茶芎多糖的提取及其免疫活性研究△
作者：罗永明 余日跃 朱英
单位：江西中医学院(南昌330006)
关键词：
中草药/990222 伞形科植物茶芎Ligusticum sinense Oliv cv.Chaxiong是江西特产中药之一，具有行气活血、祛风止痛之功效。我们先后从中分离了21个化学成分〔1～3〕，并进行了心血管、抗惊厥等方面的系统药理研究〔4，5〕。民间将茶芎与茶叶一起泡水饮用，有防病、健身、强壮作用，我们又对茶芎中含量较高的水溶性成分茶芎多糖进行了提取分离和免疫活性的研究。
1 实验材料
1.1 药材：茶芎药材购自江西省瑞昌市医药公司，由我院中药鉴定教研室张治针老师鉴定品种。
, 百拇医药
1.2 动物：Balb/c小鼠由江西省医学实验动物中心提供。
1.3 试剂和药品：3H-TdR为中国原子能研究所出品，RPMI-1640培养基为GIBCO产品，环磷酰胺(Cy)为上海第十二制药厂产品，植物凝集素为中国医学科学院出品，所用化学试剂均为分析纯。
1.4 仪器：FJ-2101G双道液体闪烁计数器，二氧化碳孵箱；721型分光光度计。
2 方法与结果
2.1 茶芎多糖的提取分离：将茶芎药材切成薄片后加95%乙醇回流提取，药渣挥干溶剂后用沸水提取3次，每次30 min，合并3次滤液，浓缩至相当于生药量1∶1的流浸膏，加3倍量的95%乙醇沉淀，放置12 h后离心，滤出沉淀，干燥后加水溶解，用Sevag法除去蛋白质，除至茚三酮反应呈阴性。加95%乙醇至含醇量为80%，放置过夜，将析出的沉淀过滤抽干，并依次用乙醇，丙酮、乙醚洗涤多次，将沉淀于80℃干燥，即得黄褐色粉末状的茶芎多糖(LP)。
, http://www.100md.com
2.2 茶芎多糖的初步分析：称取LP 0.1 g溶于10 mL蒸馏水中，加6 mol/L HCl 10 mL进行水解5 h，水解液用10% NaOH液中和，过滤，滤液浓缩后点于层析滤纸上，另取葡萄糖等多种对照液点于同一张层析滤纸上，分别用正丁醇-醋酸-水(4∶3∶5)上层、正丁醇-乙醇-水(4∶3∶3)和正丁醇-吡啶-水(6∶4∶3)3种不同展开剂展开后，晾干，喷苯胺-邻苯二甲酸试剂，于105℃显色10 min，结果水解液呈现的斑点与葡萄糖、半乳糖、果糖的Rf值和颜色相同。表明LP是由葡萄糖、半乳糖、果糖组成的杂多糖。
精密称取LP 100 mg，按苯酚-浓硫酸法测定〔6〕LP含量为11.95%。
2.3 茶芎多糖对小鼠溶血素、胸腺和脾脏重量的影响：Balb/c小鼠40只，体重14～17 g，雌雄兼用，随机分成4组。每鼠ip 5%生理盐水鸡红细胞悬液0.2 mL进行免疫，同日按表1 ig LP或生理盐水(NS)，连续8 d，Cy组和LP+Cy组同时ip环磷酰胺(Cy)，连续3 d，末次ig给药24 h后，摘眼取血，离心取血清，按文献方法〔7〕以光密度(OD)读数作为血清溶血素的指标，测定各组溶血素抗体水平；剖取小鼠胸腺和脾脏称重，比较各组差异，结果见表1。
, http://www.100md.com
结果表明：LP能非常显著地拮抗Cy所致的体液免疫抑制，使其恢复正常，说明LP能提高机体体液免疫能力。表1结果还显示，LP 能显著或非常显著地增加正常或Cy组小鼠的脾脏和胸腺的重量，说明LP能提高机体的非特异免疫功能。
表1 LP对小鼠溶血素、胸腺、脾脏重量的影响(
±s) 组别
鼠数
剂量
(mg/kg*d)
给药途经
OD值
脾重
(mg)
, 百拇医药
胸腺重
(mg)
NS
10
-
ig
0.306±0.08
80.5±11.1
43.8±15.3
Cy
10
40
ip
, 百拇医药
0.132±0.04
58.6±15.4
15.0±4.1
LP
10
500
ig
0.349±0.10
100.3±17.2△△
