抗人红细胞血型糖蛋白A非凝集性单克隆抗体的研制及其生物特性研究
作者：陈淑芬 于秋丽 牛建章 孟宗达 康铁军 朱会宾 崔泽
单位：河北省卫生防疫站(保定 071000)
关键词：抗体，单克隆/分离和提纯；血型糖蛋白/分离和提纯；红细胞；小鼠
河北医科大学学报990204 摘 要 目的 研制优质的抗人红细胞血型糖蛋白A单克隆抗体(MCAB-GPA),因为该抗体是研制快速全血凝集试剂中双功能抗体的关键成份。为在我国研制能诊断多种疾病的快速全血系列诊断试剂创造条件。方法 首先用MN亚型GPA(购于美国Sigma公司)免疫小鼠,采用常规杂交瘤细胞技术进行融合和克隆。用EIA和血凝方法进行生物特性鉴定。结果 建立了12个MCAB-GPA株。12个抗体株与GPA发生特异性反应,但对A、B、AB和O 4个不同血型的红细胞不产生自凝,属于人红细胞GPA的特异性抗体。在12株抗体中,7株为IgG1亚型,4株为IgG2a亚型,1株为IgG2b亚型。结论 本文研制的7株IgG1亚型抗体可用于全血凝集试剂中双功能抗体的制备,为研制快速全血凝集系列试验奠定了重要的基础。
, http://www.100md.com
中图号 R331.141
CHARACTERISTIC OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO GLYCOPHORIN A OF HUMAN ERYTHROCYTE
Chen Shufen Yu Qiuli Niu Jianzhang Meng Zongda Kang Tiejun Zhu Huibin Cui Ze
Hebei Provincial Hygene and Anti-epidemic Station(Baoding 071000)
ABSTRACT Objective To study and prepare monoclonal antibody to glycophorin A of human erythrocyte(MCAB-GPA).This antibody is a key reagent in prepration of bispecific antibodies for rapid whole-blood immunoassay.Methods BALB/c mice were injected with GPA antigen.Hybridoma was produced by using traditional techniques.Hybridoma were determined with method of EIA and indirect agglutination(IA).Results All 12 MCAB-GPA were reacted with GPA,and they were not autoagglutination with four types of red cells(type A,B,O,AB).Of 12 MCAB-GPA,7 antibodies were IgG1,4 IgG2a and only one IgG2b subtypes.7 IgG1 MCAB-GPA can be used in makng bispecific antibody in preparation of rapid whole-blood immunoassay.Conclusion This result is an important foundation for making bispecific antibodies in preparation of rapid whole-blood immunoassay.
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MeSH antibodies,monoclonal/isol;glycophorin/isol;erythrocytes;mice
血型糖蛋白(GP)是人红细胞骨架蛋白的重要成员之一。这一类富含唾液酸糖蛋白占红细胞膜蛋白总量的20%,包括GPA、B、C、D和E共5种。GPA是带有M和N血型决定族的人红细胞膜糖蛋白,其蛋白系列由131个氨基酸组成[1]。80年代初,国外学者报道研制出抗人红细胞血型糖蛋白A单克隆抗体(MCAB-GPA)[1～3]。到80年代末期,澳大利亚学者[4～7]将MCAB-GPA用于快速全血凝集试剂中双功能抗体的研制。最近,澳大利亚学者[8～9]用基因工程方法将MCAB-GPA基因与HIV GP41基因片段融合研制出检测HIV抗体的单链双功能抗体。这种方法不仅避免了化学交联时的繁杂过程,而且也降低了生产成本。
MCAB-GPA是制备快速全血凝集试剂中双功能抗体的关键试剂。为研制出适合基层使用的系列快速全血凝集试剂,本文对MCAB-GPA进行了研制。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 红细胞:新鲜“O”型红细胞采自健康献血员,红细胞采集后放阿氏液内4℃保存,1周内使用。
1.1.2 GPA:从正常人红细胞中提取,为MN混合型,购自美国Sigma公司(批号:31H40770)。
1.1.3 羊抗鼠IgG:辣根酶标记羊抗鼠IgG购自北京军事医学科学院,羊抗鼠IgG亚型购自上海生物制品研究所。以上试剂均严格按说明书操作。
