单纯疱疹病毒Ⅱ型感染极早期对离体人动脉平滑肌细胞原癌基因c-sis及c-myc表达的影响
作者：唐槐静 段胜仲 洪嘉玲
单位：
关键词：单纯疱疹病毒Ⅱ型感染；人动脉平滑肌细胞；原癌基因
中国循环杂志990210 摘要 目的:观察单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)感染极早期对离体人动脉平滑肌细胞(hASMC)原癌基因c-sis及c-myc表达的影响。方法:采用不同感染剂量的HSV-2吸附单层hASMC 1小时作为病毒感染细胞模型,应用Northern杂交方法观察上述原癌基因表达。结果:病毒吸附细胞后0分钟、30分钟、60分钟,病毒感染组[5感染复数(MOI)和10 MOI;MOI=空斑形成单位/细胞数(PFU/细胞数)]均比对照组的原癌基因c-sis、c-myc表达增加,且基因表达与感染时间也有关。结论:HSV-2感染可以诱导hASMC原癌基因c-sis、c-myc表达增加,该作用可能是病毒促进hASMC异常增殖进而参与动脉粥样硬化或血管成形术后再狭窄形成的分子机制之一。
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Effect of Immediate Early Stage Infection of Herpes Simplex Virus Type 2 on Expression of c-sis and c-myc Proto-oncogenes of Human Arterial Smooth Muscle Cells in Vitro
Tang Huaijing**,Duan Shengzhong,Hong Jialing.
Department of Biochemistry,Hubei Medical University,Wuhan(430071),Hubei
Abstract Objective:Herpesviruses have been implicated as etiologic factors in the pathogenesis of human atherosclerosis (AS) or post-angioplasty restenosis (RS).The effects of herpes simplex virus type 2 (HSV-2) immediate early stage infection on expression of c-sis and c-myc protooncogenes in vitro human arterial smooth muscle cells (hASMCs) was studied.Methods:HSV-2 at various dosages were used to adsorb onto the monolayer smooth muscle cell for 1 hour to establish virus-infected hASMCs model.Northern hybridization was used to observe the above mentioned proto-oncogenes expression.Results:Both c-sis and c-myc were highly expressed in the virus-infected groups(5 MOI and 10 MOI,the MOI=virus PFU/cells number)than the control groups,whenever 0,30 and 60 min after the virus adsorption.The enhanced expression of them also related to time course of the infection.Conclusion:The high expression of c-sis and c-myc in hASMCs after HSV-2 infection may be one of molecular mechanism of cells abnormally proliferation and thereby contributing to the formation of AS/RS.
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Key words Herpes simplex virus type 2 infection;Human arterial smooth muscle cells;Proto-oncogenes
目前认为,病毒感染是引起人类动脉粥样硬化及血管成形术后再狭窄的主要始动因子之一,特别是单纯疱疹病毒(HSV)和人巨细胞病毒(HCMV)[1]。研究表明,病毒感染血管壁后,可引起内皮细胞损伤和血液凝固;还可改变细胞脂质代谢及诱导细胞转化[2～4]。单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)是肿瘤脱氧核糖核酸(DNA)病毒,与一些癌瘤发生有关,而原癌基因的表达与肿瘤发生的相互关系一直在肿瘤学中备受关注;鉴于动脉粥样硬化/血管成形术后再狭窄也是以细胞增殖为主的病变,尤其是血管平滑肌细胞异常增殖又是二者的主要病理特征,有学者还把动脉粥样硬化称之为血管平滑肌细胞的“良性肿瘤”[5],故认为对HSV-2能否通过诱导血管平滑肌细胞原癌基因异常表达以促进细胞增殖值得研究。本文在建立胎儿主动脉平滑肌细胞(hASMC)实验材料的基础上,从与细胞增殖密切相关的原癌基因c-sis、c-myc着手,以期探讨HSV-2在动脉粥样硬化/血管成形术后再狭窄形成机制中的可能作用。
