白细胞介素-2、γ干扰素净化模拟白血病缓解期骨髓及用PCR检测净化效果*
作者：楼方定 董惟佳 于力 张苗
单位：解放军总医院血液科，北京 100853
关键词：白细胞介素-2；γ-干扰素；白血病；自体骨髓；净化；聚合酶链反应
军医进修学院学报990201 摘要 目的：探讨白细胞介素 2(IL-2)、γ-干扰素(IFN-γ)用于自体骨髓中残留白血病细胞的净化及用聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测净化效果。方法：将IL-2、IFN-γ与模拟慢性粒细胞白血病(CML)缓解期的骨髓在培养体系中分别培养 1～6d，通过RT-PCR方法来检测缓解期骨髓中bcr/abl mRNA消失情况。结果：模拟缓解期CML骨髓经与IL-2、IFN-γ 24h、48h和 72h培养后用RT-PCR方法仍可检测到bcr/abl mRNA，而经 6d培养后则已测不到。若将IL-2、IFN-γ合用，经 24和 48h培养的骨髓可检测到bcr/abl mRNA，但经 72h和 6d培养后便检测不到，而对照组在 1～6d培养后仍可检测到该基因。结论：初步实验结果表明IL-2、IFN-γ对缓解期骨髓中的K562白血病细胞系具有净化作用，若两者合用具有协同作用，RT-PCR可作为评估净化效果较为敏感和较为可靠的检测方法。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R 55
The purging effect of interleukin-2 and interferon-γ on imitative bone marrow in remission and thedetection by PCR of the effect
Lou Fangding,dong Weijia,YuLi,Zhang Miao (Department ofhematology,Generalhospital of PLA,Beijing 100853)
Abstract Objective：To Evaluate the purging effect of interleukin-2 (IL-2) and interferon-γ (IFN-γ) on minimal residual leukemic cellsduring autologous bone marrow transplantation and the use of RT-PCR technique indetermining the purging effect.Methods:The imitative chronic myeloid leukemic bone marrow in remissionhad been cultured in liquid mediam with IL-2 and IFN-γ for 1-6days,and the puring effect wasdetermined bydetection of the bcr/ab1 mRNA.Results：The bcr/ab1 mRNA could bedetected by RT-PCR among bone marrow treated with IL-2 or IFN-γ alone for 24,48 and 72hours,but it was negative after 6days of culture.And among bone marrows treated with both IL-2 and IFN-γ,the bcr/ab1 mRNA was positive when treated for 24 and 48hours and negative when treated for 72hours and 6days.In those contrast bone marrows ,which neither IL-2 nor IFN-γ was used,the bcr/ab1 mRNA could still bedetected after 6days of culture.Conclusion:IL-2 and IFN-γ can be used to purge K562 leukemic cells in bone marrow in remission and theyhave coordinate effect when used together.RT-PCR is a sensitive and reliable method to evaluate the purging efftec.
