抗虫灵对大鼠脑组织乙酰胆碱酯酶的抑制作用
作者：易宗春 徐汉宫 蔡红梅 侯铁英 程清宇 石年
单位：同济医科大学环境毒理教研室 (武汉 430030)
关键词：
卫生毒理学杂志990217 有机磷杀虫剂是最常用的杀虫剂之一。抗虫灵是华中师范大学农药研究所研制的新型有机磷杀虫剂，又称9105，化学名称为O-甲基-O-对甲硫基苯基硫代磷酰胺酯(O-methyl-O-P-methiophenyl thiophosphoramidots)，经田间试验有良好的杀虫效果，极具推广价值。
有关有机磷杀虫剂的毒作用机理已得到广泛研究，其主要通过对胆碱酯酶的抑制而引起中枢或外周神经系统症状。但是，不同的有机磷杀虫剂由于其结构差异，有其自已的毒作用特点。本实验旨在从体内和体外试验条件，观察抗虫灵对大鼠脑组织乙酰胆碱酯酶的作用特点，初步探讨其中枢神经毒作用机理。
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材料与方法
一、材料
1.抗虫灵：由华中师范大学农药研究所提供，含量>99.0%。
2.实验动物：Wistar大鼠，雄性，体重180～220g，由同济医科大学实验动物学部提供。
3.试剂：碘化硫代乙酰胆碱，Fluka公司产品；5，5′-二硫基-2,2′-二硝基苯甲酸，中国科学院上海生物化学研究所产品；其他试剂均为国产分析纯。
二、方法
1.整体实验动物处理：将Wistar大鼠随机分为两组，每组6只，实验组经口给予抗虫灵6.81mg/kg(相当于1/10 LD50剂量)，对照组给予等量植物油。每天灌胃1次，连续5天，动物最后1次染毒24小时后断头处死，迅速剥离全脑，用4℃预冷生理盐水洗去血污，分离出大脑皮层、海马和小脑等脑区，制备成组织匀浆，供AChE活性测定。用Lowry法[1]测定组织匀浆的蛋白质含量
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2.大鼠脑组织突触体的制备[2]：将20只成年Wistar大鼠断头处死，分离全脑，用4℃预冷生理盐水洗去血污，加入9倍体积离心介质(0.32mol/L蔗糖)，用玻璃匀浆器上、下10次进行组织匀浆。匀浆液经750×g离心10分，取上清液，经17000×g离心20分，取沉淀。将沉淀悬于9倍体积的离心介质，铺于蔗糖梯度上(由0.8mol/L和1.2mol/L蔗糖溶液组成)，经65000×g离心45分，收集0.8mol/L与1.2mol/L蔗糖界面之间的致密物，用100mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)，洗去蔗糖(在17000×g离心15分)。收集沉淀，将其悬浮于100mmol/L磷酸盐缓冲液pH7.4，-70℃冷冻保存备用。整个制备过程在4℃下进行。
3.AChE活性测定：按Ellman法[3]进行。
4.数据处理：所获数据用t检验法，判断实验组与对照组之间的显著性差异。
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结 果
一、抗虫灵对大鼠不同脑区AChE活性影响
大鼠连续5天灌胃染毒后，不同脑区AChE活性变化见表1。结果显示，抗虫录可抑制实验动物脑组织AChE活性，与对照组比较差异有显著性，大脑皮层、海马和小脑的抑制率分别为29.07%，37.70%和64.81%，其中小脑的AChE活性抑制率最大。
表1 抗虫灵对大鼠脑组织AChE活性的影响(
±s) 脑区
AChE活性(nmol.mgpr-1.min-1)
抑制率(%)
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对照组
实验组
大脑皮层
39.29±6.76
28.87±5.86*
29.07
海马
39.07±12.05
24.34±6.10*
37.70
小脑
26.37±6.82
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9.28±3.30**
64.81
与对照组比较 *P<0.05 **P<0.01
二、体外实验抗虫灵对大鼠脑突触体AChE活性的影响及机理探讨
1.抗虫灵对大鼠脑突触体AChE抑制作用的剂量-效应关系：将适量突触体与不同终浓度抗虫灵于37℃下共同温育30分，测定突触体AChE活性，结果见图1。抗虫灵在5×10-9～5×10-3mol/L浓度范围内，对AChE有明显抑制作用，且呈剂量-效应关系。
图1 抗虫灵对大鼠脑突触体AChE抑制作用的剂量效应关系 ▲对照
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2.抗虫灵对大鼠脑突触体AChE抑制作用的时间-效应关系：将终浓度为0.5mmol/L和5mmol/L的抗虫灵与适量突触体于37℃共温育，于不同时间测定AChE活性，结果见图2。2个不同剂量抗虫灵均对脑突触体AChE抑制作用随温育时间延长而增强，有明显的时间-效应关系。
图2 抗虫灵对大鼠脑触体AChE抑制作用的时间-效应关系 -□- 0.5mmol.L-1 -●- 5mmol.L-1