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1 材料与方法
胎儿主动脉平滑肌细胞培养:1997年2月～5月在无菌条件下取28周龄水囊引产健康胎儿主动脉胸腹段,采用贴块法进行hASMC培养[6],并进行光镜、电镜的形态学鉴定。
HSV-2增殖及感染性测定:按常规方法在Hep-2细胞中增殖HSV-2 333株(湖北医科大学病毒所提供),以空斑形成单位法测定其感染性。
HSV-2感染hASMC及实验分组:取生长良好的第6代hASMC,传代调整细胞密度为2.5×105/ml,接种50 ml培养瓶内,每瓶加5 ml细胞悬液。待细胞生长至单层的90%后弃培养液,换用含0.5%小牛血清培养液静止培养48小时,然后按实验分组给予不同处理。A组(未感染组):hASMC加无血清培养液0.5 ml;B组(低感染剂量组):hASMC加含5感染复数(MOI)HSV-2的无血清培养液0.5 ml;C组(高感染剂量组):hASMC加含10 MOI HSV-2的无血清培养液0.5 ml。细胞于37℃与HSV-2孵育1小时后弃病毒悬液,加入含20%小牛血清培养液培养,以病毒孵育细胞1小时后开始记时,各实验组分别于感染后0分钟、30分钟、60分钟终止培养。
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Northern杂交:采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法[7],分别提取各实验组hASMC总核糖核酸(RNA);取RNA 15 μg,经1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分离,应用向下印迹法将RNA转移到尼龙膜[8],与地高辛标记(随机引物法)的原癌基因c-sis、c-myc、β-actin互补脱氧核糖核酸(cDNA)探针进行杂交。
统计学处理:Northern杂交实验应用正交设计,并进行统计学处理。本实验涉及两因素(感染剂量:MOI;时间:分钟)、三水平(感染剂量:0 MOI、5 MOI、10 MOI;时间:0分钟、30分钟、60分钟),采用L9(34)正交表。
2 结果
2.1 人动脉平滑肌细胞总核糖核酸纯度的鉴定
电泳结果显示:正常和病毒感染的hASMC总RNA 18 S和28 S两条区带均呈完整状态,RNA样品无降解;无细胞及病毒脱氧核糖核酸(DNA)混杂。
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2.2 单纯疱疹病毒Ⅱ型感染极早期对人动脉平滑肌细胞原癌基因c-sis及c-myc表达的影响
从附图的杂交信号可知,hASMC在5 MOI、10 MOI HSV-2孵育后的0分钟、30分钟、60分钟时,原癌基因c-sis、c-myc表达均比未感染组增加,且随病毒剂量的增高、时间的延长呈上升趋势。杂交带在590 nm处用双波长色谱扫描仪扫描,结果进行正交设计的统计学处理:直观分析表明高感染剂量组(10 MOI)中的感染较长时间(60 min)者,原癌基因c-sis、c-myc表达最强;极差分析表明病毒剂量对基因表达的影响是主要因素,时间是次要因素,且仍是高感染剂量组中的感染较长时间者,对基因表达影响最强;方差分析表明病毒剂量因素对于增强原癌基因c-sis表达(P<0.01)比时间因素(P<0.05)更为重要,但二者对于增强原癌基因c-myc表达无显著差异(P均<0.05)。病毒感染剂量、感染时间二者无交互作用。上述分析说明HSV-2可以诱导hASMC原癌基因c-sis及c-myc表达增加。
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附图 Northern杂交分析各实验组中的人动脉平滑肌细胞原癌基因c-sis、c-myc、β-actin表达。A:未感染组;B:低感染剂量组;C:高感染剂量组
3 讨论
已有研究资料表明,血管平滑肌细胞原癌基因c-sis可产生血小板源生长因子,通过自分泌促细胞增殖;原癌基因c-myc是细胞受到丝裂原刺激后的早期反应基因,表达的蛋白可作为反式作用因子,通过与顺式作用元件结合促使与细胞增殖有关的基因开放,产生和分泌多种生长因子,再通过内分泌和旁分泌作用,发挥其促细胞增殖效应。因此原癌基因c-sis和c-myc与细胞增殖密切相关。然而细胞异常增殖大多不是单一癌基因活化的结果,而需在不同阶段相继或同时有不同癌基因激活协同完成;原癌基因c-sis可激活原癌基因c-myc而发挥促增殖作用,即所谓的基因偶联[9]。一般认为肿瘤形成需要两类癌基因:一类是使细胞获得永生性的癌基因,其表达产物主要位于细胞核,如原癌基因c-myc;另一类是使细胞迅速增殖、表型转化的癌基因,这类基因主要分布在胞液,如原癌基因c-sis。本文Northern杂交结果显示,5 MOI、10 MOI HSV-2感染hASMC极早期可显著诱导细胞原癌基因c-sis、c-myc这两类基因表达增加,且病毒感染剂量是影响它们表达增加的主要因素,由此提示病毒这一作用可能是致血管平滑肌细胞异常增殖进而参与动脉粥样硬化/血管成形术后再狭窄形成的分子机制之一,同时也提示了病毒致动脉粥样硬化/血管成形术后再狭窄形成与病毒参与肿瘤形成在机制上有相似之处。关于HSV-2激活hASMC原癌基因的具体机制则尚需深入研究。
