胆固醇酯转运蛋白变异体Ile405Val及其对HDL代谢的影响
作者：陆付耳 黄光英 李鸣真 叶望云
单位：陆付耳 黄光英 李鸣真 叶望云 同济医科大学附属同济医院中西医结合研究所，武汉 430030；Heiko Wiebusch Harald Funke Gerd Assmann 德国明斯特大学动脉硬化研究所，Mnster D-48129
关键词：胆固醇酯转运蛋白；基因突变；脂蛋白类；高密度
同济医科大学学报990220 Heiko Wiebusch Harald Funke Gerd Assmann
摘要 通过聚合酶链反应(PCR)技术扩增胆固醇酯转运蛋白(CETP)基因，继而采用荧光直读法测定CETP基因DNA序列，首次发现一频发CETP基因突变点，即CETP第405位异亮氨酸残基(Ile)为缬氨酸残基(Val)取代(Ile405Val)。用分子流行病学方法进一步研究表明该CETP基因变异体在德意志和意大利人群中出现频率显著不同(0.30 vs 0.40, P<0.01)，但均与血清高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)的升高密切相关(均为P<0.01)。
, 百拇医药
中图法分类号 Q343.1, Q513.5
Identification of A Novel Missense Mutation of Cholesteryl Ester Transfer
Protein Gene-Ile405Val and Its Influence on the Metabolism of High
Density Lipoprotein
Lu Fuer, Huang Guangying, Li Mingzhen et al
Institute of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Tongji Hospital,Tongji Medical University, Wuhan 430030
, 百拇医药
Abstract The human genomic DNA of cholesteryl ester transfer protein (CETP) was amplified by using polymerase chain reaction (PCR) and its sequences were analyzed in the patients with hyperalphalipoproteinemia using automated laser fluorescence technique. A novel frequent missense mutation of CETP gene with the substitution of isoleucine to valine in codon 405 was firstly identified. This genetic variant of CETP was found in both German and Italian populations and closely correlated to the increase of serum high density lipoprotein cholesterol (P<0.01), but with different allele frequency (0.30 vs 0.40, P<0.01).
, 百拇医药
Key words cholesteryl ester transfer protein; gene mutation; high density lipoprotein
流行病学资料提示冠心病(CHD)的发病率与血清高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)水平呈显著负相关[1]。HDL参与的胆固醇逆向转运被认为具有抗动脉硬化作用，为冠心病的保护因子。胆固醇酯转运蛋白(CETP)是胆固醇逆向转运生理过程的一个重要组分，介导胆固醇酯(CE)从HDL向低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)转移，而甘油三酯(TG)则由LDL和VLDL向HDL转移[2]。Koizumi首先报道CETP遗传性缺陷引起高α-脂蛋白血症[3]，Brown和Inazu进一步阐明了该病例CETP缺陷的分子基础为该基因内含子14+1位置核苷酸G→A突变所致转录拼接障碍[4,5]。迄今尚无在日本裔人群之外关于CETP变异体的报道。本研究首先在欧洲人群中发现一新的CETP变异体Ile405Val，并探讨其在德意志和意大利人群中出现的频率及其对血脂代谢的影响。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 研究对象
自1993年2月至1994年7月，在明斯特大学附属医院脂质专科门诊就诊的患者中，选择其HDL-C水平高于第95 %百分位数以上者39例，年龄19～79岁，男5例，女34例，所有入选者其HDL-C均高于1.80 mmol/L。收集这些病例的全血标本，采用荧光直读法对其CETP基因进行序列分析，以期发现潜在的CETP基因突变位点。
1.2 DNA的分离
按改良之Higuchi[6]方法，EDTA抗凝全血0.5 ml加等量Lysis缓冲液在Eppendorf管内混匀，以8 000 r/min于台式离心机离心3 min，吸去上清液，沉淀以Lysis缓冲液反复洗涤，直至获得浅黄色沉淀为止。后者以0.5 ml非离子去垢剂缓冲液加30 μg蛋白酶K混匀，于55℃水浴2 h，继而煮沸10 min，最后贮存于-20℃备用。
, 百拇医药
1.3 引物的设计与合成
