com
Tab.3 Results of recovery(n=6) Add/mg*L-1
Obs/mg.L-1
Recovery/%
Mean±sd/%
1.0
0.98
98.0
24.0
23.9
99.6
, 百拇医药 99.2±1.1
48.0
48.0
100.0
3 讨论 中药多数经口服用，其成分的一部分在消化道内被转化，然后被肌体吸收，或吸收后被肝脏转化〔4〕.目前研究认为甘草的药效主要由其水解产物甘草次酸产生，甘草的副作用“伪醛固酮增多症”与甘草次酸有关〔5〕，因此测定甘草次酸的血药浓度是必要的.采用高效液相色谱法测定甘草次酸的血药浓度，快速准确，可作为甘草次酸血药浓度的有效检测方法.
参考文献
1 吴锡铭.甘草酸铵的药动学和药效学等的研究进展.药学通报，1987，22(8)：449～453
, 百拇医药
2 Yoshikazu Yamamura.Administration-route dependency of glycyrrhizin in rats：Intraperitoneal administration dramatically enhanced bioavailability.Biol Pharm Bull,1995，18(2)：337～341
3 钟大放.以加权最小二乘法建立生物分析标准曲线的若干问题.药物分析杂志，1996，16(5)：343～346
4 难波恒雄.肠内细菌对汉药成分的代谢(第10报)——芍药成分芍药甙代谢物的药理作用.国外医学中医中药分册,1987，9(2)：107～108
5 金建军，夏德全.甘草甜素药代动力学的研究进展.国外医学中医中药分册，1994，16(1)：13～15
收稿日期:1998-09-23, http://www.100md.com
单位：沈阳药科大学药学系，沈阳 110015
关键词：高效液相色谱；甘草次酸；血浆
沈阳药科大学学报990208 摘 要 采用高效液相色谱法测定大鼠血浆中甘草次酸浓度.线性范围0.36～48 mg/L.精密度(RSD)日内小于15%，日间小于16%，回收率92.2%，最低检测浓度为0.3 mg/L.
分类号 R914.1
Determination of the Concentration of Glycyrrhetic Acid in Rat Plasma by HPLC
Xiang Qi,Cheng Gang,Chen Jimin
, http://www.100md.com
Department of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015
Abstract The contents of glycyrrhetic acid in plasma were determined by HPLC under following conditions:column ODS 5 μm，200 mm×4.6 mm；mobil phase methyl alcohol and 5 mmol/L tetrabutyl ammonium bromide aqueous solution(V∶V=90∶10，pH 3.6);flow rate 1.0 mL/min；λ=248 nm.The result showed the minimum determination concentration of glycyrrhetic acid was 0.3 mg/L.
, 百拇医药
Key words HPLC;glycyrrhetic acid;plasma
甘草次酸(glycyrrhetic acid,GA)为甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)主要成分甘草酸的水解产物.目前国内外对甘草次酸的血药浓度测定有酶免疫法〔1〕和HPLC〔2〕法.酶免疫法费用较高，HPLC法的流动相采用乙腈，也耗资较大.作者用甲醇-缓冲盐体系测定甘草次酸的血药浓度，具有价格低廉、方法简单、重复性好等特点，对含有甘草酸、甘草次酸的中药的药物代谢动力学研究十分有意义，也有利于传统中药的进一步深入研究与应用.
1 实验材料
1.1 实验仪器
Waters HPLC仪：510泵，484紫外检测器，U6k进样阀，Baseline 810色谱工作站；YKH-Ⅱ型液体快速混和器(江西医疗器械厂)；80-2离心沉淀器(上海手术器械厂)；pHS-2C型精密酸度计(上海雷磁仪器厂).
, 百拇医药
1.2 药品与化学试剂
甘草次酸对照品(中国药品生物制品检定所)；甘草次酸甲酯(GA-Me，本实验室自制)；四丁基溴化铵(分析纯，上海青浦新产品研究所)；甲醇(色谱纯，天津四友生物医学技术有限公司)；二氯甲烷(分析纯，沈阳化学试剂厂)；磷酸(分析纯，沈阳化学试剂厂).
2 实验方法
2.1 标准液的制备
甘草次酸标准溶液：精密称取甘草次酸12 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配成1.2 g/L的标准溶液.
内标溶液：以甘草次酸甲酯为内标物，配成甲醇溶液(20 mg/L).
2.2 血浆样品中甘草次酸的HPLC分析
, 百拇医药
色谱条件：色谱柱：ODS 5 μm,200 mm×4.6 mm(天津Turner科学仪器公司)；流动相为甲醇-5 mmol/L四丁基溴化铵水溶液(V∶V=90∶10，用20%磷酸调pH 3.6)；流速：1.0 mL/min；紫外检测波长：248 nm；进样20 μL.
