体外循环中心肌细胞膜流动性变化的自旋标记研究*
作者：丁芳宝 王志农 张宝仁 朱家麟 陈晓东 黄盛东
单位：
关键词：体外循环；电子自旋共振；膜流动性
中国循环杂志990225 摘要 目的:观察缺血再灌注对心肌细胞膜近亲水端的疏水区和疏水核心流动性的影响,评价3种心肌保护方法的作用。方法:将猫分为5组用自旋标记—电子自旋共振方法,研究体外循环中猫心肌细胞膜的流动性。结果:升主动脉阻断期间和再灌注早期,各组各时间点序参数(S)和旋转相关时间(τc)均明显增大,至再灌注60分钟达峰值后开始恢复;未行心肌保护增大最明显,常温体外循环温血停搏液持续顺灌增加最小且恢复最佳。结论:常温体外循环温血停搏液持续顺灌对心肌细胞膜的保护效果优于另两种方法,但仍需改进。
Spin Labelling Study on the Fluidity of Myocardial Cell Membranes During Cardiopulmonary Bypass
, http://www.100md.com
Ding Fangbao,Wang Zhinong,Zhang Baoren,et al.
Department of Cardiothoracic Surgery,Shang hai Changhai Hospital,Shanghai(200433)
Abstract Objective:To study the ischemia/reperfusion-induced dynamic changes of the fluidity of hydrophobic core and hydrophobic regions nearer to hydrophilic face of myocardial cell membranes during cardiopulmonary bypass,and to evaluate the protective effects of three kinds of cardioplegias.Methods:The fluidity was studied with electron spin resonance(ESR) in 123 felines undergoing cardiopulmonary bypass.Results:During aortic cross-clamping(ACC) and reperfusion,both order parameter(S) and rotation correlation time(τc) in all animals increased significantly,and reached peak value at 1hr after reperfusion,and then fell.Both increased most significantly in the felines followed cardiopulmonary bypass without administration of cardioplegia during ACC,while most slightly in the felines with continuous administration of warm blood cardioplegia.Conclusions:Cardiopulmonary bypass without ACC exerts no detrimental efforts on the fluidity of myocardial cell membranes.Further improvements of warm blood cardioplegia are still wanted despite of its better effect than that of others.
, 百拇医药
Key words Cardiopulmonary bypass;Electron spin resonance;Membrane fluidity
细胞膜损伤是细胞由可逆性损伤转化为不可逆性损伤的早期特征,而膜脂流动性是细胞膜的一个重要特性。本研究在猫体外循环模型上,利用自旋标记—电子自旋共振技术(ESR),观察体外循环缺血再灌注过程中心肌细胞膜近亲水端的疏水区和疏水核心流动性的动态变化,评价3种心肌保护方法对心肌细胞膜的作用,为临床心肌保护措施的改进提供实验资料。
1 材料和方法