CETP全基因序列分析应包括16个外显子及其转录拼接区域、5′和3′端调节区域，相应地拟对CETP基因分为16段进行扩增和测序。引物设计按Agellon[7]报道的CETP基因组序列为标准，每段基因扩增均采用一个生物素(Biotin)标记的引物和一个作用于对应链的外侧引物，该段基因测序则另用一个作用于对应链并标记荧光素(FITC)的内侧引物。CETP第14外显子的扩增与测序所用的引物为：5′-Biotin-GGTGAAATGGGAAGCTCTGTC-AGCC-3′，5′-GGGCATGAGGATGAATGCTTG-TCCA-3′，5′-FITC-CTTGTGGGTCACTTCTGT-GCTCCAGG-3′。其余引物的核苷酸组成从略。所有引物均在DNA-Synthesizer (Gene-Assembler○ R-Plus, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden)合成。
, 百拇医药
1.4 聚合酶链反应(PCR)
采用Perkin Elmer公司9600基因扩增仪，对需要分段测序的DNA用自编Touch-Down程序体外扩增。PCR反应条件为：Tris-HCl(pH 9.5)10 mmol/L，KCl 50 mmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，Gelatin 0.01%，Triton X-100 0.1%，dNTP各为0.2 mmol/L，生物素标记引物0.2μm，对应链引物0.4μm，基因组DNA 1μg，SuperTaq DNA聚合酶0.5 U，反应体积为50μl。上述反应溶液置于基因扩增仪，变性94℃ 30s，延伸72℃45s，而退火温度随着循环次数的增加从68℃逐渐降至62 ℃，总循环次数为46。
1.5 荧光直读法DNA序列分析
以Sanger[8]的末端终止法进行DNA序列分析，采用Pharmacia公司生产的试剂盒Sequencing Kit按操作说明完成测序反应；反应产物在ALF(Automated Laser Fluorescence) DNA Sequencer (Pharmacia, Freiburg, Germany) 上进行凝胶电泳，并由DNA序列分析软件ALF Manager完成DNA序列数据的采集、存储和读取。
, 百拇医药
1.6 血清脂质的测定
血清TG和总胆固醇(T-Chol)的定量按酶学方法进行；血清经过磷钨酸/MgCl2沉淀后的上清液按酶学方法测定HDL-C。
1.7 致突变分离聚合酶链反应(MS-PCR)
通过基因测序分析我们发现了CETP第405密码子(位于第14外显子)中第1个核苷酸腺嘌呤(A)为鸟嘌呤(G)所取代的误义突变，导致第405位异亮氨酸残基突变为缬氨酸残基(Ile405Val)。以检测等位基因特异性的引物，采用MS-PCR技术[9]，可以特异地鉴别某一位点不同的基因型，尤其适用于调查人群中某一基因型出现的频率以及基因型与表现型的相关性。用于MS-PCR的引物如下：检测405-Ile-Allele的特异性引物MS1的寡核苷酸组成为：5′-ACCTCAGGGATGCCCACAGCCCTGAT-CATTGACTGCAGGAAGCTCTGGTT-3′；检测405-Val-Allele的特异性引物MS2为：5′-GGTGATCATTGACTGCAGGAAGCTCTGCAC-3′；对应链引物为：5′-GGGCATGAGGATGAATGC-TTGTCCA-3′。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 CETP变异体Ile405Val的发现
在39例高HDL-C就诊者中，发现有16例系同一新的CETP基因误义突变携带者，其CETP基因第405位密码子中第1个核苷酸腺嘌呤(A)为鸟嘌呤(G)所取代，因而导致第405位异亮氨酸残基突变为缬氨酸残基(Ile405Val)，其中11例为杂合子(405, I/V)，5例纯合子(405, V/V)。在这组就诊者中突变的等位基因405-Val-Allele频率为0.27。
2.2 检测CETP Ile405Val突变位点的MS-PCR
通过在特定位置故意错配碱基可以提高检测两个等位基因的特异性，避免其交叉反应；以不同长度设计两个特异性引物就可以通过对MS-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳将其分离开，从而显示出相应的基因型。检测CETP Ile405Val突变位点的MS-PCR结果见附图。
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附图 检测CETP Ile405Val基因型的MS-PCR产物电泳图
第1，2泳道为CETP Ile405Val突变纯合子，第3，4泳道为杂合子，第5，6泳道为野生型；M为标准DNA。
2.3 CETP Ile405Val变异体在不同人群中出现的频率及其对血脂的影响
为了探讨CETP Ile405Val突变对血脂代谢影响的普遍性意义，我们分别对德意志和意大利人群中Ile405Val出现的频率及其与血脂的相关性进行了比较研究。结果表明这一基因突变点均出现在两种人群中，但呈现出不同的频率(0.30 vs 0.40)，其差异有极显著性意义。从表1和表2可以看出，CETP Ile405Val突变纯合子与野生型和杂合子比较，其血清HDL-C均显著升高(P<0.01)；血清TG呈下降趋势，但无显著性意义。
表1 CETP Ile405Val在德意志正常人群出现的频率及其对血脂的影响(mmol/L，
±s) 基因型
, http://www.100md.com
N
TG
T-Chol
HDL-C
405, I/I
242
1.25±0.70
5.15±1.11