, 百拇医药
Key words Interleukin-2; interferon Gamma; Leukemia; autologous bone marrow; Purging; Polymerse chain reaction
自70年代国外开展用自体骨髓移植(ABMT)治疗某些血液恶性肿瘤以来，在近20年中此项技术有了长足进步，但ABMT后患者白血病复发率较高，其中原因之一认为与采集的自体骨髓中残存有白血病细胞有关，故如何有效清除体外残留白血病细胞以及如何有效评估净化效果便成为当前血液工作者一个重要研究课题。笔者采用IL-2和IFN-γ与模拟缓解期CML(K562细胞系)在体外培养体系中一起培养，以观察对残留CML细胞的影响，并采用RT-PCR技术来评估净化效果的可行性。
1 材料和方法
1.1 细胞系 K562细胞是CML细胞系，有bcr/ab1 mRNA重排，HL-60细胞为急性髓细胞白血病细胞系，无bcr/ab1 mRNA重排，作为本实验的阴性对照(均由军事医学科学院提供)，骨髓来源于我院开胸手术患者(患心脏病)的肋骨骨髓。
, 百拇医药
1.2 药物与试剂 IL-2和IFN-γ均为军事医学科学院产品，粒-巨噬细胞生长刺激因子(GM-CSF)为美国先灵葆雅公司产品。PCR引物：BCR 5′-AGGGTGCACAGCCGCAACGGC-3′，ABL： 5′-GGCTTCCACTCAGACCCTGAGG-3′由北京医科大学人民医院血研所提供，内参 2-tubulin引物5′-CCCGTCTTCAGGGCTTC-3′，5′-TTAAGGTAA-GTG-3′，由中国医学科学院肿瘤研究所孟祥文博士惠赠。
1.3 粒-巨噬系细胞集落(GM-CFU)琼脂半固体培养 取单个核细胞2×105/ml，放在含10%胎牛血清、10%马血清和50U/ml GM-CSF的含IMDM(Gibco公司，美国)培养体系中 37°C、5%CO2里行半固体培养 10d，计数 40 个以上细胞组成的集落。
1.4 RT-PCR方法测定bcr/ab1 mRNA的表达 取 1×106 细胞提取总RNA后，行RT-PCR方法检测bcr/ab1 mRNA的表达及敏感度测定〔1〕。
, 百拇医药
1.5 骨髓净化实验 根据文献，骨髓净化时IL-2 和IFN-γ的最适宜浓度均为 1 000U/ml〔2〕。取骨髓单个核细胞1×106/ml 分别加入 1×104/ml 的K562细胞、IL-2、IFN-γ和IL-2+IFN-γ，上述 4 组在含 10% 胎牛血清的RPMI 1640 (Gibco公司，美国)液体培养体系下培养 1～6d，培养d 3 时换液 1 次，换液后重新加净化开始时相同浓度的IL-2，IFN-γ和GM-CSF及调整至实验开始时细胞浓度，将分别收集经 1～6d 培养的细胞按比例稀释后用RT-PCR 方法检测bcr/ab1 mRNA，以评价净化效果，同时做半固体培养，计数净化 1～6d GM-CFU集落，以观察净化对骨髓造血祖细胞的影响。
1.6 统计学处理 本实验所有数据均用SAS软件进行分析处理。
2 结果
, http://www.100md.com
2.1 各净化组不同时间GM-CFU的比较 经GM-CFU测定发现各实验组随培养时间的延长GM-CFU生长的抑制日趋明显，IL-2 未显示出对骨髓GM-CFU的生长有抑制作用，而IFN-γ及INF+IL-2 组与K562 组比均有显著区别。表 1、表 2。
表1 各净化实验组GM-CFU集落计数
[(
±s)/2×105单个核细胞,n=6] 净化时间
(d)
净化方法
1%K562
IL-2
, http://www.100md.com IFN-γ
IL-2+IFN-γ
1
145±11
132±13
99±4
75±4
2
134±8
125±10
67±4
49±4
3
, 百拇医药
112±14
104±11
40±7
34±8
4
93±6
91±10
33±9
29±7
5
75±9
70±5
22±4
, http://www.100md.com
24±5
6
69±5
62±8
17±5
13±3
注：净化前对照组(1%K562组)GM-CFU集落计数为 169±15表2 各净化实验组GM-CFU集落计数6d结果的平均数
〔(x±s)/2×105单个核细胞〕 1%K562
IL-2
IFN-γ
IL-2+IFN-γ
, http://www.100md.com
F
P
x±s
104.7±31.1
97.3±28.5
46.3±31.2
37.3±21.9
133.72
0.0001
* **
* **
x±s
104.7±12.7
, 百拇医药
97.3±11.7
46.3±12.7
37.3±9.0
* 与1%K562比较，P<0.05； ** 与IL-2比较，P<0.05
2.2 RT-PCR方法检测bcr/ab1 mRNA表达的敏感度 见图 1 ，其敏感度为 10-4。
