P16基因在妊娠滋养细胞肿瘤中的表达及其意义
作者：王祥珍 王大刚 许学先
单位：(王祥珍)广东医学院附属医院妇产科，湛江 524001 (王大刚 许学先)湖北医科大学附属第一医院妇产科，武汉 430060)
关键词：滋养层肿瘤；肿瘤抑制基因；基因表达；免疫组织化学
广东医学院学报990202 摘要 目的：探讨抑癌基因P16的表达水平与妊娠滋养细胞肿瘤的形成及转移倾向的相关性。方法：采用免疫组织化学方法，检测葡萄胎30例、侵蚀性葡萄胎25例、绒毛膜癌26例及正常绒毛25例的滋养细胞中P16的表达。结果：(1)P16在妊娠滋养细胞肿瘤中有较高的表达，阳性率为74.5%(其中侵蚀性葡萄胎72.0%，绒毛膜癌76.9%)，明显高于葡萄胎组(20.0%)和正常绒毛组(16.0%)，差异有高度显著性(P<0.01)；(2)伴有转移的14例妊娠滋养细胞肿瘤中的P16阳性表达率(35.7%)明显低于37例不伴转移者(89.2%)，差异有高度显著性(P<0.01)；(3)在复发及癌死亡的病例中 P16为阴性表达。结论：P16基因可能在妊娠滋养细胞肿瘤的形成及转移过程中起调节作用，其表达水平与妊娠滋养细胞肿瘤的转移、恶性程度及预后呈负相关。
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Expression and significance of P16 in gestational trophoblastic tumor
Wang Xiangzhen，Wang Dagang，Xu Xuexian
Department of Gynecology and Obstetrics，Affiliated Hospital of
Guangdong Medical College，Zhanjiang 524001
Abstract Objective：To investigate the relationship between P16 gene expression and occurrence，metastasis of gestational trophoblastic tumor.Methods:The expression of P16 protein was determined in formalin fixed，paraffin embedded tissues from 25 normal chorion tissue，30 hydatidiform mole，51 gestational trophoblastic tumor (including 25 invasive hydatidiform mole and 26 choriocarcinoma)，with immunohistochemical technique.Results:(1)4 out of 25 normal chorion tissue showed P16 expression(16.0%)，while 6 out of 30(20.0%)hydatidiform mole cases were positive，and 38 out of 51(74.5%)cases of gestational trophoblastic tumor showed the same phenomen on，this last group including 18 of 25 invasive hydatidiform mole(77.0%)and 20 of 26 of choriocarcinoma (76.9%).There was significant difference in P16 expression between gestational trophoblastic tumor and hydatidiform mole or normal chorion group (P<0.01)；(2)The positive rate (35.7%)of P16 expression was significantly lower in 14 trophoblastic tumor cases with metastasis than in 37 trophoblastic tumor without metastasis (P<0.01)；and(3)There was no expression in tissues of reccurrence and death cases.Conclusions：P16 gene might participate in regulation of occurrence and metastasis process in gestational trophoblastic tumor.The level of expression of P16 is negative correlation with metastasis and prognosis of gestational trophoblastic tumor.