1.30±0.40
405, I/V
201
1.19±0.78
, 百拇医药 5.23±1.19
1.35±0.38
405, V/V
48
1.06±0.57
5.15±1.01
1.52±0.50**
与野生型(405, I/I)和杂合子(405, I/V)比较均为 **P<0.01。突变的等位基因(Val-Allele)频率为0.3表2 CETP Ile405Val在意大利正常人群出现的频率及其对血脂的影响(mmol/L，±s) 基因型
, http://www.100md.com
N
TG
T-Chol
HDL-C
405, I/I
218
1.51±1.04
6.11±1.19
1.21±0.34
405, I/V
249
1.50±1.15
, http://www.100md.com 6.11±1.17
1.28±0.43
405, V/V
106
1.29±0.62
6.19±1.32
1.38±0.43**
与野生型(405, I/I)和杂合子(405, I/V)比较均为 **P<0.01。突变的等位基因(Val-Allele)频率为0.43 讨 论
自从Albers[10]首次从血清中分离出CETP，人们以极大的兴趣对其生理功能和生化性质进行了长期大量的探索研究。CETP是一疏水而亲脂性特强的蛋白质，其主要功能在于促进CE从HDL向LDL及VLDL转移，作为交换TG则由VLDL和LDL向HDL转移，因而是HDL代谢酶系的重要组分之一。Koizumi[3]等首次发现CETP的遗传性缺陷引起高HDL血症，而高HDL水平被认为具有抗动脉硬化作用，特别是当初发现此遗传缺陷的携带者似乎呈现长寿性倾向时，使CETP的分子遗传学研究倍受关注。
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我们收集了在脂质专科门诊就诊的高HDL血症者的血液标本，采用快速可靠的基因测序技术ALF Technique对这批就诊者进行了CETP的全基因分析。结果首次在日本裔人群之外发现CETP新的误义突变位点，在39例高HDL血症者中发现16例为CETP基因新的误义突变携带者，即CETP基因第405位密码子中第1个核苷酸腺嘌呤A为鸟嘌呤G所取代，因而导致第405位异亮氨酸残基突变为缬氨酸残基Ile405Val，其中5例纯合子，11例杂合子。在这组就诊者中突变的等位基因Val-Allele频率为0.27，根据等位基因分布的平衡公式计算可知，Val-Allele纯合子在这组高HDL血症就诊者中获得高表达，从而提示Val-Allele与升高HDL水平的相关可能性。
为了进一步探讨CETP Ile405Val对HDL代谢的影响，我们收集了德意志和意大利部分地区正常人群的血液标本，采用MS-PCR技术对其进行了基因型和表现型的对比研究。结果表明，CETP Ile405Val均出现在所选择的两种欧州人群中，突变纯合子与野生型和杂合子比较，其血清HDL-C均显著升高(P<0.01)；杂合子与野生型比较，虽然其HDL-C亦有一定程度的升高，但无显著性意义；纯合子血清TG呈下降趋势，但亦无显著性意义。虽然杂合子HDL-C的增高与野生型比较无显著差别，这可能是限于样本例数，或是在杂合状态下CETP-405-Val等位基因对HDL代谢的影响不显著所致。但综合起来看，突变的CETP-405-Val等位基因对血清HDL-C的影响似成一定的基因-剂量关系。
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业已证明若干HDL的构成载脂蛋白(apo)，如apo AI、apo E等和参与HDL代谢的酶，如卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、肝脂酶(HL)等的遗传变异可影响携带者的血清HDL水平，除apo E的遗传多态性可影响人群的平均HDL水平外，上述其余遗传变异皆因其等位基因出现频率很低而不足以引起人群HDL的变化。本研究表明，CETP Ile405Val为一频发误义突变，均出现在两种人群，均与HDL的升高密切相关，且其等位基因出现频率高达0.30～0.40，因而提示CETP Ile405Val突变对人群HDL水平的影响具普遍性意义。CETP Ile405Val突变在德意志和意大利人群中出现的频率明显不同(P<0.01)，这或许是不同人群血清HDL平均水平差异的遗传学因素之一。
作者简介：陆付耳，男，1963年生，副教授，医学博士
参考文献
1 Gordon D, Rifkind B M. Current concepts: high density lipoprotein：the clinical implications of recent studies. N Engl J Med, 1989, 321:1 311
, 百拇医药
2 Tall A R. Plasma lipid transfer protein. Annu Rev Biochem, 1995, 64:235
3 Koizumi J, Mabuchi H, Yoshimura A et al. Deficiency of serum cholesteryl ester transfer activity in patients with familial hyperalphalipoproteinemia. Atherosclerosis, 1985; 58:175
4 Brown M L, Inazu A, Hesler C B et al. Molecular basis of lipid transfer protein deficiency in a family with increased high density lipoproteins. Nature, 1989, 342: 448