1.1.4 SP2/O骨髓瘤细胞:购自中国预防医学科学院流行病学研究所,使用RPM1-1640培基培养。
1.2 试验方法
1.2.1 MCAB的制备
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1.2.1.1 小鼠免疫方法:将3～5人“O”型红细胞混合,用0.01 mmol/L PBS,pH7.5,洗5次,配成10%悬液,腹腔免疫6～8周龄雌性BALB/C小鼠,每4周加强1次,共加强3次,第3次加强后取脾细胞与处于对数生长期的SP2/O细胞融合。
1.2.1.2 融合与克隆:小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合比例与时间均按常规方法进行。杂交瘤培养上清中抗体的筛选采用红细胞直接凝集实验、间接凝集实验和ELISA实验。克隆及亚克隆采用有限稀释法。
1.2.2 细胞凝集实验[10]
1.2.2.1 直接凝集实验:将新鲜人“O”型红细胞用PBS洗3次,最后1次1 000 r/min压积10分钟后,用PBS-T配制成1%悬液,与培养上清混合后,室温孵育1小时,肉眼观察结果。用-、±、+、、、判断凝集的不同程度。
, 百拇医药
1.2.2.2 间接凝集实验:在1%红细胞悬液中加入1∶32羊抗鼠IgG,取其50 μl与等体积培养上清液混合,摇匀后室温静置1小时观察结果。
1.2.3 ELISA实验:用20 μg/ml的GPA包被微孔反应板,2%牛血清白蛋白封闭,加50μl 1∶500稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG孵育后,OPD显色,测OD 490 nm吸光值。
1.2.4 IgG亚型测定:采用琼脂免疫扩散方法。用1%琼脂糖制备孔径为3 mm的梅花型琼脂板。中间孔分别加入IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3标准分型血清。4周孔内加入1∶10浓缩的细胞培养上清液,4℃湿盒内放置过夜,出现沉淀线为阳性。
1.2.5 MCAB-GPA与红细胞结合试验:选择5株IgG1亚型单抗,吸取50μl培养上清与等量的1%的4种不同血型的红细胞悬液混合,室温作用1小时后2 000 r/min离心10分钟。其上清与相应的未吸附的上清同时作ELISA测定。吸附后OD值比较前OD值降低50%以上为阳性。
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2 结果
2.1 红细胞免疫后小鼠血清的血凝和ELISA测定结果:用血凝和ELISA试验测定红细胞免疫后小鼠血清,结果均出现阳性反应,血凝滴度>1∶100,抗-GPA ELISA效价均在1∶1 000以上。未免疫的对照小鼠血清均阴性。
2.2 细胞融合与单克隆抗体的筛选:两次共融合240孔,有明显杂交瘤细胞生长的188孔,融合率为78.3%。用ELISA和血凝法对188孔进行了抗体检测,抗体阳性率为22.3%。
2.3 杂交瘤细胞培养上清与小鼠腹水抗体的测定:杂交瘤细胞培养上清抗体滴度ELISA测定为1∶1 000,血凝测定为1∶10;小鼠腹水抗体滴度ELISA法为1∶100 000,血凝法为1∶1 000。腹水抗体滴度均比上清高100倍。
2.4 12株MCAB-GPA血凝,ELISA和IgG亚型分析结果,见表1。
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表1 12株MCAB-GPA血凝,ELISA和IgG亚型分析结果
Table 1 Resuts of agglutination,ELISA and IgG subtyping
for 12 MCAB-GPA strains Strains
Agglutination
ELISA(OD)
IgG
DA*
IA**
11A6
, 百拇医药 -
++++
1.68
IgG1
11C8
-
++++
1.61
IgG1
11D3
-
++++
1.63
, 百拇医药
IgG1
11D12
-
++++
1.68
IgG1
11E2
-
++++
1.66
IgG1
14C5
, 百拇医药
-
++++
1.29
IgG2a
14D4
-
++++
1.24
IgG2a
14D8
-
++++
1.22
, http://www.100md.com
IgG2a
15B4
-
++++
1.00
IgG2b
15B12
-
++++
1.08
IgG1
15C12
, http://www.100md.com
-
++++
2.08
IgG2a
17G12
-
++++
0.08
IgG1
* DA:Direct agglutination,** IA:Indirect agglutination
所检测的12株MCAB-GPA直接血凝均为阴性,而间接血凝均出现强阳性反应。除17G12外,其余抗体株ELISA OD值均在1.0以上。在12株中,7株为IgG1亚型,4株为IgG2a亚型,1株为IgG2b亚型。
, 百拇医药
2.5 12株MCAB-GPA对4种不同血型红细胞的血凝试验结果:12株MCAB-GPA对4种不同血型红细胞(A、B、O和AB)自凝试验结果表明,除个别株(如17G12)在1∶4稀释时对AB血型出现轻微凝集外,其余株对4种血型均未出现自凝现象。