, 百拇医药
Key words:trophoblastic tumor；genes，suppressor tumor；gene expression；immunohistochemistry
P16为细胞周期素依赖性激酶(cdk4)的抑制蛋白。新近研究发现，P16基因在许多肿瘤中有缺失或突变。我们用免疫组化法检测P16基因在妊娠滋养细胞肿瘤中的表达水平，以探索其与妊娠滋养细胞肿瘤的发生、转移和预后的关系。
1 材料与方法
1.1标本 本组81例妊娠滋养细胞疾病标本取自湖北医科大学附属医院1990年4月～1994年5月吸宫术或手术切除标本(术前未经化疗)，并经病理证实且有完整的随访资料。分三组：葡萄胎30例；妊娠滋养细胞肿瘤为51例：侵蚀性葡萄胎25例(其中阴道转移1例，肺转移1例)，绒毛膜癌26例(其中阴道转移3例，肺转移6例，肾转移2例，乙状结肠移1例)。有转移灶者14例均有临床资料、病理及B超、胸片、CT等辅助诊断资料。临床分期采用宋鸿钊提出的分期标准，Ⅰ期，37例(绒毛膜癌14例；侵蚀性葡萄胎23例)。Ⅱ期：4例(绒毛膜癌3例侵蚀性葡萄胎1例)。Ⅲ期：7例(绒毛膜癌6例；侵蚀性葡萄胎1例)。Ⅳ期：3例，均为绒毛膜癌。癌死亡3例均匀晚期复发。25例正常绒毛组织取自早孕吸宫术中，标本均经10%福尔马林固定，石蜡包埋切片，片厚4μm，作为正常对照组。
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1.2 试剂 S-P试剂盒、兔抗P16多克隆抗体、柠檬酸盐缓冲液均购自福州迈新生物技术开发公司，为即用型产品。
1.3 免疫组化染色 切片常规脱蜡水化，浸于0.01 M柠檬酸盐缓冲液中，置于微波炉内加热至微沸(98～100℃)，并持续8～10 min，取出冷却10 min，PBS(磷酸盐缓冲液)冲洗3×2 min，以下按SP法进行免疫组化染色。阴性对照采用PBS代替一抗。
1.4 结果判断 免疫组化阳性指标为棕黄色，根据棕黄色颗粒有无及强弱，分为阴性(一)：切片中无阳性细胞；弱阳性(+)：部分肿瘤细胞(<50%)显色；强阳性(++)：绝大部分肿瘤细胞(≥50%)显色。
1.5 统计学分析 本研究结果采用x2检验及确切概率法进行统计学处理。患者随访均在3 a以上，无1例失访。
, 百拇医药 2 结果
P16在滋养细胞中的表达阳性染色定位于细胞浆，部分兼有细胞膜着色，未见细胞核染色，见图1，2。
图1 绒毛膜癌中，P16阳性物质着色呈棕黄色。位于胞浆SP免疫组化染色×400
图2 侵蚀性葡萄胎中，P16阳性物质着色呈棕黄色，位于胞浆。SP免疫组化染色×400
51例妊娠滋养细胞肿瘤中，38例呈阳性，绒毛膜癌20例，侵蚀性萄萄胎18例，葡萄胎中6例呈阳性，正常绒毛组织中4例呈阳性。妊娠滋养细胞肿瘤中P16阳性表达率与葡萄胎组及正常绒毛组相比，差异有非常显著意义(P<0.01)，见表1。
, 百拇医药
表1 P16各组滋养细胞中的表达 组别
总例数
P16的表达
-
+
++
阳性率(%)
正常绒毛
25
21
2
2
, http://www.100md.com 16.0
葡萄胎
30
24
4
2
20.0*
妊娠滋养细胞肿瘤
51
13
14
24
74.5**
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*与妊娠滋养细胞肿瘤组比P<0.01 **与正常绒毛组比P<0.01
在伴有转移的14例妊娠滋养细胞肿瘤中5例呈阳性，无转移的37例任娠滋养细胞肿瘤中33例呈阳性。两者P16阳性表达率相比，差异有极显著性(P<0.01)，见表2。表2 P16的表达与妊娠滋养细胞肿瘤转移的关系 组别
总例数
P16的表达
-
+
++
阳性率(%)
无转移
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37
4
11
22
89.2
有转移
14
9
2
3
35.7*
* P<0.01
3例癌死亡病例中P16均为阴性表达。3 讨论
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3.1肿瘤组织中P16的基本功能及变异 近年来，人们发现细胞周期调节蛋白的异常表达是癌变的重要原因[1]。正常情况下，P16蛋白通过与cdk4结合，抑制cdk4的活性，使之不能解除成视网膜细胞瘤易感基因(Rb)对转录因子的抑制，从而阻止细胞从G1期进入S期(DNA合成期)，使细胞分裂和增殖受阻[2]。因此 P16功能丧失，会导致cdk4对Rb的调节障碍，使Rb处于持久的磷酸化状态，引发细胞恶性增殖[3]。另据报道，Rb在晚G1期的失活是依赖于P16的表达增高从而抑制cdk4的活性而达到的。这种负反馈模型预示着Rb阴性肿瘤具有较高的水平的P16表达，而Rb阳性肿瘤则可能需要P16的功能降低，以使cdk4活性提高至足以使Rb失活[4，5]。有关P16在多种肿瘤中表达的研究越来越多，但对在妊娠滋养细胞肿瘤中P16表达的免疫组织化学研究报道极少。