62.1±18.4△△
LP+Cy
10
, http://www.100md.com
500+40
ig+ip
0.287±0.07**
72.7±12.6*
41.9±13.7***
与NS组比较：△△P<0.01； 与Cy组比较：*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001
2.4 茶芎多糖对小鼠T淋巴细胞转化率的影响，3只Balb/c小鼠于无菌状态下取脾，并置入含5%小牛血清的Hank's液中，剪碎，离心(1 000 r/min)1 min，取细胞悬液用RPMI-1640培养液离心(2 000 r/min)，洗涤2次，配成107个细胞/毫升，在96孔培养板中，每孔加入100 μL，每组3孔，另设不给药组，逐项加入LP和植物凝集素(PHA)各50 μL，使各组浓度符合表2所示浓度。于含5%CO2孵箱中，37°C依表2中时间培养，于培养结束前加入3H-TdR 0.25 uci/孔。培养结束后取各孔细胞于69号玻璃纤维滤纸上过滤并依次用蒸馏水2 mL、10%三氯醋酸2 mL和无水乙醇1 mL洗涤，滤纸80℃干燥30 min后放入5 mL闪烁液中，过夜测试，并按下式计算淋巴细胞转化指数(A)〔7〕，结果见表2。
, 百拇医药
表2 LP对小鼠T淋巴细胞转化率的影响 组别
LP(μg/mL)
PHA
(μg/mL)
t(h)
cpm
转化指数A
1
16
30
13
31600
1.20
, 百拇医药
2
32
40
23.5
27 694
1.05
3
63
50
9.5
29 652
1.13
4
, 百拇医药
125
25
20
36 390
1.38
5
250
35
6
33 285
1.26
6
500
, 百拇医药
45
16.5
51 325
1.95
空白组
-
50
9.5
26 340
1
优化组
500
50
, 百拇医药
16.5
48 533
1.88
注：表中LP、PHA、t值是通过均匀设计法优选而确定
将结果用计算机进行逐步回归，求得回归方程：A=1.063+0.0016LP (r=0.9221,F=22.71)
结果表明，LP浓度越高，cpm值就越高，转化指数越高，即能提高T淋巴细胞转化率。提示LP具有促进细胞免疫的作用，并具良好的量效关系。
3 讨论
以往茶芎的研究常局限于挥发油或苯酞类等脂溶性成分的研究，而对于水溶性成分的研究甚少，通过对茶芎多糖及其免疫活性的研究，将为茶芎的研究提供一种新的思路，另外，茶芎多糖是用醇提后的药渣来进行提取的，且含量较高，提取分离方法简便，这为茶芎的进一步开发和综合利用开辟了一条新的途径。
, 百拇医药
作者简介：*罗永明 1982年毕业于江西中医学院药学系药学专业，1988年中药研究生毕业并获得硕士学位。责任江西中医学系教授。一起从事中草药活性万分的研究。主持国家自然科学基金课题2项和卫生部青年团科学研究基金及江西省自然科学基金课题多项。参加了国家医药科技攻关计划“1035工程”项目等重大课题的研究工作。近年主要研究成果“中药茶芎化学成分及桔抗谷氨酸神经毒性的研究”获江西省科技进步三等奖。发表学术论文30余篇。
参 考 文 献
[1] 罗永明，等.中国药学杂志，1994，29(12)：714
[2] 罗永明，等.中国中药杂志，1995，20(1)：39
[3] 罗永明，等.中草药，1996，27(8)：456
[4] 陈 奇，等.中药通报，1985，10(5)：44
[5] 潘家祜，等.神经科学，1995，(增刊)：193
[6] 唐晓玲，等.中成药，1995，17(7)：7
[7] 李仪奎.中药药理实验方法学.上海：上海科技出版社，1991：155、165
(1998-03-15收稿), 百拇医药