2.6 MCAB、GPA与红细胞结合试验结果:为了解红细胞与单克隆抗体的结合能力,本文选择5个IgG1亚型单抗株,检测其与红细胞结合能力。这5株抗体在直接血凝试验中与4个血型的抗体均不发生凝集反应,红细胞结合试验均为阳性,经红细胞吸附后ELISA测定均出现阴性反应。
3 讨论
80年代末,澳大利亚学者[4,6]用化学交联技术将抗GPA单克隆抗体IgG Fab′片段与HIV GP41多肽交联制备出双功能抗体,建立了检测患者血HIV抗体的全血快速凝集试验方法。该方法简便、快速、敏感,因使用少量全血标本,尤其适用于基层单位的床边诊断。为在我国研制出能诊断多种简便的快速全血系列诊断试剂,最近作者研制出高效价抗人红细胞GPA单克隆抗体,这为加强研制诊断试剂奠定了基础。
, 百拇医药
MCAB-GPA是构成快速全血凝集试剂的关键成分,在双功能抗体的制备中多选用IgG1亚型,其特性要求与红细胞结合而不发生凝集[5]。本文报告的12株单抗对4种不同血型的红细胞不产生自凝。亚型鉴定结果表明,在12株单抗中,大部分为IgG1亚型(7株),4株为IgG2a亚型,1株为IgG2b亚型。说明这12株抗体中有7株有可能用于快速全血凝集试剂中双功能抗体的制备。这为研制快速全血凝集试剂创造了必要条件。
参考文献
1.Barsoum AL,Bhavanandan VP,Davidson EA.Monoclonal antibodies to cyanogen bromide fragments of glycophorin A.Molecular Immunology,1985,22(4):361
, http://www.100md.com
2.Bigbee WL,Vanderlaan M,Fong SN,et al.Monoclonal antibodies specific for the M-and N-forms of human glycophorin A.Molecular Immunology,1983,20(12):1353
3.Rearden A,Taetle R,Elmilan DA,et al.Glycophorin A on normal and lekemia cells detected by monoclonal antibodies,including a new monoclonal antibody reactive with glycophorins A and B.Molecular Immunology,1985,22(4):369
4.Kemp BE,Rylatt DB,Bundesen PG,et al.Autologous red cell agglutination assay for HIV-1 antibodies:simplified test with whole blood.Science,1988,241:1352
, 百拇医药
5.Rylatt DB,Kemp BE,Bundesen PC,et al.A rapid whole-blood immunoassay system.The Medical Journal of Australia,1990,152:5
6.Wilson KM,Gerometta M,Rylatt DB,et al.Rapid whloe blood assay for HIV-1 seropositivity using an Fab-peptide conjugate.Journal of Immunological Methods,1991,138:111
7.Lilley GG,Dolezal O,Hillyard CJ,et al.Recominant single chain antibody peptide conjugates expressed in Escherichia coli for the rapid diagnosis of HIV.Journal of Immunological Methods.1994,171:211
, 百拇医药
8.Coia G,Hudson PJ,Lilley GG.Construction of recombinant extented single-chain antibody peptide conjugates for use in the diagnosis of HIV-1 and HIV-2.Journal of Immunological Methods,1996,192:13
9.Bundeson PG,Wyatt DM,Cotis LE,et al.Monoclonal antibodies directed against Brucella Abortus cell surface antigens.Elsevier Science Publishers B.V.1985,10.黄祯祥,主编.医学病毒学基础及试验技术.北京:科学出版社,1990.181
(1997-10-21 收稿), 百拇医药
单位：河北省卫生防疫站(保定 071000)
关键词：抗体，单克隆/分离和提纯；血型糖蛋白/分离和提纯；红细胞；小鼠