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3.2 P16的表达与妊娠滋养细胞肿瘤发生的关系 目前已发现食管、膀胱、头颈、肺、脑等肿瘤中，存在P16的丢失或表达缺失[5，6]。本组结果显示：P16蛋白在妊娠滋养细胞肿瘤中的阳性表达率为74.5%，明显高于葡萄胎组(20.0%)及正常绒毛组(16.0%)，差异有高度显著性(P<0.001)，提示P16高表达与妊娠滋养细胞肿瘤的发生密切相关，其可能的机制为：P16对Rb的调节作用为降调节，过高的P16在Rb阴性的肿瘤中将不发挥阻止细胞周期的生物学效应，从而参与这一部分妊娠滋养细胞肿瘤的形成过程。目前，已有大量文献报道了P16对Rb的调节机制[4，5，7]。
3.3 P16表达与妊娠滋养细胞肿瘤转移及预后的关系 大量研究表明，P16蛋白表达缺失或低表达与多种肿瘤的转移及恶性程度有关[5，8，9]。本研究结果表明：在有转移的14例妊娠滋养细胞肿瘤中，P16表达阳性率(35.7%)远低于无转移的妊娠滋养细胞肿瘤中的阳性率(89.2%)，差异有高度显著性(P<0.01)，提示P16的表达与妊娠滋养细胞肿瘤的转移呈负相关，说明P16的表达缺失或低表达对妊娠滋养细胞肿瘤演进及最终获得转移潜能产生重要作用。而且3例癌死亡的妊娠滋养细胞肿瘤中P16表达均为阴性，提示P16的表达在预测妊娠滋养细胞肿瘤的预后上可能有重大意义，即P16表达缺失的病例，预后较差。检测P16表达水平能否作为一个临床预后参数有待进一步扩大例数观察研究。由于妊娠滋养细胞肿瘤中Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期比例分散，例数较少，未进行统计学处理，P16表达与妊娠滋养细胞肿瘤分期的关系尚需扩大样本，做大量的研究才能得出结论。
, 百拇医药
4 参考文献
1 Sherre J. Mammalian G1，cyclins.Cell，1993，73：1059
2 Serromo M，Hannon GJ，Beach DA.A ew regulatory motifin cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/cdk4.Nature，1993，366：704
3 Shapiro GI，Edwards CD，kobzik L，et al.Reciprocal Rb in activation and P16 expression in primary lung cancers and cell lines.Cancer Res，1995，55：505
, 百拇医药
4 Lukas J，Parry D，Aagard L，et al.Retinoblastoma protein dependent cell-cycle inhibition by the tumor suppressor P16.Nature，1995，375：503
5 郑杰，周传农，萧枫，等.Rb、P16、细胞周期素D1蛋白在食管癌中的表达及其意义.中华病理学杂志，1996，25(6)：336～339
6 Cairns P.Rates of P16(MTS1) mutation in primary tumors with 9 P loss(technical comments).Science，1994，265：415
7 Yeager T，Studler W，Belair C，et al.Increased P16 levels correlate with Rb alterations in human urothelial cells.Cancer Res，1995，55：493
8 胡颖川，赵坡，王景艳，等.P16蛋白在胰腺癌中的表达的研究.中华医学会病理学会第六次全国学术会议(天律)，1995，9.15
9 杨红，郑维国，辛晓燕，等.抑癌基因P16在卵巢肿瘤组织中的表达.中华妇产科杂志，1996，11(31)：686～687
收稿日期：1998-12-20, http://www.100md.com
单位：(王祥珍)广东医学院附属医院妇产科，湛江 524001 (王大刚 许学先)湖北医科大学附属第一医院妇产科，武汉 430060)
关键词：滋养层肿瘤；肿瘤抑制基因；基因表达；免疫组织化学