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参考文献
1 Benditt EP,Barrett T,McDougall JK.Viruses in the etiology of atherosclerosis.Proc Natl Acad Sci USA,1983,80:6386—6389.
2 Span AHM,Van Dam-Mieras MCE,Mullers W,et al.The effect of virus infection on the adherence of leukocytes or platelets to endothelial cells.Eur J Clin Invest,1990,21:331—338.
3 Hajjar DP.Viral pathogenesis of atherosclerosis:impact of molecular mimiery and viral genes.Am J Pathol,1991,139:1195—1211.
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4 Nachtigal M,Legrand A,Greensam P,et al.Immoratalization of rabbit vascular smooth muscle cells after transfection with a fragment of the BgI Ⅱ N region of herptees simplex virus type 2 DNA.Intervirology,1990,31:166—174.
5 汤健,周爱儒主编.原癌基因与心血管疾病.第1版.北京:北京医科大学 中国协和医科大学联合出版社,1990.130—168.
6 Campbell JH,Campbell GR.Culture techniques and their application to studies of vascular smooth muscle.Clinical Science,1993,85:501—513.
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7 Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal Biochem,1987,162:156—159.
8 Chomczynski P.One-hour downward alkaline capillary transfer for blotting of DNA and RNA.Anal Biochem,1992,201:134—139.
9 伍欣星,聂广主编.医学分子生物学.第1版.武汉:武汉大学出版社,1996.147—156.
(收稿：1998-05-01 修回：1998-11-05), http://www.100md.com
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关键词：单纯疱疹病毒Ⅱ型感染；人动脉平滑肌细胞；原癌基因
中国循环杂志990210 摘要 目的:观察单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)感染极早期对离体人动脉平滑肌细胞(hASMC)原癌基因c-sis及c-myc表达的影响。方法:采用不同感染剂量的HSV-2吸附单层hASMC 1小时作为病毒感染细胞模型,应用Northern杂交方法观察上述原癌基因表达。结果:病毒吸附细胞后0分钟、30分钟、60分钟,病毒感染组[5感染复数(MOI)和10 MOI;MOI=空斑形成单位/细胞数(PFU/细胞数)]均比对照组的原癌基因c-sis、c-myc表达增加,且基因表达与感染时间也有关。结论:HSV-2感染可以诱导hASMC原癌基因c-sis、c-myc表达增加,该作用可能是病毒促进hASMC异常增殖进而参与动脉粥样硬化或血管成形术后再狭窄形成的分子机制之一。
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Effect of Immediate Early Stage Infection of Herpes Simplex Virus Type 2 on Expression of c-sis and c-myc Proto-oncogenes of Human Arterial Smooth Muscle Cells in Vitro
Tang Huaijing**,Duan Shengzhong,Hong Jialing.
Department of Biochemistry,Hubei Medical University,Wuhan(430071),Hubei
Abstract Objective:Herpesviruses have been implicated as etiologic factors in the pathogenesis of human atherosclerosis (AS) or post-angioplasty restenosis (RS).The effects of herpes simplex virus type 2 (HSV-2) immediate early stage infection on expression of c-sis and c-myc protooncogenes in vitro human arterial smooth muscle cells (hASMCs) was studied.Methods:HSV-2 at various dosages were used to adsorb onto the monolayer smooth muscle cell for 1 hour to establish virus-infected hASMCs model.Northern hybridization was used to observe the above mentioned proto-oncogenes expression.Results:Both c-sis and c-myc were highly expressed in the virus-infected groups(5 MOI and 10 MOI,the MOI=virus PFU/cells number)than the control groups,whenever 0,30 and 60 min after the virus adsorption.The enhanced expression of them also related to time course of the infection.Conclusion:The high expression of c-sis and c-myc in hASMCs after HSV-2 infection may be one of molecular mechanism of cells abnormally proliferation and thereby contributing to the formation of AS/RS.