河北医科大学学报990204 摘 要 目的 研制优质的抗人红细胞血型糖蛋白A单克隆抗体(MCAB-GPA),因为该抗体是研制快速全血凝集试剂中双功能抗体的关键成份。为在我国研制能诊断多种疾病的快速全血系列诊断试剂创造条件。方法 首先用MN亚型GPA(购于美国Sigma公司)免疫小鼠,采用常规杂交瘤细胞技术进行融合和克隆。用EIA和血凝方法进行生物特性鉴定。结果 建立了12个MCAB-GPA株。12个抗体株与GPA发生特异性反应,但对A、B、AB和O 4个不同血型的红细胞不产生自凝,属于人红细胞GPA的特异性抗体。在12株抗体中,7株为IgG1亚型,4株为IgG2a亚型,1株为IgG2b亚型。结论 本文研制的7株IgG1亚型抗体可用于全血凝集试剂中双功能抗体的制备,为研制快速全血凝集系列试验奠定了重要的基础。
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中图号 R331.141
CHARACTERISTIC OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO GLYCOPHORIN A OF HUMAN ERYTHROCYTE
Chen Shufen Yu Qiuli Niu Jianzhang Meng Zongda Kang Tiejun Zhu Huibin Cui Ze
Hebei Provincial Hygene and Anti-epidemic Station(Baoding 071000)
ABSTRACT Objective To study and prepare monoclonal antibody to glycophorin A of human erythrocyte(MCAB-GPA).This antibody is a key reagent in prepration of bispecific antibodies for rapid whole-blood immunoassay.Methods BALB/c mice were injected with GPA antigen.Hybridoma was produced by using traditional techniques.Hybridoma were determined with method of EIA and indirect agglutination(IA).Results All 12 MCAB-GPA were reacted with GPA,and they were not autoagglutination with four types of red cells(type A,B,O,AB).Of 12 MCAB-GPA,7 antibodies were IgG1,4 IgG2a and only one IgG2b subtypes.7 IgG1 MCAB-GPA can be used in makng bispecific antibody in preparation of rapid whole-blood immunoassay.Conclusion This result is an important foundation for making bispecific antibodies in preparation of rapid whole-blood immunoassay.
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MeSH antibodies,monoclonal/isol;glycophorin/isol;erythrocytes;mice
血型糖蛋白(GP)是人红细胞骨架蛋白的重要成员之一。这一类富含唾液酸糖蛋白占红细胞膜蛋白总量的20%,包括GPA、B、C、D和E共5种。GPA是带有M和N血型决定族的人红细胞膜糖蛋白,其蛋白系列由131个氨基酸组成[1]。80年代初,国外学者报道研制出抗人红细胞血型糖蛋白A单克隆抗体(MCAB-GPA)[1～3]。到80年代末期,澳大利亚学者[4～7]将MCAB-GPA用于快速全血凝集试剂中双功能抗体的研制。最近,澳大利亚学者[8～9]用基因工程方法将MCAB-GPA基因与HIV GP41基因片段融合研制出检测HIV抗体的单链双功能抗体。这种方法不仅避免了化学交联时的繁杂过程,而且也降低了生产成本。
MCAB-GPA是制备快速全血凝集试剂中双功能抗体的关键试剂。为研制出适合基层使用的系列快速全血凝集试剂,本文对MCAB-GPA进行了研制。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 红细胞:新鲜“O”型红细胞采自健康献血员,红细胞采集后放阿氏液内4℃保存,1周内使用。
1.1.2 GPA:从正常人红细胞中提取,为MN混合型,购自美国Sigma公司(批号:31H40770)。
1.1.3 羊抗鼠IgG:辣根酶标记羊抗鼠IgG购自北京军事医学科学院,羊抗鼠IgG亚型购自上海生物制品研究所。以上试剂均严格按说明书操作。
1.1.4 SP2/O骨髓瘤细胞:购自中国预防医学科学院流行病学研究所,使用RPM1-1640培基培养。
1.2 试验方法
1.2.1 MCAB的制备
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1.2.1.1 小鼠免疫方法:将3～5人“O”型红细胞混合,用0.01 mmol/L PBS,pH7.5,洗5次,配成10%悬液,腹腔免疫6～8周龄雌性BALB/C小鼠,每4周加强1次,共加强3次,第3次加强后取脾细胞与处于对数生长期的SP2/O细胞融合。