3.抗虫灵对大鼠脑突触体AChE抑制作用类型分析：将不同量的大鼠脑突触体与一定浓度的抗虫灵温育30分，加入AChE活性测定底物，测定其酶促反应初速度(V)，以酶浓度(即突触体蛋白质含量)对V作图，结果见图3。
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图3 抗虫灵对大鼠脑突触体AChE抑制作用类型分析 -●-对照 -□-抗虫灵
由图3可见，在反应体系中，不加抗虫灵即对照组，所得直线为一经过原点的直线。当反应体系中加有抗虫灵(0.5mmol/L)时，其直线为一不经原点的直线，且斜率变小。根据酯学分析法[4]，判断抗虫灵对大鼠脑突触体的抑制作用属于不可逆性抑制。
讨 论
乙酰胆碱在中枢神经系统具有多种生理功能，机体的运动感觉功能、精神活动、学习记忆功能等均与乙酰胆碱有关。它在体内代谢失活有赖于AChE，AChE活性的改变将影响乙酰胆碱代谢，导致神经系统的异常。本研究发现，连续5天给予抗虫灵后，对大鼠脑组织AChE有明显抑制作用，且不同脑区AChE受抑制程度有一定差异，其中小脑AChE抑制最严重。这种不同脑区敏感性差异可能与其对抗虫灵的亲和力，各脑区抗虫灵的有效浓度及不同脑区对抗虫灵的代谢特点等方面有关。
, 百拇医药
AChE在中枢神经系统主要位于突触后膜，而前膜也有存在。在体外实验中，抗虫灵直接作用于大鼠脑突触体制备物，表现出AChE活性抑制，且有明显的剂量-效应和时间-效应关系。依酶学分析法，抗虫灵抑制AChE的类型为不可逆性抑制。
通过整体与体外实验表明抗虫灵对脑组织AChE的直接抑制是其中枢神经毒作用机理的重要方面。当然，抗虫灵神经毒作用是复杂的(将另文报道)，其作用机理可能是多方面的，要全面认识其毒作用机理有待进一步研究。
国家自然科学基金资助重点项目(NO.39430110)
参考文献
1.Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr Al, et al. J Biol Chem, 1951,193:265～275.
2.Mishria SK, Osborn RL, Desaiah D. J Toxicol Environ Health, 1981,8(3):449～461.
3.Ellman GL, Courtney KD, Andres VJ, et al. Biochem Pharmacol, 1961,7:88～95.
4.陈惠黎，李文杰.酶的抑制作用，分子酶学，北京：人民卫生出版社，1983，233～70
(修回日期 1998年12月), 百拇医药
单位：同济医科大学环境毒理教研室 (武汉 430030)
关键词：
卫生毒理学杂志990217 有机磷杀虫剂是最常用的杀虫剂之一。抗虫灵是华中师范大学农药研究所研制的新型有机磷杀虫剂，又称9105，化学名称为O-甲基-O-对甲硫基苯基硫代磷酰胺酯(O-methyl-O-P-methiophenyl thiophosphoramidots)，经田间试验有良好的杀虫效果，极具推广价值。
有关有机磷杀虫剂的毒作用机理已得到广泛研究，其主要通过对胆碱酯酶的抑制而引起中枢或外周神经系统症状。但是，不同的有机磷杀虫剂由于其结构差异，有其自已的毒作用特点。本实验旨在从体内和体外试验条件，观察抗虫灵对大鼠脑组织乙酰胆碱酯酶的作用特点，初步探讨其中枢神经毒作用机理。
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材料与方法
一、材料
1.抗虫灵：由华中师范大学农药研究所提供，含量>99.0%。
2.实验动物：Wistar大鼠，雄性，体重180～220g，由同济医科大学实验动物学部提供。
3.试剂：碘化硫代乙酰胆碱，Fluka公司产品；5，5′-二硫基-2,2′-二硝基苯甲酸，中国科学院上海生物化学研究所产品；其他试剂均为国产分析纯。
二、方法
1.整体实验动物处理：将Wistar大鼠随机分为两组，每组6只，实验组经口给予抗虫灵6.81mg/kg(相当于1/10 LD50剂量)，对照组给予等量植物油。每天灌胃1次，连续5天，动物最后1次染毒24小时后断头处死，迅速剥离全脑，用4℃预冷生理盐水洗去血污，分离出大脑皮层、海马和小脑等脑区，制备成组织匀浆，供AChE活性测定。用Lowry法[1]测定组织匀浆的蛋白质含量
, 百拇医药
2.大鼠脑组织突触体的制备[2]：将20只成年Wistar大鼠断头处死，分离全脑，用4℃预冷生理盐水洗去血污，加入9倍体积离心介质(0.32mol/L蔗糖)，用玻璃匀浆器上、下10次进行组织匀浆。匀浆液经750×g离心10分，取上清液，经17000×g离心20分，取沉淀。将沉淀悬于9倍体积的离心介质，铺于蔗糖梯度上(由0.8mol/L和1.2mol/L蔗糖溶液组成)，经65000×g离心45分，收集0.8mol/L与1.2mol/L蔗糖界面之间的致密物，用100mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)，洗去蔗糖(在17000×g离心15分)。收集沉淀，将其悬浮于100mmol/L磷酸盐缓冲液pH7.4，-70℃冷冻保存备用。整个制备过程在4℃下进行。