动物分组 选择1997年3月至1997年6月健康成年猫123只,雌雄不拘,体重3.0±0.5 kg,随机分为5组。组Ⅰ(n=15):并行循环,不阻断升主动脉;组Ⅱ(n=27):升主动脉阻断(ACC)期间不做心肌保护;组Ⅲ、Ⅳ(各n=27):中低温体外循环,ACC期间分别行冷晶体或冷血停搏液间断顺灌;组Ⅴ(n=27):常温体外循环,ACC期间持续顺灌温血停搏液。
, 百拇医药
体外循环模型的建立 按文献报道略做改良建立猫体外循环模型[1]。组Ⅰ分别于并行循环60、90、120、150、180分钟取心肌组织;余各组ACC时间均为60分钟,再灌注120分钟,分别于ACC 15、30、60分钟和再灌注15、30、60、90、120分钟取心肌组织。
自旋标记 改良差速离心法制备猫心肌细胞膜[2],结合电镜和膜标志酶鉴定其纯度,紫外分光光度法测定膜蛋白浓度。取5-或16-氮氧自由基硬脂酸(5-或16-doxy1-stearic acid,5-NS或16-NS,美国Sigama公司)乙醇溶液4 μl(4 μg/μl),待乙醇挥发后,与0.5ml膜悬液(4 mg/ml)充分混合,4°C下静置16～18小时后离心(15 000转/分,10 min),沉淀以酸碱度(pH)=7.4的磷酸盐缓冲液反复洗涤至洗涤液无信号;将标记好的细胞膜装入直径1 mm的玻璃管内测量[3]。
波谱测量 在ESR200D-SRC型电子顺磁共振波谱仪上记录波谱(德国Bruker公司)。测试条件:24±0.5°C,X波段,微波功率20 mW,调制100 KHz,调幅0.2 mT,扫宽±10 mT,中心磁场347.4 mT。
, 百拇医药
统计学处理 数据以均数±标准差表示,运用中国人民解放军第四军医大学统计教研室研制的线性拟合统计软件SPLM2.3,先行方差分析,若P<0.05,行均数两两比较(SNK法)。
2 结果
各组各时间点序参数(S)和旋转相关时间(τc)分别用来描述生物膜近亲水端的疏水区和疏水核心的流动性,S和τc减小或增大,相应部位流动性增大或减小。根据波谱超精细分裂2T∥、2T⊥或谱线中、高场峰高h0和h-1及中场峰宽w0,可计算S或τc:[4]
结果见表1、2。
, 百拇医药
表1 5-氮氧自由基硬脂酸标记心肌细胞膜所得各组各时间点序参数(
±s) 组别
升主动脉阻断期间
升主动脉阻断60分钟后复灌期间
15分钟
30分钟
60分钟
15分钟
30分钟
60分钟
90分钟
120分钟
, 百拇医药
组Ⅱ
0.6621±0.0019
0.6637±0.0027
0.6733±
0.0021**
0.6781±0.0024
0.6840±0.0011
0.6878±0.0018Δ
0.6839±0.0025
0.6789±0.0020▲
, 百拇医药 组Ⅲ
0.6613±0.0019
0.6628±0.0015
0.6695±
0.0025**+
0.6730±0.0022
0.6812±0.0021
0.6849±0.0017Δ
0.6795±0.0013
0.6736±0.0015▲＃
, 百拇医药 组Ⅳ
0.6617±0.0027
0.6627±0.0014
0.6693±
0.0024*+
0.6736±0.0016
0.6808±0.0019
0.6845±0.0013Δ
0.6786±0.0021
0.6735±0.0016▲＃
组Ⅴ
, http://www.100md.com
0.6612±0.0016
0.6614±0.0017
0.6647±
0.0016++
0.6692±0.0020
0.6765±0.0013
0.6802±0.0016Δ
0.6741±0.0013
0.6676±0.0015▲＃
注:升主动脉阻断15分钟与其60分钟比*P<0.05**P<0.01;升主动脉阻断60分钟与复灌60分钟比△P<0.01;复灌60分钟与其120分钟比▲P<0.01;升主动脉阻断60分钟,组Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ与组Ⅱ比+P<0.05++P<0.01;复灌120分钟,组Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ与组Ⅱ比＃P<0.01
, 百拇医药
表2 16-氮氧自由基硬脂酸标记心肌细胞膜所得各组各时间点旋转相关时间(10-10秒,±s) 组别
升主动脉阻断期间
升主动脉阻断60分钟后复灌期间
15分钟
30分钟
60分钟
15分钟
30分钟
60分钟
90分钟
, 百拇医药
120分钟
组Ⅱ
8.083±
0.052
8.176±
0.066
8.371±
0.057**
8.413±
0.055
8.476±
0.047
, http://www.100md.com
8.605±