单位：江西中医学院(南昌330006)
关键词：
中草药/990222 伞形科植物茶芎Ligusticum sinense Oliv cv.Chaxiong是江西特产中药之一，具有行气活血、祛风止痛之功效。我们先后从中分离了21个化学成分〔1～3〕，并进行了心血管、抗惊厥等方面的系统药理研究〔4，5〕。民间将茶芎与茶叶一起泡水饮用，有防病、健身、强壮作用，我们又对茶芎中含量较高的水溶性成分茶芎多糖进行了提取分离和免疫活性的研究。
1 实验材料
1.1 药材：茶芎药材购自江西省瑞昌市医药公司，由我院中药鉴定教研室张治针老师鉴定品种。
, 百拇医药
1.2 动物：Balb/c小鼠由江西省医学实验动物中心提供。
1.3 试剂和药品：3H-TdR为中国原子能研究所出品，RPMI-1640培养基为GIBCO产品，环磷酰胺(Cy)为上海第十二制药厂产品，植物凝集素为中国医学科学院出品，所用化学试剂均为分析纯。
1.4 仪器：FJ-2101G双道液体闪烁计数器，二氧化碳孵箱；721型分光光度计。
2 方法与结果
2.1 茶芎多糖的提取分离：将茶芎药材切成薄片后加95%乙醇回流提取，药渣挥干溶剂后用沸水提取3次，每次30 min，合并3次滤液，浓缩至相当于生药量1∶1的流浸膏，加3倍量的95%乙醇沉淀，放置12 h后离心，滤出沉淀，干燥后加水溶解，用Sevag法除去蛋白质，除至茚三酮反应呈阴性。加95%乙醇至含醇量为80%，放置过夜，将析出的沉淀过滤抽干，并依次用乙醇，丙酮、乙醚洗涤多次，将沉淀于80℃干燥，即得黄褐色粉末状的茶芎多糖(LP)。
, http://www.100md.com
2.2 茶芎多糖的初步分析：称取LP 0.1 g溶于10 mL蒸馏水中，加6 mol/L HCl 10 mL进行水解5 h，水解液用10% NaOH液中和，过滤，滤液浓缩后点于层析滤纸上，另取葡萄糖等多种对照液点于同一张层析滤纸上，分别用正丁醇-醋酸-水(4∶3∶5)上层、正丁醇-乙醇-水(4∶3∶3)和正丁醇-吡啶-水(6∶4∶3)3种不同展开剂展开后，晾干，喷苯胺-邻苯二甲酸试剂，于105℃显色10 min，结果水解液呈现的斑点与葡萄糖、半乳糖、果糖的Rf值和颜色相同。表明LP是由葡萄糖、半乳糖、果糖组成的杂多糖。
精密称取LP 100 mg，按苯酚-浓硫酸法测定〔6〕LP含量为11.95%。
2.3 茶芎多糖对小鼠溶血素、胸腺和脾脏重量的影响：Balb/c小鼠40只，体重14～17 g，雌雄兼用，随机分成4组。每鼠ip 5%生理盐水鸡红细胞悬液0.2 mL进行免疫，同日按表1 ig LP或生理盐水(NS)，连续8 d，Cy组和LP+Cy组同时ip环磷酰胺(Cy)，连续3 d，末次ig给药24 h后，摘眼取血，离心取血清，按文献方法〔7〕以光密度(OD)读数作为血清溶血素的指标，测定各组溶血素抗体水平；剖取小鼠胸腺和脾脏称重，比较各组差异，结果见表1。
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结果表明：LP能非常显著地拮抗Cy所致的体液免疫抑制，使其恢复正常，说明LP能提高机体体液免疫能力。表1结果还显示，LP 能显著或非常显著地增加正常或Cy组小鼠的脾脏和胸腺的重量，说明LP能提高机体的非特异免疫功能。
表1 LP对小鼠溶血素、胸腺、脾脏重量的影响(
±s) 组别鼠数
剂量
(mg/kg*d)
给药途经
OD值
脾重
(mg)
, 百拇医药
胸腺重
(mg)
NS
10
-
ig
0.306±0.08
80.5±11.1
43.8±15.3
Cy
10
40
ip
, 百拇医药
0.132±0.04
58.6±15.4
15.0±4.1
LP
10
500
ig
0.349±0.10
100.3±17.2△△