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Key words Herpes simplex virus type 2 infection;Human arterial smooth muscle cells;Proto-oncogenes
目前认为,病毒感染是引起人类动脉粥样硬化及血管成形术后再狭窄的主要始动因子之一,特别是单纯疱疹病毒(HSV)和人巨细胞病毒(HCMV)[1]。研究表明,病毒感染血管壁后,可引起内皮细胞损伤和血液凝固;还可改变细胞脂质代谢及诱导细胞转化[2～4]。单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)是肿瘤脱氧核糖核酸(DNA)病毒,与一些癌瘤发生有关,而原癌基因的表达与肿瘤发生的相互关系一直在肿瘤学中备受关注;鉴于动脉粥样硬化/血管成形术后再狭窄也是以细胞增殖为主的病变,尤其是血管平滑肌细胞异常增殖又是二者的主要病理特征,有学者还把动脉粥样硬化称之为血管平滑肌细胞的“良性肿瘤”[5],故认为对HSV-2能否通过诱导血管平滑肌细胞原癌基因异常表达以促进细胞增殖值得研究。本文在建立胎儿主动脉平滑肌细胞(hASMC)实验材料的基础上,从与细胞增殖密切相关的原癌基因c-sis、c-myc着手,以期探讨HSV-2在动脉粥样硬化/血管成形术后再狭窄形成机制中的可能作用。
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1 材料与方法
胎儿主动脉平滑肌细胞培养:1997年2月～5月在无菌条件下取28周龄水囊引产健康胎儿主动脉胸腹段,采用贴块法进行hASMC培养[6],并进行光镜、电镜的形态学鉴定。
HSV-2增殖及感染性测定:按常规方法在Hep-2细胞中增殖HSV-2 333株(湖北医科大学病毒所提供),以空斑形成单位法测定其感染性。
HSV-2感染hASMC及实验分组:取生长良好的第6代hASMC,传代调整细胞密度为2.5×105/ml,接种50 ml培养瓶内,每瓶加5 ml细胞悬液。待细胞生长至单层的90%后弃培养液,换用含0.5%小牛血清培养液静止培养48小时,然后按实验分组给予不同处理。A组(未感染组):hASMC加无血清培养液0.5 ml;B组(低感染剂量组):hASMC加含5感染复数(MOI)HSV-2的无血清培养液0.5 ml;C组(高感染剂量组):hASMC加含10 MOI HSV-2的无血清培养液0.5 ml。细胞于37℃与HSV-2孵育1小时后弃病毒悬液,加入含20%小牛血清培养液培养,以病毒孵育细胞1小时后开始记时,各实验组分别于感染后0分钟、30分钟、60分钟终止培养。
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Northern杂交:采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法[7],分别提取各实验组hASMC总核糖核酸(RNA);取RNA 15 μg,经1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分离,应用向下印迹法将RNA转移到尼龙膜[8],与地高辛标记(随机引物法)的原癌基因c-sis、c-myc、β-actin互补脱氧核糖核酸(cDNA)探针进行杂交。
统计学处理:Northern杂交实验应用正交设计,并进行统计学处理。本实验涉及两因素(感染剂量:MOI;时间:分钟)、三水平(感染剂量:0 MOI、5 MOI、10 MOI;时间:0分钟、30分钟、60分钟),采用L9(34)正交表。
2 结果
2.1 人动脉平滑肌细胞总核糖核酸纯度的鉴定
电泳结果显示:正常和病毒感染的hASMC总RNA 18 S和28 S两条区带均呈完整状态,RNA样品无降解;无细胞及病毒脱氧核糖核酸(DNA)混杂。
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2.2 单纯疱疹病毒Ⅱ型感染极早期对人动脉平滑肌细胞原癌基因c-sis及c-myc表达的影响
从附图的杂交信号可知,hASMC在5 MOI、10 MOI HSV-2孵育后的0分钟、30分钟、60分钟时,原癌基因c-sis、c-myc表达均比未感染组增加,且随病毒剂量的增高、时间的延长呈上升趋势。杂交带在590 nm处用双波长色谱扫描仪扫描,结果进行正交设计的统计学处理:直观分析表明高感染剂量组(10 MOI)中的感染较长时间(60 min)者,原癌基因c-sis、c-myc表达最强;极差分析表明病毒剂量对基因表达的影响是主要因素,时间是次要因素,且仍是高感染剂量组中的感染较长时间者,对基因表达影响最强;方差分析表明病毒剂量因素对于增强原癌基因c-sis表达(P<0.01)比时间因素(P<0.05)更为重要,但二者对于增强原癌基因c-myc表达无显著差异(P均<0.05)。病毒感染剂量、感染时间二者无交互作用。上述分析说明HSV-2可以诱导hASMC原癌基因c-sis及c-myc表达增加。