在10 mL具塞离心试管中准确加入大鼠血浆200 μL及磷酸液(V∶V=1∶60)1 mL，摇匀后加5 mL二氯甲烷，密塞，振荡10 min，离心20 min(3 000 r/min)，吸取有机相置于60℃水浴中，N2吹干.残渣用500 μL甘草次酸甲酯甲醇溶液(20 mg/L)溶解.吸取上清液进样20 μL.
2.3 分析方法的确证(Validation)
2.3.1 HPLC分析方法的专属性
在上述色谱条件下，甘草次酸(GA)和内标物甘草次酸甲酯(GA-Me)的保留时间分别为9.99 min和14.9 min，分离度R=2.6.柱效(理论塔板数/米)：15 045(以甘草次酸计算).图1为空白血浆、空白血浆中加入GA和GA-Me后及给药后大鼠血浆样品色谱图.由图1可知在选定的色谱条件下，空白血浆中的内源性物质对待测物及内标物的测定均无干扰.
, 百拇医药
Fig.1 Chromatography of Glycyrrhetic acid(GA)
1—GA；2—GA-Me internal standard；
A—Blank plasma;B—Blank plasma spiked with GA and GA-Me；C—Rat plasma sample
2.3.2 标准曲线
取标准溶液，用甲醇稀释成浓度为0.12 g/L，准确吸取该溶液0.6，1 μL及1.20 g/L的标准溶液2，4，8 μL至10 mL具塞离心试管中，加入大鼠血浆 200μL，同“2.2”项下操作，制备标准曲线.线性范围：0.36～48 mg/L.
上述各系列标准溶液的每个浓度平行进行3个样本的分析，重复进行3个分析批(Run).分别将所得峰高比(纵坐标y)对待测物浓度(横坐标x)采用加权最小二乘法进行线性回归计算(权重因子Wi=1/c2i(ci为待测物浓度)，求得直线回归方程，即标准曲线〔3〕.表1列出了分析方法建立阶段(prestudy validation)全部3个分析批的标准曲线方程参数.
, 百拇医药
2.3.3 精密度与检测限
分别取血浆200 μL加入GA，配制成含GA 1.0、24、48 μg/mL3种浓度，按“2.3.2”项下操作，进行方法的精密度实验，实验结果见表2.RSD为相对标准偏差.
Tab.1 Parameters of the standard curve Run
A/×102
B/×102
r
1
2.567
5.700
, 百拇医药
0.998 1
2
3.181
5.749
0.998 9
3
2.154
5.867
0.998 0
线性回归方程形式为y=A+Bx，y为待测标准物质与内标的
峰面积比，x为血浆样品中待测标准物质(mg/L)配制的浓度Tab.2 Precision of the glycyrrhetic acid Conc./mg.L-1
, 百拇医药
RSD/%
Within day
Between day
1.0
14.7
15.6
24.0
2.0
6.5
48.0
1.0
3.2
最低检测浓度为0.3 mg/L2.3.4 回收率 空白血浆中加入甘草次酸标准溶液，测定1.0、24.0、48.0 mg/L 3种浓度的回收率，测得平均回收率为99.2.
, http://www.100md.com
Tab.3 Results of recovery(n=6) Add/mg*L-1
Obs/mg.L-1
Recovery/%
Mean±sd/%
1.0
0.98
98.0
24.0
23.9
99.6
, 百拇医药 99.2±1.1
48.0
48.0
100.0
3 讨论 中药多数经口服用，其成分的一部分在消化道内被转化，然后被肌体吸收，或吸收后被肝脏转化〔4〕.目前研究认为甘草的药效主要由其水解产物甘草次酸产生，甘草的副作用“伪醛固酮增多症”与甘草次酸有关〔5〕，因此测定甘草次酸的血药浓度是必要的.采用高效液相色谱法测定甘草次酸的血药浓度，快速准确，可作为甘草次酸血药浓度的有效检测方法.
参考文献
1 吴锡铭.甘草酸铵的药动学和药效学等的研究进展.药学通报，1987，22(8)：449～453
, 百拇医药
2 Yoshikazu Yamamura.Administration-route dependency of glycyrrhizin in rats：Intraperitoneal administration dramatically enhanced bioavailability.Biol Pharm Bull,1995，18(2)：337～341
3 钟大放.以加权最小二乘法建立生物分析标准曲线的若干问题.药物分析杂志，1996，16(5)：343～346
4 难波恒雄.肠内细菌对汉药成分的代谢(第10报)——芍药成分芍药甙代谢物的药理作用.国外医学中医中药分册,1987，9(2)：107～108
5 金建军，夏德全.甘草甜素药代动力学的研究进展.国外医学中医中药分册，1994，16(1)：13～15
收稿日期:1998-09-23, http://www.100md.com