62.1±18.4△△
LP+Cy
10
, http://www.100md.com
500+40
ig+ip
0.287±0.07**
72.7±12.6*
41.9±13.7***
与NS组比较：△△P<0.01； 与Cy组比较：*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001
2.4 茶芎多糖对小鼠T淋巴细胞转化率的影响，3只Balb/c小鼠于无菌状态下取脾，并置入含5%小牛血清的Hank's液中，剪碎，离心(1 000 r/min)1 min，取细胞悬液用RPMI-1640培养液离心(2 000 r/min)，洗涤2次，配成107个细胞/毫升，在96孔培养板中，每孔加入100 μL，每组3孔，另设不给药组，逐项加入LP和植物凝集素(PHA)各50 μL，使各组浓度符合表2所示浓度。于含5%CO2孵箱中，37°C依表2中时间培养，于培养结束前加入3H-TdR 0.25 uci/孔。培养结束后取各孔细胞于69号玻璃纤维滤纸上过滤并依次用蒸馏水2 mL、10%三氯醋酸2 mL和无水乙醇1 mL洗涤，滤纸80℃干燥30 min后放入5 mL闪烁液中，过夜测试，并按下式计算淋巴细胞转化指数(A)〔7〕，结果见表2。
, 百拇医药
表2 LP对小鼠T淋巴细胞转化率的影响 组别
LP(μg/mL)
PHA
(μg/mL)
t(h)
cpm
转化指数A
1
16
30
13
31600
1.20
, 百拇医药
2
32
40
23.5
27 694
1.05
3
63
50
9.5
29 652
1.13
4
, 百拇医药
125
25
20
36 390
1.38
5
250
35
6
33 285
1.26
6
500
, 百拇医药
45
16.5
51 325
1.95
空白组
-
50
9.5
26 340
1
优化组
500
50
, 百拇医药
16.5
48 533
1.88
注：表中LP、PHA、t值是通过均匀设计法优选而确定
将结果用计算机进行逐步回归，求得回归方程：A=1.063+0.0016LP (r=0.9221,F=22.71)
结果表明，LP浓度越高，cpm值就越高，转化指数越高，即能提高T淋巴细胞转化率。提示LP具有促进细胞免疫的作用，并具良好的量效关系。
3 讨论
以往茶芎的研究常局限于挥发油或苯酞类等脂溶性成分的研究，而对于水溶性成分的研究甚少，通过对茶芎多糖及其免疫活性的研究，将为茶芎的研究提供一种新的思路，另外，茶芎多糖是用醇提后的药渣来进行提取的，且含量较高，提取分离方法简便，这为茶芎的进一步开发和综合利用开辟了一条新的途径。
, 百拇医药
作者简介：*罗永明 1982年毕业于江西中医学院药学系药学专业，1988年中药研究生毕业并获得硕士学位。责任江西中医学系教授。一起从事中草药活性万分的研究。主持国家自然科学基金课题2项和卫生部青年团科学研究基金及江西省自然科学基金课题多项。参加了国家医药科技攻关计划“1035工程”项目等重大课题的研究工作。近年主要研究成果“中药茶芎化学成分及桔抗谷氨酸神经毒性的研究”获江西省科技进步三等奖。发表学术论文30余篇。
参 考 文 献
[1] 罗永明，等.中国药学杂志，1994，29(12)：714
[2] 罗永明，等.中国中药杂志，1995，20(1)：39
[3] 罗永明，等.中草药，1996，27(8)：456
[4] 陈 奇，等.中药通报，1985，10(5)：44
[5] 潘家祜，等.神经科学，1995，(增刊)：193
[6] 唐晓玲，等.中成药，1995，17(7)：7
[7] 李仪奎.中药药理实验方法学.上海：上海科技出版社，1991：155、165
(1998-03-15收稿), 百拇医药