0.036Δ
8.498±
0.031
8.440±
0.055▲
组Ⅲ
7.977±
0.033
8.004±
0.061
8.172±
, http://www.100md.com
0.045**+
8.316±
0.053
8.434±
0.053
8.551±
0.043Δ
8.396±
0.045
8.246±
0.088▲＃
组Ⅳ
, 百拇医药
8.009±
0.044
8.021±
0.111
8.224±
0.067*+
8.261±
0.040
8.405±
0.087
8.524±
0.051Δ
, 百拇医药
8.388±
0.056
8.214±
0.061▲＃
组Ⅴ
7.959±
0.037
7.979±
0.058
8.053±
0.053+
8.160±
, 百拇医药
0.064
8.297±
0.041
8.340±
0.048Δ
8.214±
0.066
8.033±
0.044▲＃
注:升主动脉阻断15分钟与其60分钟比*P<0.05**P<0.01;升主动脉阻断60分钟与复灌60分钟比△P<0.01;复灌60分钟与其120分钟比▲P<0.01;升主动脉阻断60分钟,组Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ与组Ⅱ比+P<0.01;复灌120分钟,组Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ与组Ⅱ比＃P<0.01
, 百拇医药
组ⅠS和τc无明显改变(P>0.05),均数分别为0.6604±0.0015和7.926±0.058(10-10秒)。ACC期间,各组S和τc均呈增大趋势,ACC 60分钟点较ACC 15分钟点,组Ⅱ、Ⅲ S和τc均相差非常显著(P<0.01),组Ⅳ相差显著(P<0.05),但组Ⅴ各点间无显著差异(P>0.05)。再灌注早期,各组S和τc继续增大,至再灌注60分钟达峰值并显著大于ACC60分钟点(P<0.01)。
ACC期间和再灌注期间,组Ⅱ S和τc的增大显著大于组Ⅴ(P<0.01);再灌注后期S和τc的恢复以组Ⅴ最迅速,组Ⅱ恢复很差;组Ⅲ、Ⅳ的增大及恢复程度相似,介于组Ⅱ、Ⅴ之间。复灌120分钟结束体外循环时,各组均未恢复到体外循环前水平。
3 讨论
, 百拇医药
自旋标记物5-氮氧自由基硬脂酸和16-氨氧自由基硬脂酸为含有不成对电子的顺磁体,能分别标记于生物膜脂双层的表层和核心,检测其波谱参数的变化,可研究脂双层不同深度的运动状态;而荧光偏振仅反映整个脂区运动状态的平均值,且荧光标记物对脂区的运动影响较大。
冷晶体或冷血停搏液虽能对心肌提供相对较好的保护,但低温影响生物膜的稳定性、体内钙平衡和细胞氧摄取,而温血停搏液则能防止上述代谢异常和膜功能障碍,且能更好地保护心脏交感神经功能和促进缺血心肌复苏及心室舒缩功能恢复[5,6]。虽有报道认为,冷血和温血停搏液对心肌超微结构和生化指标有相似的保护作用[7],但本研究结果表明,即使常温体外循环持续顺灌温血停搏液在再灌注早期,心肌细胞膜近亲水端的疏水区和疏水核心的流动性也有降低,其对心肌细胞膜的保护作用,仍优于间断顺灌冷晶体、冷血停搏液。本研究还发现,即使是保护效果最佳的组Ⅴ,仍有膜损伤,这可能是因为本实验仅采用了顺灌一种方法,不能对整个心脏提供充分保护,此时,心肌无氧酵解代谢依然较高;另外,在ACC期间,心肌偶有蠕动,这也部分削弱了对心肌的保护作用。
, 百拇医药
参考文献
1 Cheng Long,Zhang Baoren,Zhu Jialin,et al.Alteration of mitochondria function in ischemia/reperfusion cat heart.J Med Coll PLA,1993,8:337—341.
2 Atkison PH,Summers DF.Purification and properties of Hera cell plasma membranes.J Biol Chem,1971,246:5162—5175.
3 Nagy K,Simon P,Zs-Nagy Ⅰ.Spin label studies on synaptosomal membranes of rat brain cortex during age.Bioch and Biophy Res Communications,1983,117:688—694.
, 百拇医药
4 傅一工,张兰萍,欧阳雁南,等.外源脂肪酸对莱氏衣原体膜流动性的影响—电子自旋共振与荧光偏振研究.生物物理学报,1985,1:181—188.