广东医学院学报990202 摘要 目的：探讨抑癌基因P16的表达水平与妊娠滋养细胞肿瘤的形成及转移倾向的相关性。方法：采用免疫组织化学方法，检测葡萄胎30例、侵蚀性葡萄胎25例、绒毛膜癌26例及正常绒毛25例的滋养细胞中P16的表达。结果：(1)P16在妊娠滋养细胞肿瘤中有较高的表达，阳性率为74.5%(其中侵蚀性葡萄胎72.0%，绒毛膜癌76.9%)，明显高于葡萄胎组(20.0%)和正常绒毛组(16.0%)，差异有高度显著性(P<0.01)；(2)伴有转移的14例妊娠滋养细胞肿瘤中的P16阳性表达率(35.7%)明显低于37例不伴转移者(89.2%)，差异有高度显著性(P<0.01)；(3)在复发及癌死亡的病例中 P16为阴性表达。结论：P16基因可能在妊娠滋养细胞肿瘤的形成及转移过程中起调节作用，其表达水平与妊娠滋养细胞肿瘤的转移、恶性程度及预后呈负相关。
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Expression and significance of P16 in gestational trophoblastic tumor
Wang Xiangzhen，Wang Dagang，Xu Xuexian
Department of Gynecology and Obstetrics，Affiliated Hospital of
Guangdong Medical College，Zhanjiang 524001
Abstract Objective：To investigate the relationship between P16 gene expression and occurrence，metastasis of gestational trophoblastic tumor.Methods:The expression of P16 protein was determined in formalin fixed，paraffin embedded tissues from 25 normal chorion tissue，30 hydatidiform mole，51 gestational trophoblastic tumor (including 25 invasive hydatidiform mole and 26 choriocarcinoma)，with immunohistochemical technique.Results:(1)4 out of 25 normal chorion tissue showed P16 expression(16.0%)，while 6 out of 30(20.0%)hydatidiform mole cases were positive，and 38 out of 51(74.5%)cases of gestational trophoblastic tumor showed the same phenomen on，this last group including 18 of 25 invasive hydatidiform mole(77.0%)and 20 of 26 of choriocarcinoma (76.9%).There was significant difference in P16 expression between gestational trophoblastic tumor and hydatidiform mole or normal chorion group (P<0.01)；(2)The positive rate (35.7%)of P16 expression was significantly lower in 14 trophoblastic tumor cases with metastasis than in 37 trophoblastic tumor without metastasis (P<0.01)；and(3)There was no expression in tissues of reccurrence and death cases.Conclusions：P16 gene might participate in regulation of occurrence and metastasis process in gestational trophoblastic tumor.The level of expression of P16 is negative correlation with metastasis and prognosis of gestational trophoblastic tumor.