图1 RT-PCR检测bcr/ab1 mRNA敏感度测定
K562 细胞与HL60 梯度稀释后提取RNA进行RT-RXR扩增结果。
M是PBR322hinf Ⅰ 分子量标准(其片段大小自加样孔近端依次为
, 百拇医药
1631bp、517bp、396bp、344bp、298bp、221bp、154bp、75bp)，1 为HL60 阴性对照，2～7 分别为K562 被稀释成 100～10-5倍
2.3 RT-PCR检测不同净化时间bcr/ab1 mRNA的表达 净化 3d 时只有IFN-γ+IL-2 组未检测到bcr/ab1 mRNA的表达，见表 3 和图 2。
表3 各净化实验组bcr/ab1 mRNA检测结果 净化时间
(d)
净化方法
1%K562
IL-2
IFN-γ
, 百拇医药
IL-2+IFN-γ
1
+
+
+
+
2
+
+
+
+
3
+
+
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+
-
6
+
-
-
-
图2 RT-PCR检测 6d 净化效果
M是分子量标准，1 为K562 阳性对照，2 为 1% K562 组，3 为IL-2 组，4 为IFN-γ组，5 为IL-2+IFN-γ组
3 讨论
, 百拇医药
IL-2 是T细胞的自分泌或旁分泌生长因子，主要由抗原或丝裂原激活的CD4+ T细胞产生，人的IL-2 由 133 个氨基酸残基组成，分子量约为 13.89～16.86 ku ，是一种糖蛋白，它的某些重要生物学特性可用于体外净化自体骨髓中残留白血病细胞，例如：①IL-2 能激活NK细胞以发挥抗肿瘤效应；②在体外与自体骨髓一起培养可激活骨髓(ABM)，这种ABM细胞具有广谱抗肿瘤活性；③IL-2 可激发骨髓中的LAK等杀伤细胞分泌TNF和IFN，如自体骨髓加IL-2 在体外共同培养 24h 后TNF-α、IFN-γ含量较对照组明显增加，有人经实验证明，经与IL-2 共同培养的骨髓，其NK细胞和LAK细胞的活性明显增强，而LAK细胞还具有非MHC限制性的肿瘤杀伤作用，它具有选择性杀伤瘤细胞而又不杀伤正常造血祖细胞〔2～5〕特点。
IFN-γ由活化的T细胞产生，它对白血病等肿瘤细胞具有强的增殖抑制作用，还可通过增加Tac抗原的表达来增强LAK细胞活性〔5〕，IFN-γ还具有明显的增强ABM的细胞毒效应。据文献报告，IL-2 与IFN-γ合用，在体外能净化比较大负荷量的白血病细胞，而对正常造血祖细胞的生长无明显损害，已成功地用于CML的ABMT〔4〕。
, 百拇医药
根据以上理论根据，本研究采用细胞培养技术，将IL-2、IFN-γ与模拟CML缓解期的骨髓(由正常人骨髓+含 1% K562 细胞系组成)在体外液体培养体系中分别培养 1～6d，IL-2 和IFN-γ的浓度参照文献所报告的各为 10000U/ml〔2〕。
用免疫学、细胞遗传学、体外克隆形成培养法来评估体外白血病细胞净化效果均不能发现<1%～5%的微小残留白血病细胞，而RT-PCR具有简便，快速和极高灵敏度，本研究采用RT-PCR技术来检测bcr/ab1 mRNA，以评估体外净化效果。为防止出现假阴性，本研究设立了内对照(2-tubulin,扩增产物为 295 bp )、阴性对照(HL60 细胞)和阳性对照，从而保证了检测结果的准确性。
实验结果表明，经和IL-2 培养24h、48h 和 72h 的骨髓，仍可应用RT-PCR技术检测出bcr/ab1 mRNA，但经 6d 的培养则检测不出bcr/ab1 mRNA。因本实验中RT-PCR检测bcr/ab1 mRNA的敏感度为 10-4，故经IL-2 处理 24h、48 和 72h 的骨髓中微小残留白血病细胞(MRLC)水平>10-4，而经 6d 培养的骨髓其MRLC<10-4。同理，经IFN-γ处理 24h、48 和 72h的骨髓其MRLC>10-4，经IFN-γ 6d 培养的骨髓其MRLC<10-4。经IL-2、IFN-γ联合培养 24h、48h 的骨髓其MRLC>10-4，但经联合培养 72h 、6d 的骨髓其MRLC<10-4，而对照组( 1% K562 组)MRLC始终在10-4以上，经多次重复检测，结果均如此(见表 3 和图 2 )。说明IL-2、IFN-γ具有净化骨髓中K562 细胞的作用，且随着净化时间的延长，净化效果日趋明显。若IL-2、IFN-γ联合应用，其净化效果强于单独应用IL-2 或IFN-γ组，说明IL-2 和IFN-γ在体外净化自体骨髓残留白血病细胞过程中具有协同作用，此结果与国外有关文献报告相同〔2，4，5〕。
, 百拇医药