, http://www.100md.com
5 Inazu A, Brown M L, Hersler C B et al. Increased high density lipoprotein levels caused by a common cholesteryl ester transfer protein gene mutation. N Engl J Med, 1990, 323: 1 234
6 Higuchi R. Simple and rapid preparation of samples for PCR. In: Ehrlich H A eds. PCR-Technology, principles and applications for DNA amplification. New York: Stockton Press, 1989. 31～38
7 Agellon L, Quinet E, Gillette T et al. Organization of the human cholesteryl ester transfer protein gene. Biochemistry, 1990, 29:1 372
, 百拇医药
8 Sanger F, Coulson A R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol, 1975, 94: 441
9 Rust S, Funke H, Assmann G. Mutagenically separated PCR (MS-PCR): a highly specific one step procedure for easy mutation detection. Nucl Acids Res, 1993, 21: 3 623
10 Albers J J, Tollefson J H, Cheng C H et al. Isolation and characterization of human plasma lipid transfer proteins. Arteriosclerosis, 1984, 4: 49
收稿日期：1998-04-01, http://www.100md.com
单位：陆付耳 黄光英 李鸣真 叶望云 同济医科大学附属同济医院中西医结合研究所，武汉 430030；Heiko Wiebusch Harald Funke Gerd Assmann 德国明斯特大学动脉硬化研究所，Mnster D-48129
关键词：胆固醇酯转运蛋白；基因突变；脂蛋白类；高密度
同济医科大学学报990220 Heiko Wiebusch Harald Funke Gerd Assmann
摘要 通过聚合酶链反应(PCR)技术扩增胆固醇酯转运蛋白(CETP)基因，继而采用荧光直读法测定CETP基因DNA序列，首次发现一频发CETP基因突变点，即CETP第405位异亮氨酸残基(Ile)为缬氨酸残基(Val)取代(Ile405Val)。用分子流行病学方法进一步研究表明该CETP基因变异体在德意志和意大利人群中出现频率显著不同(0.30 vs 0.40, P<0.01)，但均与血清高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)的升高密切相关(均为P<0.01)。
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中图法分类号 Q343.1, Q513.5
Identification of A Novel Missense Mutation of Cholesteryl Ester Transfer
Protein Gene-Ile405Val and Its Influence on the Metabolism of High
Density Lipoprotein
Lu Fuer, Huang Guangying, Li Mingzhen et al
Institute of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Tongji Hospital,Tongji Medical University, Wuhan 430030
, 百拇医药
Abstract The human genomic DNA of cholesteryl ester transfer protein (CETP) was amplified by using polymerase chain reaction (PCR) and its sequences were analyzed in the patients with hyperalphalipoproteinemia using automated laser fluorescence technique. A novel frequent missense mutation of CETP gene with the substitution of isoleucine to valine in codon 405 was firstly identified. This genetic variant of CETP was found in both German and Italian populations and closely correlated to the increase of serum high density lipoprotein cholesterol (P<0.01), but with different allele frequency (0.30 vs 0.40, P<0.01).