5 Chello M,Mastroroberto P,De Amicis V,et al.Intermittent warm blood cardioplegia preserves myocardial β-adrenergic receptor function.Ann Thorac Surg,1997,63:683—688.
6 Hayashida N,Ikonomidis JS,Weisel RD,et al.The optimal cardioplegic temperature.Ann Thorac Surg,1994,58:961—971.
7 Kamlet A,Bellows SD,Simkhovich BZ,et al.Is warm retrograde blood cardioplegia better than cold for myocardial protection? Ann Thorac Surg,1997,63:98—104.
(收稿：1998-06-29 修回：1998-12-11), http://www.100md.com
单位：
关键词：体外循环；电子自旋共振；膜流动性
中国循环杂志990225 摘要 目的:观察缺血再灌注对心肌细胞膜近亲水端的疏水区和疏水核心流动性的影响,评价3种心肌保护方法的作用。方法:将猫分为5组用自旋标记—电子自旋共振方法,研究体外循环中猫心肌细胞膜的流动性。结果:升主动脉阻断期间和再灌注早期,各组各时间点序参数(S)和旋转相关时间(τc)均明显增大,至再灌注60分钟达峰值后开始恢复;未行心肌保护增大最明显,常温体外循环温血停搏液持续顺灌增加最小且恢复最佳。结论:常温体外循环温血停搏液持续顺灌对心肌细胞膜的保护效果优于另两种方法,但仍需改进。
Spin Labelling Study on the Fluidity of Myocardial Cell Membranes During Cardiopulmonary Bypass
, http://www.100md.com
Ding Fangbao,Wang Zhinong,Zhang Baoren,et al.
Department of Cardiothoracic Surgery,Shang hai Changhai Hospital,Shanghai(200433)
Abstract Objective:To study the ischemia/reperfusion-induced dynamic changes of the fluidity of hydrophobic core and hydrophobic regions nearer to hydrophilic face of myocardial cell membranes during cardiopulmonary bypass,and to evaluate the protective effects of three kinds of cardioplegias.Methods:The fluidity was studied with electron spin resonance(ESR) in 123 felines undergoing cardiopulmonary bypass.Results:During aortic cross-clamping(ACC) and reperfusion,both order parameter(S) and rotation correlation time(τc) in all animals increased significantly,and reached peak value at 1hr after reperfusion,and then fell.Both increased most significantly in the felines followed cardiopulmonary bypass without administration of cardioplegia during ACC,while most slightly in the felines with continuous administration of warm blood cardioplegia.Conclusions:Cardiopulmonary bypass without ACC exerts no detrimental efforts on the fluidity of myocardial cell membranes.Further improvements of warm blood cardioplegia are still wanted despite of its better effect than that of others.