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附图 Northern杂交分析各实验组中的人动脉平滑肌细胞原癌基因c-sis、c-myc、β-actin表达。A:未感染组;B:低感染剂量组;C:高感染剂量组
3 讨论
已有研究资料表明,血管平滑肌细胞原癌基因c-sis可产生血小板源生长因子,通过自分泌促细胞增殖;原癌基因c-myc是细胞受到丝裂原刺激后的早期反应基因,表达的蛋白可作为反式作用因子,通过与顺式作用元件结合促使与细胞增殖有关的基因开放,产生和分泌多种生长因子,再通过内分泌和旁分泌作用,发挥其促细胞增殖效应。因此原癌基因c-sis和c-myc与细胞增殖密切相关。然而细胞异常增殖大多不是单一癌基因活化的结果,而需在不同阶段相继或同时有不同癌基因激活协同完成;原癌基因c-sis可激活原癌基因c-myc而发挥促增殖作用,即所谓的基因偶联[9]。一般认为肿瘤形成需要两类癌基因:一类是使细胞获得永生性的癌基因,其表达产物主要位于细胞核,如原癌基因c-myc;另一类是使细胞迅速增殖、表型转化的癌基因,这类基因主要分布在胞液,如原癌基因c-sis。本文Northern杂交结果显示,5 MOI、10 MOI HSV-2感染hASMC极早期可显著诱导细胞原癌基因c-sis、c-myc这两类基因表达增加,且病毒感染剂量是影响它们表达增加的主要因素,由此提示病毒这一作用可能是致血管平滑肌细胞异常增殖进而参与动脉粥样硬化/血管成形术后再狭窄形成的分子机制之一,同时也提示了病毒致动脉粥样硬化/血管成形术后再狭窄形成与病毒参与肿瘤形成在机制上有相似之处。关于HSV-2激活hASMC原癌基因的具体机制则尚需深入研究。
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参考文献
1 Benditt EP,Barrett T,McDougall JK.Viruses in the etiology of atherosclerosis.Proc Natl Acad Sci USA,1983,80:6386—6389.
2 Span AHM,Van Dam-Mieras MCE,Mullers W,et al.The effect of virus infection on the adherence of leukocytes or platelets to endothelial cells.Eur J Clin Invest,1990,21:331—338.
3 Hajjar DP.Viral pathogenesis of atherosclerosis:impact of molecular mimiery and viral genes.Am J Pathol,1991,139:1195—1211.
, 百拇医药
4 Nachtigal M,Legrand A,Greensam P,et al.Immoratalization of rabbit vascular smooth muscle cells after transfection with a fragment of the BgI Ⅱ N region of herptees simplex virus type 2 DNA.Intervirology,1990,31:166—174.
5 汤健,周爱儒主编.原癌基因与心血管疾病.第1版.北京:北京医科大学 中国协和医科大学联合出版社,1990.130—168.
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, http://www.100md.com
7 Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal Biochem,1987,162:156—159.
8 Chomczynski P.One-hour downward alkaline capillary transfer for blotting of DNA and RNA.Anal Biochem,1992,201:134—139.
9 伍欣星,聂广主编.医学分子生物学.第1版.武汉:武汉大学出版社,1996.147—156.
(收稿：1998-05-01 修回：1998-11-05), http://www.100md.com