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Key words cholesteryl ester transfer protein; gene mutation; high density lipoprotein
流行病学资料提示冠心病(CHD)的发病率与血清高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)水平呈显著负相关[1]。HDL参与的胆固醇逆向转运被认为具有抗动脉硬化作用，为冠心病的保护因子。胆固醇酯转运蛋白(CETP)是胆固醇逆向转运生理过程的一个重要组分，介导胆固醇酯(CE)从HDL向低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)转移，而甘油三酯(TG)则由LDL和VLDL向HDL转移[2]。Koizumi首先报道CETP遗传性缺陷引起高α-脂蛋白血症[3]，Brown和Inazu进一步阐明了该病例CETP缺陷的分子基础为该基因内含子14+1位置核苷酸G→A突变所致转录拼接障碍[4,5]。迄今尚无在日本裔人群之外关于CETP变异体的报道。本研究首先在欧洲人群中发现一新的CETP变异体Ile405Val，并探讨其在德意志和意大利人群中出现的频率及其对血脂代谢的影响。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 研究对象
自1993年2月至1994年7月，在明斯特大学附属医院脂质专科门诊就诊的患者中，选择其HDL-C水平高于第95 %百分位数以上者39例，年龄19～79岁，男5例，女34例，所有入选者其HDL-C均高于1.80 mmol/L。收集这些病例的全血标本，采用荧光直读法对其CETP基因进行序列分析，以期发现潜在的CETP基因突变位点。
1.2 DNA的分离
按改良之Higuchi[6]方法，EDTA抗凝全血0.5 ml加等量Lysis缓冲液在Eppendorf管内混匀，以8 000 r/min于台式离心机离心3 min，吸去上清液，沉淀以Lysis缓冲液反复洗涤，直至获得浅黄色沉淀为止。后者以0.5 ml非离子去垢剂缓冲液加30 μg蛋白酶K混匀，于55℃水浴2 h，继而煮沸10 min，最后贮存于-20℃备用。
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1.3 引物的设计与合成
CETP全基因序列分析应包括16个外显子及其转录拼接区域、5′和3′端调节区域，相应地拟对CETP基因分为16段进行扩增和测序。引物设计按Agellon[7]报道的CETP基因组序列为标准，每段基因扩增均采用一个生物素(Biotin)标记的引物和一个作用于对应链的外侧引物，该段基因测序则另用一个作用于对应链并标记荧光素(FITC)的内侧引物。CETP第14外显子的扩增与测序所用的引物为：5′-Biotin-GGTGAAATGGGAAGCTCTGTC-AGCC-3′，5′-GGGCATGAGGATGAATGCTTG-TCCA-3′，5′-FITC-CTTGTGGGTCACTTCTGT-GCTCCAGG-3′。其余引物的核苷酸组成从略。所有引物均在DNA-Synthesizer (Gene-Assembler○ R-Plus, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden)合成。
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1.4 聚合酶链反应(PCR)
采用Perkin Elmer公司9600基因扩增仪，对需要分段测序的DNA用自编Touch-Down程序体外扩增。PCR反应条件为：Tris-HCl(pH 9.5)10 mmol/L，KCl 50 mmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，Gelatin 0.01%，Triton X-100 0.1%，dNTP各为0.2 mmol/L，生物素标记引物0.2μm，对应链引物0.4μm，基因组DNA 1μg，SuperTaq DNA聚合酶0.5 U，反应体积为50μl。上述反应溶液置于基因扩增仪，变性94℃ 30s，延伸72℃45s，而退火温度随着循环次数的增加从68℃逐渐降至62 ℃，总循环次数为46。
1.5 荧光直读法DNA序列分析