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Key words:trophoblastic tumor；genes，suppressor tumor；gene expression；immunohistochemistry
P16为细胞周期素依赖性激酶(cdk4)的抑制蛋白。新近研究发现，P16基因在许多肿瘤中有缺失或突变。我们用免疫组化法检测P16基因在妊娠滋养细胞肿瘤中的表达水平，以探索其与妊娠滋养细胞肿瘤的发生、转移和预后的关系。
1 材料与方法
1.1标本 本组81例妊娠滋养细胞疾病标本取自湖北医科大学附属医院1990年4月～1994年5月吸宫术或手术切除标本(术前未经化疗)，并经病理证实且有完整的随访资料。分三组：葡萄胎30例；妊娠滋养细胞肿瘤为51例：侵蚀性葡萄胎25例(其中阴道转移1例，肺转移1例)，绒毛膜癌26例(其中阴道转移3例，肺转移6例，肾转移2例，乙状结肠移1例)。有转移灶者14例均有临床资料、病理及B超、胸片、CT等辅助诊断资料。临床分期采用宋鸿钊提出的分期标准，Ⅰ期，37例(绒毛膜癌14例；侵蚀性葡萄胎23例)。Ⅱ期：4例(绒毛膜癌3例侵蚀性葡萄胎1例)。Ⅲ期：7例(绒毛膜癌6例；侵蚀性葡萄胎1例)。Ⅳ期：3例，均为绒毛膜癌。癌死亡3例均匀晚期复发。25例正常绒毛组织取自早孕吸宫术中，标本均经10%福尔马林固定，石蜡包埋切片，片厚4μm，作为正常对照组。
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1.2 试剂 S-P试剂盒、兔抗P16多克隆抗体、柠檬酸盐缓冲液均购自福州迈新生物技术开发公司，为即用型产品。
1.3 免疫组化染色 切片常规脱蜡水化，浸于0.01 M柠檬酸盐缓冲液中，置于微波炉内加热至微沸(98～100℃)，并持续8～10 min，取出冷却10 min，PBS(磷酸盐缓冲液)冲洗3×2 min，以下按SP法进行免疫组化染色。阴性对照采用PBS代替一抗。
1.4 结果判断 免疫组化阳性指标为棕黄色，根据棕黄色颗粒有无及强弱，分为阴性(一)：切片中无阳性细胞；弱阳性(+)：部分肿瘤细胞(<50%)显色；强阳性(++)：绝大部分肿瘤细胞(≥50%)显色。
1.5 统计学分析 本研究结果采用x2检验及确切概率法进行统计学处理。患者随访均在3 a以上，无1例失访。
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P16在滋养细胞中的表达阳性染色定位于细胞浆，部分兼有细胞膜着色，未见细胞核染色，见图1，2。
图1 绒毛膜癌中，P16阳性物质着色呈棕黄色。位于胞浆SP免疫组化染色×400
图2 侵蚀性葡萄胎中，P16阳性物质着色呈棕黄色，位于胞浆。SP免疫组化染色×400
51例妊娠滋养细胞肿瘤中，38例呈阳性，绒毛膜癌20例，侵蚀性萄萄胎18例，葡萄胎中6例呈阳性，正常绒毛组织中4例呈阳性。妊娠滋养细胞肿瘤中P16阳性表达率与葡萄胎组及正常绒毛组相比，差异有非常显著意义(P<0.01)，见表1。
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表1 P16各组滋养细胞中的表达 组别
总例数
P16的表达
-
+
++
阳性率(%)
正常绒毛
25
21
2
2
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葡萄胎
30
24
4
2
20.0*
妊娠滋养细胞肿瘤
51
13
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74.5**
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*与妊娠滋养细胞肿瘤组比P<0.01 **与正常绒毛组比P<0.01
在伴有转移的14例妊娠滋养细胞肿瘤中5例呈阳性，无转移的37例任娠滋养细胞肿瘤中33例呈阳性。两者P16阳性表达率相比，差异有极显著性(P<0.01)，见表2。表2 P16的表达与妊娠滋养细胞肿瘤转移的关系 组别
总例数
P16的表达
-
+
++
阳性率(%)
无转移
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37
4
11
22
89.2
有转移
14
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2
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35.7*
* P<0.01
3例癌死亡病例中P16均为阴性表达。3 讨论