1.2.1.2 融合与克隆:小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合比例与时间均按常规方法进行。杂交瘤培养上清中抗体的筛选采用红细胞直接凝集实验、间接凝集实验和ELISA实验。克隆及亚克隆采用有限稀释法。
1.2.2 细胞凝集实验[10]
1.2.2.1 直接凝集实验:将新鲜人“O”型红细胞用PBS洗3次,最后1次1 000 r/min压积10分钟后,用PBS-T配制成1%悬液,与培养上清混合后,室温孵育1小时,肉眼观察结果。用-、±、+、、、判断凝集的不同程度。
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1.2.2.2 间接凝集实验:在1%红细胞悬液中加入1∶32羊抗鼠IgG,取其50 μl与等体积培养上清液混合,摇匀后室温静置1小时观察结果。
1.2.3 ELISA实验:用20 μg/ml的GPA包被微孔反应板,2%牛血清白蛋白封闭,加50μl 1∶500稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG孵育后,OPD显色,测OD 490 nm吸光值。
1.2.4 IgG亚型测定:采用琼脂免疫扩散方法。用1%琼脂糖制备孔径为3 mm的梅花型琼脂板。中间孔分别加入IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3标准分型血清。4周孔内加入1∶10浓缩的细胞培养上清液,4℃湿盒内放置过夜,出现沉淀线为阳性。
1.2.5 MCAB-GPA与红细胞结合试验:选择5株IgG1亚型单抗,吸取50μl培养上清与等量的1%的4种不同血型的红细胞悬液混合,室温作用1小时后2 000 r/min离心10分钟。其上清与相应的未吸附的上清同时作ELISA测定。吸附后OD值比较前OD值降低50%以上为阳性。
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2 结果
2.1 红细胞免疫后小鼠血清的血凝和ELISA测定结果:用血凝和ELISA试验测定红细胞免疫后小鼠血清,结果均出现阳性反应,血凝滴度>1∶100,抗-GPA ELISA效价均在1∶1 000以上。未免疫的对照小鼠血清均阴性。
2.2 细胞融合与单克隆抗体的筛选:两次共融合240孔,有明显杂交瘤细胞生长的188孔,融合率为78.3%。用ELISA和血凝法对188孔进行了抗体检测,抗体阳性率为22.3%。
2.3 杂交瘤细胞培养上清与小鼠腹水抗体的测定:杂交瘤细胞培养上清抗体滴度ELISA测定为1∶1 000,血凝测定为1∶10;小鼠腹水抗体滴度ELISA法为1∶100 000,血凝法为1∶1 000。腹水抗体滴度均比上清高100倍。
2.4 12株MCAB-GPA血凝,ELISA和IgG亚型分析结果,见表1。
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表1 12株MCAB-GPA血凝,ELISA和IgG亚型分析结果
Table 1 Resuts of agglutination,ELISA and IgG subtyping
for 12 MCAB-GPA strains Strains
Agglutination
ELISA(OD)
IgG
DA*
IA**
11A6
, 百拇医药 -
++++
1.68
IgG1
11C8
-
++++
1.61
IgG1
11D3
-
++++
1.63
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IgG1
11D12
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++++
1.68
IgG1
11E2
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++++
1.66
IgG1
14C5
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++++
1.29
IgG2a
14D4
-
++++
1.24
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IgG2a
15B4
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1.00
IgG2b
15B12
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++++
1.08
IgG1
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++++
2.08
IgG2a
17G12
-
++++
0.08
IgG1
* DA:Direct agglutination,** IA:Indirect agglutination
所检测的12株MCAB-GPA直接血凝均为阴性,而间接血凝均出现强阳性反应。除17G12外,其余抗体株ELISA OD值均在1.0以上。在12株中,7株为IgG1亚型,4株为IgG2a亚型,1株为IgG2b亚型。