最理想的净化效果应该是在最大限度清除骨髓MRLC的同时，能最大限度的保持骨髓中造血潜能细胞活性(PCA)。本实验中，IL-2 未显示出对骨髓中GM-CFU生长具有抑制作用(与 1% K562 组比较，P>0.05)；IFN-γ对骨髓中GM-CFU生长具有抑制作用(与 1% K562 组及IL2 组比较，P<0.05)；IL-2 与IFN-γ合用，其对于骨髓中GM-CFU生长具有抑制作用(与 1% K562 组比较，P<0.05)，但和单独应用INF-γ组相比，二者差异不显著(P>0.05)，随着培养时间的延长，GM-CFU生长的抑制日趋明显(表 2 )。上述实验结果说明骨髓中GM-CFU生长抑制是由于液体培养本身及IFN-γ所致，同以往国外有关文献报导一致〔2，4，5〕。另有文献报道〔4，6，7〕，虽然自体骨髓在净化过程中GM-CFU的生长受抑制，但回输体内后造血功能仍可迅速重建。故不论是IL-2 和IFN-γ在自体骨髓净化中均有一定的临床应用价值。
综上所述，IL-2、IFN-γ对于缓解期骨髓中MRLC具有一定的净化作用，今后有待进一步研究各细胞因子最合适的联合应用方式，以提高骨髓净化的有效性。PCR技术可作为一种敏感、可靠的方法应用于自体骨髓净化效果的评估，随着半定量和定量PCR的应用，PCR技术必将在评估自体骨髓净化效果等方面发挥更加积极的作用。
, 百拇医药
*“九五”军队医药卫生基金资助项目，批准号 95M137
参考文献
[1]朱沛轩主编.PCR扩增操作方法.成都：四川大学出版社，1995.38:43
[2]Charak BS,Choudhary GD,Tefft M et al.Interleukin-2 in bone marrow transplantation: preclinical studies.Bone Marrow Transplant,1992,10:103
[3]KlinegmannhG,Neerunjun J,Schwulera U et al.culture of normal and leukemic bone marrow in interleukin-2： analysis of cell activation,cell proliferation,and cytokine production.Leukemia,1993,7:1389
, http://www.100md.com
[4]Charak BS,Agah R,Grayd et al.Interaction of various cytokines with interleukin-2 in the generation of killer cells fromhuman bone marrow: application in purging of leukemia.Leukemia Res,1991,15:801
[5]Dickinson AM,Middleton SL,Latham J et al.Cytokine treatment ofhuman bone marrow activates antileukemia effector cells: monitoring of purging by polymerase chain reaction anddNA analysis.Leukemia,1995,9:444
[6]McGlave PB,Mamus S,Vilen B et al.Autologous transplantation for CML use marrow treated ex vivo with recombinanthuman interferon gamma.Bone Marrow Transplant,1990,6:115
[7]Becker M,Fabrega S,Belloc F et al.Interferon gamma is effective for BM pruging in a patient with CML.Bone Marrow Transplant,1993,12:155
(1998—10—20收稿，1998—12—14修回), http://www.100md.com
单位：解放军总医院血液科，北京 100853
关键词：白细胞介素-2；γ-干扰素；白血病；自体骨髓；净化；聚合酶链反应
军医进修学院学报990201 摘要 目的：探讨白细胞介素 2(IL-2)、γ-干扰素(IFN-γ)用于自体骨髓中残留白血病细胞的净化及用聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测净化效果。方法：将IL-2、IFN-γ与模拟慢性粒细胞白血病(CML)缓解期的骨髓在培养体系中分别培养 1～6d，通过RT-PCR方法来检测缓解期骨髓中bcr/abl mRNA消失情况。结果：模拟缓解期CML骨髓经与IL-2、IFN-γ 24h、48h和 72h培养后用RT-PCR方法仍可检测到bcr/abl mRNA，而经 6d培养后则已测不到。若将IL-2、IFN-γ合用，经 24和 48h培养的骨髓可检测到bcr/abl mRNA，但经 72h和 6d培养后便检测不到，而对照组在 1～6d培养后仍可检测到该基因。结论：初步实验结果表明IL-2、IFN-γ对缓解期骨髓中的K562白血病细胞系具有净化作用，若两者合用具有协同作用，RT-PCR可作为评估净化效果较为敏感和较为可靠的检测方法。