, 百拇医药
Key words Cardiopulmonary bypass;Electron spin resonance;Membrane fluidity
细胞膜损伤是细胞由可逆性损伤转化为不可逆性损伤的早期特征,而膜脂流动性是细胞膜的一个重要特性。本研究在猫体外循环模型上,利用自旋标记—电子自旋共振技术(ESR),观察体外循环缺血再灌注过程中心肌细胞膜近亲水端的疏水区和疏水核心流动性的动态变化,评价3种心肌保护方法对心肌细胞膜的作用,为临床心肌保护措施的改进提供实验资料。
1 材料和方法
动物分组 选择1997年3月至1997年6月健康成年猫123只,雌雄不拘,体重3.0±0.5 kg,随机分为5组。组Ⅰ(n=15):并行循环,不阻断升主动脉;组Ⅱ(n=27):升主动脉阻断(ACC)期间不做心肌保护;组Ⅲ、Ⅳ(各n=27):中低温体外循环,ACC期间分别行冷晶体或冷血停搏液间断顺灌;组Ⅴ(n=27):常温体外循环,ACC期间持续顺灌温血停搏液。
, 百拇医药
体外循环模型的建立 按文献报道略做改良建立猫体外循环模型[1]。组Ⅰ分别于并行循环60、90、120、150、180分钟取心肌组织;余各组ACC时间均为60分钟,再灌注120分钟,分别于ACC 15、30、60分钟和再灌注15、30、60、90、120分钟取心肌组织。
自旋标记 改良差速离心法制备猫心肌细胞膜[2],结合电镜和膜标志酶鉴定其纯度,紫外分光光度法测定膜蛋白浓度。取5-或16-氮氧自由基硬脂酸(5-或16-doxy1-stearic acid,5-NS或16-NS,美国Sigama公司)乙醇溶液4 μl(4 μg/μl),待乙醇挥发后,与0.5ml膜悬液(4 mg/ml)充分混合,4°C下静置16～18小时后离心(15 000转/分,10 min),沉淀以酸碱度(pH)=7.4的磷酸盐缓冲液反复洗涤至洗涤液无信号;将标记好的细胞膜装入直径1 mm的玻璃管内测量[3]。
波谱测量 在ESR200D-SRC型电子顺磁共振波谱仪上记录波谱(德国Bruker公司)。测试条件:24±0.5°C,X波段,微波功率20 mW,调制100 KHz,调幅0.2 mT,扫宽±10 mT,中心磁场347.4 mT。
, 百拇医药
统计学处理 数据以均数±标准差表示,运用中国人民解放军第四军医大学统计教研室研制的线性拟合统计软件SPLM2.3,先行方差分析,若P<0.05,行均数两两比较(SNK法)。
2 结果
各组各时间点序参数(S)和旋转相关时间(τc)分别用来描述生物膜近亲水端的疏水区和疏水核心的流动性,S和τc减小或增大,相应部位流动性增大或减小。根据波谱超精细分裂2T∥、2T⊥或谱线中、高场峰高h0和h-1及中场峰宽w0,可计算S或τc:[4]
结果见表1、2。
, 百拇医药
表1 5-氮氧自由基硬脂酸标记心肌细胞膜所得各组各时间点序参数(
±s) 组别升主动脉阻断期间
升主动脉阻断60分钟后复灌期间
15分钟
30分钟
60分钟
15分钟
30分钟
60分钟
90分钟
120分钟
, 百拇医药
组Ⅱ
0.6621±0.0019
0.6637±0.0027
0.6733±
0.0021**
0.6781±0.0024
0.6840±0.0011
0.6878±0.0018Δ
0.6839±0.0025
0.6789±0.0020▲
, 百拇医药 组Ⅲ
0.6613±0.0019
0.6628±0.0015
0.6695±
0.0025**+
0.6730±0.0022
0.6812±0.0021
0.6849±0.0017Δ
0.6795±0.0013
0.6736±0.0015▲＃
, 百拇医药 组Ⅳ
0.6617±0.0027
0.6627±0.0014
0.6693±
0.0024*+
0.6736±0.0016
0.6808±0.0019
0.6845±0.0013Δ
0.6786±0.0021
0.6735±0.0016▲＃
组Ⅴ
, http://www.100md.com
0.6612±0.0016
0.6614±0.0017
0.6647±
0.0016++
0.6692±0.0020
0.6765±0.0013
0.6802±0.0016Δ
0.6741±0.0013
0.6676±0.0015▲＃
注:升主动脉阻断15分钟与其60分钟比*P<0.05**P<0.01;升主动脉阻断60分钟与复灌60分钟比△P<0.01;复灌60分钟与其120分钟比▲P<0.01;升主动脉阻断60分钟,组Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ与组Ⅱ比+P<0.05++P<0.01;复灌120分钟,组Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ与组Ⅱ比＃P<0.01
, 百拇医药
表2 16-氮氧自由基硬脂酸标记心肌细胞膜所得各组各时间点旋转相关时间(10-10秒,