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2.5 12株MCAB-GPA对4种不同血型红细胞的血凝试验结果:12株MCAB-GPA对4种不同血型红细胞(A、B、O和AB)自凝试验结果表明,除个别株(如17G12)在1∶4稀释时对AB血型出现轻微凝集外,其余株对4种血型均未出现自凝现象。
2.6 MCAB、GPA与红细胞结合试验结果:为了解红细胞与单克隆抗体的结合能力,本文选择5个IgG1亚型单抗株,检测其与红细胞结合能力。这5株抗体在直接血凝试验中与4个血型的抗体均不发生凝集反应,红细胞结合试验均为阳性,经红细胞吸附后ELISA测定均出现阴性反应。
3 讨论
80年代末,澳大利亚学者[4,6]用化学交联技术将抗GPA单克隆抗体IgG Fab′片段与HIV GP41多肽交联制备出双功能抗体,建立了检测患者血HIV抗体的全血快速凝集试验方法。该方法简便、快速、敏感,因使用少量全血标本,尤其适用于基层单位的床边诊断。为在我国研制出能诊断多种简便的快速全血系列诊断试剂,最近作者研制出高效价抗人红细胞GPA单克隆抗体,这为加强研制诊断试剂奠定了基础。
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MCAB-GPA是构成快速全血凝集试剂的关键成分,在双功能抗体的制备中多选用IgG1亚型,其特性要求与红细胞结合而不发生凝集[5]。本文报告的12株单抗对4种不同血型的红细胞不产生自凝。亚型鉴定结果表明,在12株单抗中,大部分为IgG1亚型(7株),4株为IgG2a亚型,1株为IgG2b亚型。说明这12株抗体中有7株有可能用于快速全血凝集试剂中双功能抗体的制备。这为研制快速全血凝集试剂创造了必要条件。
参考文献
1.Barsoum AL,Bhavanandan VP,Davidson EA.Monoclonal antibodies to cyanogen bromide fragments of glycophorin A.Molecular Immunology,1985,22(4):361
, http://www.100md.com
2.Bigbee WL,Vanderlaan M,Fong SN,et al.Monoclonal antibodies specific for the M-and N-forms of human glycophorin A.Molecular Immunology,1983,20(12):1353
3.Rearden A,Taetle R,Elmilan DA,et al.Glycophorin A on normal and lekemia cells detected by monoclonal antibodies,including a new monoclonal antibody reactive with glycophorins A and B.Molecular Immunology,1985,22(4):369
4.Kemp BE,Rylatt DB,Bundesen PG,et al.Autologous red cell agglutination assay for HIV-1 antibodies:simplified test with whole blood.Science,1988,241:1352
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5.Rylatt DB,Kemp BE,Bundesen PC,et al.A rapid whole-blood immunoassay system.The Medical Journal of Australia,1990,152:5
6.Wilson KM,Gerometta M,Rylatt DB,et al.Rapid whloe blood assay for HIV-1 seropositivity using an Fab-peptide conjugate.Journal of Immunological Methods,1991,138:111
7.Lilley GG,Dolezal O,Hillyard CJ,et al.Recominant single chain antibody peptide conjugates expressed in Escherichia coli for the rapid diagnosis of HIV.Journal of Immunological Methods.1994,171:211
, 百拇医药
8.Coia G,Hudson PJ,Lilley GG.Construction of recombinant extented single-chain antibody peptide conjugates for use in the diagnosis of HIV-1 and HIV-2.Journal of Immunological Methods,1996,192:13
9.Bundeson PG,Wyatt DM,Cotis LE,et al.Monoclonal antibodies directed against Brucella Abortus cell surface antigens.Elsevier Science Publishers B.V.1985,10.黄祯祥,主编.医学病毒学基础及试验技术.北京:科学出版社,1990.181
(1997-10-21 收稿), 百拇医药