以Sanger[8]的末端终止法进行DNA序列分析，采用Pharmacia公司生产的试剂盒Sequencing Kit按操作说明完成测序反应；反应产物在ALF(Automated Laser Fluorescence) DNA Sequencer (Pharmacia, Freiburg, Germany) 上进行凝胶电泳，并由DNA序列分析软件ALF Manager完成DNA序列数据的采集、存储和读取。
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1.6 血清脂质的测定
血清TG和总胆固醇(T-Chol)的定量按酶学方法进行；血清经过磷钨酸/MgCl2沉淀后的上清液按酶学方法测定HDL-C。
1.7 致突变分离聚合酶链反应(MS-PCR)
通过基因测序分析我们发现了CETP第405密码子(位于第14外显子)中第1个核苷酸腺嘌呤(A)为鸟嘌呤(G)所取代的误义突变，导致第405位异亮氨酸残基突变为缬氨酸残基(Ile405Val)。以检测等位基因特异性的引物，采用MS-PCR技术[9]，可以特异地鉴别某一位点不同的基因型，尤其适用于调查人群中某一基因型出现的频率以及基因型与表现型的相关性。用于MS-PCR的引物如下：检测405-Ile-Allele的特异性引物MS1的寡核苷酸组成为：5′-ACCTCAGGGATGCCCACAGCCCTGAT-CATTGACTGCAGGAAGCTCTGGTT-3′；检测405-Val-Allele的特异性引物MS2为：5′-GGTGATCATTGACTGCAGGAAGCTCTGCAC-3′；对应链引物为：5′-GGGCATGAGGATGAATGC-TTGTCCA-3′。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 CETP变异体Ile405Val的发现
在39例高HDL-C就诊者中，发现有16例系同一新的CETP基因误义突变携带者，其CETP基因第405位密码子中第1个核苷酸腺嘌呤(A)为鸟嘌呤(G)所取代，因而导致第405位异亮氨酸残基突变为缬氨酸残基(Ile405Val)，其中11例为杂合子(405, I/V)，5例纯合子(405, V/V)。在这组就诊者中突变的等位基因405-Val-Allele频率为0.27。
2.2 检测CETP Ile405Val突变位点的MS-PCR
通过在特定位置故意错配碱基可以提高检测两个等位基因的特异性，避免其交叉反应；以不同长度设计两个特异性引物就可以通过对MS-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳将其分离开，从而显示出相应的基因型。检测CETP Ile405Val突变位点的MS-PCR结果见附图。
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附图 检测CETP Ile405Val基因型的MS-PCR产物电泳图
第1，2泳道为CETP Ile405Val突变纯合子，第3，4泳道为杂合子，第5，6泳道为野生型；M为标准DNA。
2.3 CETP Ile405Val变异体在不同人群中出现的频率及其对血脂的影响
为了探讨CETP Ile405Val突变对血脂代谢影响的普遍性意义，我们分别对德意志和意大利人群中Ile405Val出现的频率及其与血脂的相关性进行了比较研究。结果表明这一基因突变点均出现在两种人群中，但呈现出不同的频率(0.30 vs 0.40)，其差异有极显著性意义。从表1和表2可以看出，CETP Ile405Val突变纯合子与野生型和杂合子比较，其血清HDL-C均显著升高(P<0.01)；血清TG呈下降趋势，但无显著性意义。
表1 CETP Ile405Val在德意志正常人群出现的频率及其对血脂的影响(mmol/L，
±s) 基因型, http://www.100md.com
N
TG
T-Chol
HDL-C
405, I/I
242
1.25±0.70
5.15±1.11
1.30±0.40
405, I/V
201
1.19±0.78
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1.35±0.38
405, V/V
48
1.06±0.57
5.15±1.01
1.52±0.50**
与野生型(405, I/I)和杂合子(405, I/V)比较均为 **P<0.01。突变的等位基因(Val-Allele)频率为0.3表2 CETP Ile405Val在意大利正常人群出现的频率及其对血脂的影响(mmol/L，