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3.1肿瘤组织中P16的基本功能及变异 近年来，人们发现细胞周期调节蛋白的异常表达是癌变的重要原因[1]。正常情况下，P16蛋白通过与cdk4结合，抑制cdk4的活性，使之不能解除成视网膜细胞瘤易感基因(Rb)对转录因子的抑制，从而阻止细胞从G1期进入S期(DNA合成期)，使细胞分裂和增殖受阻[2]。因此 P16功能丧失，会导致cdk4对Rb的调节障碍，使Rb处于持久的磷酸化状态，引发细胞恶性增殖[3]。另据报道，Rb在晚G1期的失活是依赖于P16的表达增高从而抑制cdk4的活性而达到的。这种负反馈模型预示着Rb阴性肿瘤具有较高的水平的P16表达，而Rb阳性肿瘤则可能需要P16的功能降低，以使cdk4活性提高至足以使Rb失活[4，5]。有关P16在多种肿瘤中表达的研究越来越多，但对在妊娠滋养细胞肿瘤中P16表达的免疫组织化学研究报道极少。
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3.2 P16的表达与妊娠滋养细胞肿瘤发生的关系 目前已发现食管、膀胱、头颈、肺、脑等肿瘤中，存在P16的丢失或表达缺失[5，6]。本组结果显示：P16蛋白在妊娠滋养细胞肿瘤中的阳性表达率为74.5%，明显高于葡萄胎组(20.0%)及正常绒毛组(16.0%)，差异有高度显著性(P<0.001)，提示P16高表达与妊娠滋养细胞肿瘤的发生密切相关，其可能的机制为：P16对Rb的调节作用为降调节，过高的P16在Rb阴性的肿瘤中将不发挥阻止细胞周期的生物学效应，从而参与这一部分妊娠滋养细胞肿瘤的形成过程。目前，已有大量文献报道了P16对Rb的调节机制[4，5，7]。
3.3 P16表达与妊娠滋养细胞肿瘤转移及预后的关系 大量研究表明，P16蛋白表达缺失或低表达与多种肿瘤的转移及恶性程度有关[5，8，9]。本研究结果表明：在有转移的14例妊娠滋养细胞肿瘤中，P16表达阳性率(35.7%)远低于无转移的妊娠滋养细胞肿瘤中的阳性率(89.2%)，差异有高度显著性(P<0.01)，提示P16的表达与妊娠滋养细胞肿瘤的转移呈负相关，说明P16的表达缺失或低表达对妊娠滋养细胞肿瘤演进及最终获得转移潜能产生重要作用。而且3例癌死亡的妊娠滋养细胞肿瘤中P16表达均为阴性，提示P16的表达在预测妊娠滋养细胞肿瘤的预后上可能有重大意义，即P16表达缺失的病例，预后较差。检测P16表达水平能否作为一个临床预后参数有待进一步扩大例数观察研究。由于妊娠滋养细胞肿瘤中Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期比例分散，例数较少，未进行统计学处理，P16表达与妊娠滋养细胞肿瘤分期的关系尚需扩大样本，做大量的研究才能得出结论。
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4 参考文献
1 Sherre J. Mammalian G1，cyclins.Cell，1993，73：1059
2 Serromo M，Hannon GJ，Beach DA.A ew regulatory motifin cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/cdk4.Nature，1993，366：704
3 Shapiro GI，Edwards CD，kobzik L，et al.Reciprocal Rb in activation and P16 expression in primary lung cancers and cell lines.Cancer Res，1995，55：505
, 百拇医药
4 Lukas J，Parry D，Aagard L，et al.Retinoblastoma protein dependent cell-cycle inhibition by the tumor suppressor P16.Nature，1995，375：503
5 郑杰，周传农，萧枫，等.Rb、P16、细胞周期素D1蛋白在食管癌中的表达及其意义.中华病理学杂志，1996，25(6)：336～339
6 Cairns P.Rates of P16(MTS1) mutation in primary tumors with 9 P loss(technical comments).Science，1994，265：415
7 Yeager T，Studler W，Belair C，et al.Increased P16 levels correlate with Rb alterations in human urothelial cells.Cancer Res，1995，55：493
8 胡颖川，赵坡，王景艳，等.P16蛋白在胰腺癌中的表达的研究.中华医学会病理学会第六次全国学术会议(天律)，1995，9.15
9 杨红，郑维国，辛晓燕，等.抑癌基因P16在卵巢肿瘤组织中的表达.中华妇产科杂志，1996，11(31)：686～687
收稿日期：1998-12-20, http://www.100md.com