±s) 组别升主动脉阻断期间
升主动脉阻断60分钟后复灌期间
15分钟
30分钟
60分钟
15分钟
30分钟
60分钟
90分钟
, 百拇医药
120分钟
组Ⅱ
8.083±
0.052
8.176±
0.066
8.371±
0.057**
8.413±
0.055
8.476±
0.047
, http://www.100md.com
8.605±
0.036Δ
8.498±
0.031
8.440±
0.055▲
组Ⅲ
7.977±
0.033
8.004±
0.061
8.172±
, http://www.100md.com
0.045**+
8.316±
0.053
8.434±
0.053
8.551±
0.043Δ
8.396±
0.045
8.246±
0.088▲＃
组Ⅳ
, 百拇医药
8.009±
0.044
8.021±
0.111
8.224±
0.067*+
8.261±
0.040
8.405±
0.087
8.524±
0.051Δ
, 百拇医药
8.388±
0.056
8.214±
0.061▲＃
组Ⅴ
7.959±
0.037
7.979±
0.058
8.053±
0.053+
8.160±
, 百拇医药
0.064
8.297±
0.041
8.340±
0.048Δ
8.214±
0.066
8.033±
0.044▲＃
注:升主动脉阻断15分钟与其60分钟比*P<0.05**P<0.01;升主动脉阻断60分钟与复灌60分钟比△P<0.01;复灌60分钟与其120分钟比▲P<0.01;升主动脉阻断60分钟,组Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ与组Ⅱ比+P<0.01;复灌120分钟,组Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ与组Ⅱ比＃P<0.01
, 百拇医药
组ⅠS和τc无明显改变(P>0.05),均数分别为0.6604±0.0015和7.926±0.058(10-10秒)。ACC期间,各组S和τc均呈增大趋势,ACC 60分钟点较ACC 15分钟点,组Ⅱ、Ⅲ S和τc均相差非常显著(P<0.01),组Ⅳ相差显著(P<0.05),但组Ⅴ各点间无显著差异(P>0.05)。再灌注早期,各组S和τc继续增大,至再灌注60分钟达峰值并显著大于ACC60分钟点(P<0.01)。
ACC期间和再灌注期间,组Ⅱ S和τc的增大显著大于组Ⅴ(P<0.01);再灌注后期S和τc的恢复以组Ⅴ最迅速,组Ⅱ恢复很差;组Ⅲ、Ⅳ的增大及恢复程度相似,介于组Ⅱ、Ⅴ之间。复灌120分钟结束体外循环时,各组均未恢复到体外循环前水平。
3 讨论
, 百拇医药
自旋标记物5-氮氧自由基硬脂酸和16-氨氧自由基硬脂酸为含有不成对电子的顺磁体,能分别标记于生物膜脂双层的表层和核心,检测其波谱参数的变化,可研究脂双层不同深度的运动状态;而荧光偏振仅反映整个脂区运动状态的平均值,且荧光标记物对脂区的运动影响较大。
冷晶体或冷血停搏液虽能对心肌提供相对较好的保护,但低温影响生物膜的稳定性、体内钙平衡和细胞氧摄取,而温血停搏液则能防止上述代谢异常和膜功能障碍,且能更好地保护心脏交感神经功能和促进缺血心肌复苏及心室舒缩功能恢复[5,6]。虽有报道认为,冷血和温血停搏液对心肌超微结构和生化指标有相似的保护作用[7],但本研究结果表明,即使常温体外循环持续顺灌温血停搏液在再灌注早期,心肌细胞膜近亲水端的疏水区和疏水核心的流动性也有降低,其对心肌细胞膜的保护作用,仍优于间断顺灌冷晶体、冷血停搏液。本研究还发现,即使是保护效果最佳的组Ⅴ,仍有膜损伤,这可能是因为本实验仅采用了顺灌一种方法,不能对整个心脏提供充分保护,此时,心肌无氧酵解代谢依然较高;另外,在ACC期间,心肌偶有蠕动,这也部分削弱了对心肌的保护作用。
, 百拇医药
参考文献
1 Cheng Long,Zhang Baoren,Zhu Jialin,et al.Alteration of mitochondria function in ischemia/reperfusion cat heart.J Med Coll PLA,1993,8:337—341.
2 Atkison PH,Summers DF.Purification and properties of Hera cell plasma membranes.J Biol Chem,1971,246:5162—5175.
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, 百拇医药
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(收稿：1998-06-29 修回：1998-12-11), http://www.100md.com