±s) 基因型, http://www.100md.com
N
TG
T-Chol
HDL-C
405, I/I
218
1.51±1.04
6.11±1.19
1.21±0.34
405, I/V
249
1.50±1.15
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1.28±0.43
405, V/V
106
1.29±0.62
6.19±1.32
1.38±0.43**
与野生型(405, I/I)和杂合子(405, I/V)比较均为 **P<0.01。突变的等位基因(Val-Allele)频率为0.43 讨 论
自从Albers[10]首次从血清中分离出CETP，人们以极大的兴趣对其生理功能和生化性质进行了长期大量的探索研究。CETP是一疏水而亲脂性特强的蛋白质，其主要功能在于促进CE从HDL向LDL及VLDL转移，作为交换TG则由VLDL和LDL向HDL转移，因而是HDL代谢酶系的重要组分之一。Koizumi[3]等首次发现CETP的遗传性缺陷引起高HDL血症，而高HDL水平被认为具有抗动脉硬化作用，特别是当初发现此遗传缺陷的携带者似乎呈现长寿性倾向时，使CETP的分子遗传学研究倍受关注。
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我们收集了在脂质专科门诊就诊的高HDL血症者的血液标本，采用快速可靠的基因测序技术ALF Technique对这批就诊者进行了CETP的全基因分析。结果首次在日本裔人群之外发现CETP新的误义突变位点，在39例高HDL血症者中发现16例为CETP基因新的误义突变携带者，即CETP基因第405位密码子中第1个核苷酸腺嘌呤A为鸟嘌呤G所取代，因而导致第405位异亮氨酸残基突变为缬氨酸残基Ile405Val，其中5例纯合子，11例杂合子。在这组就诊者中突变的等位基因Val-Allele频率为0.27，根据等位基因分布的平衡公式计算可知，Val-Allele纯合子在这组高HDL血症就诊者中获得高表达，从而提示Val-Allele与升高HDL水平的相关可能性。
为了进一步探讨CETP Ile405Val对HDL代谢的影响，我们收集了德意志和意大利部分地区正常人群的血液标本，采用MS-PCR技术对其进行了基因型和表现型的对比研究。结果表明，CETP Ile405Val均出现在所选择的两种欧州人群中，突变纯合子与野生型和杂合子比较，其血清HDL-C均显著升高(P<0.01)；杂合子与野生型比较，虽然其HDL-C亦有一定程度的升高，但无显著性意义；纯合子血清TG呈下降趋势，但亦无显著性意义。虽然杂合子HDL-C的增高与野生型比较无显著差别，这可能是限于样本例数，或是在杂合状态下CETP-405-Val等位基因对HDL代谢的影响不显著所致。但综合起来看，突变的CETP-405-Val等位基因对血清HDL-C的影响似成一定的基因-剂量关系。
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业已证明若干HDL的构成载脂蛋白(apo)，如apo AI、apo E等和参与HDL代谢的酶，如卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、肝脂酶(HL)等的遗传变异可影响携带者的血清HDL水平，除apo E的遗传多态性可影响人群的平均HDL水平外，上述其余遗传变异皆因其等位基因出现频率很低而不足以引起人群HDL的变化。本研究表明，CETP Ile405Val为一频发误义突变，均出现在两种人群，均与HDL的升高密切相关，且其等位基因出现频率高达0.30～0.40，因而提示CETP Ile405Val突变对人群HDL水平的影响具普遍性意义。CETP Ile405Val突变在德意志和意大利人群中出现的频率明显不同(P<0.01)，这或许是不同人群血清HDL平均水平差异的遗传学因素之一。
作者简介：陆付耳，男，1963年生，副教授，医学博士
参考文献
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10 Albers J J, Tollefson J H, Cheng C H et al. Isolation and characterization of human plasma lipid transfer proteins. Arteriosclerosis, 1984, 4: 49
收稿日期：1998-04-01, http://www.100md.com