3.AChE活性测定：按Ellman法[3]进行。
4.数据处理：所获数据用t检验法，判断实验组与对照组之间的显著性差异。
, http://www.100md.com
结 果
一、抗虫灵对大鼠不同脑区AChE活性影响
大鼠连续5天灌胃染毒后，不同脑区AChE活性变化见表1。结果显示，抗虫录可抑制实验动物脑组织AChE活性，与对照组比较差异有显著性，大脑皮层、海马和小脑的抑制率分别为29.07%，37.70%和64.81%，其中小脑的AChE活性抑制率最大。
表1 抗虫灵对大鼠脑组织AChE活性的影响(
±s) 脑区AChE活性(nmol.mgpr-1.min-1)
抑制率(%)
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对照组
实验组
大脑皮层
39.29±6.76
28.87±5.86*
29.07
海马
39.07±12.05
24.34±6.10*
37.70
小脑
26.37±6.82
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9.28±3.30**
64.81
与对照组比较 *P<0.05 **P<0.01
二、体外实验抗虫灵对大鼠脑突触体AChE活性的影响及机理探讨
1.抗虫灵对大鼠脑突触体AChE抑制作用的剂量-效应关系：将适量突触体与不同终浓度抗虫灵于37℃下共同温育30分，测定突触体AChE活性，结果见图1。抗虫灵在5×10-9～5×10-3mol/L浓度范围内，对AChE有明显抑制作用，且呈剂量-效应关系。
图1 抗虫灵对大鼠脑突触体AChE抑制作用的剂量效应关系 ▲对照
, http://www.100md.com
2.抗虫灵对大鼠脑突触体AChE抑制作用的时间-效应关系：将终浓度为0.5mmol/L和5mmol/L的抗虫灵与适量突触体于37℃共温育，于不同时间测定AChE活性，结果见图2。2个不同剂量抗虫灵均对脑突触体AChE抑制作用随温育时间延长而增强，有明显的时间-效应关系。
图2 抗虫灵对大鼠脑触体AChE抑制作用的时间-效应关系 -□- 0.5mmol.L-1 -●- 5mmol.L-1
3.抗虫灵对大鼠脑突触体AChE抑制作用类型分析：将不同量的大鼠脑突触体与一定浓度的抗虫灵温育30分，加入AChE活性测定底物，测定其酶促反应初速度(V)，以酶浓度(即突触体蛋白质含量)对V作图，结果见图3。
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图3 抗虫灵对大鼠脑突触体AChE抑制作用类型分析 -●-对照 -□-抗虫灵
由图3可见，在反应体系中，不加抗虫灵即对照组，所得直线为一经过原点的直线。当反应体系中加有抗虫灵(0.5mmol/L)时，其直线为一不经原点的直线，且斜率变小。根据酯学分析法[4]，判断抗虫灵对大鼠脑突触体的抑制作用属于不可逆性抑制。
讨 论
乙酰胆碱在中枢神经系统具有多种生理功能，机体的运动感觉功能、精神活动、学习记忆功能等均与乙酰胆碱有关。它在体内代谢失活有赖于AChE，AChE活性的改变将影响乙酰胆碱代谢，导致神经系统的异常。本研究发现，连续5天给予抗虫灵后，对大鼠脑组织AChE有明显抑制作用，且不同脑区AChE受抑制程度有一定差异，其中小脑AChE抑制最严重。这种不同脑区敏感性差异可能与其对抗虫灵的亲和力，各脑区抗虫灵的有效浓度及不同脑区对抗虫灵的代谢特点等方面有关。
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AChE在中枢神经系统主要位于突触后膜，而前膜也有存在。在体外实验中，抗虫灵直接作用于大鼠脑突触体制备物，表现出AChE活性抑制，且有明显的剂量-效应和时间-效应关系。依酶学分析法，抗虫灵抑制AChE的类型为不可逆性抑制。
通过整体与体外实验表明抗虫灵对脑组织AChE的直接抑制是其中枢神经毒作用机理的重要方面。当然，抗虫灵神经毒作用是复杂的(将另文报道)，其作用机理可能是多方面的，要全面认识其毒作用机理有待进一步研究。
国家自然科学基金资助重点项目(NO.39430110)
参考文献
1.Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr Al, et al. J Biol Chem, 1951,193:265～275.
2.Mishria SK, Osborn RL, Desaiah D. J Toxicol Environ Health, 1981,8(3):449～461.
3.Ellman GL, Courtney KD, Andres VJ, et al. Biochem Pharmacol, 1961,7:88～95.
4.陈惠黎，李文杰.酶的抑制作用，分子酶学，北京：人民卫生出版社，1983，233～70
(修回日期 1998年12月), 百拇医药