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中国图书资料分类法分类号 R 55
The purging effect of interleukin-2 and interferon-γ on imitative bone marrow in remission and thedetection by PCR of the effect
Lou Fangding,dong Weijia,YuLi,Zhang Miao (Department ofhematology,Generalhospital of PLA,Beijing 100853)
Abstract Objective：To Evaluate the purging effect of interleukin-2 (IL-2) and interferon-γ (IFN-γ) on minimal residual leukemic cellsduring autologous bone marrow transplantation and the use of RT-PCR technique indetermining the purging effect.Methods:The imitative chronic myeloid leukemic bone marrow in remissionhad been cultured in liquid mediam with IL-2 and IFN-γ for 1-6days,and the puring effect wasdetermined bydetection of the bcr/ab1 mRNA.Results：The bcr/ab1 mRNA could bedetected by RT-PCR among bone marrow treated with IL-2 or IFN-γ alone for 24,48 and 72hours,but it was negative after 6days of culture.And among bone marrows treated with both IL-2 and IFN-γ,the bcr/ab1 mRNA was positive when treated for 24 and 48hours and negative when treated for 72hours and 6days.In those contrast bone marrows ,which neither IL-2 nor IFN-γ was used,the bcr/ab1 mRNA could still bedetected after 6days of culture.Conclusion:IL-2 and IFN-γ can be used to purge K562 leukemic cells in bone marrow in remission and theyhave coordinate effect when used together.RT-PCR is a sensitive and reliable method to evaluate the purging efftec.
, 百拇医药
Key words Interleukin-2; interferon Gamma; Leukemia; autologous bone marrow; Purging; Polymerse chain reaction
自70年代国外开展用自体骨髓移植(ABMT)治疗某些血液恶性肿瘤以来，在近20年中此项技术有了长足进步，但ABMT后患者白血病复发率较高，其中原因之一认为与采集的自体骨髓中残存有白血病细胞有关，故如何有效清除体外残留白血病细胞以及如何有效评估净化效果便成为当前血液工作者一个重要研究课题。笔者采用IL-2和IFN-γ与模拟缓解期CML(K562细胞系)在体外培养体系中一起培养，以观察对残留CML细胞的影响，并采用RT-PCR技术来评估净化效果的可行性。
1 材料和方法
1.1 细胞系 K562细胞是CML细胞系，有bcr/ab1 mRNA重排，HL-60细胞为急性髓细胞白血病细胞系，无bcr/ab1 mRNA重排，作为本实验的阴性对照(均由军事医学科学院提供)，骨髓来源于我院开胸手术患者(患心脏病)的肋骨骨髓。
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1.2 药物与试剂 IL-2和IFN-γ均为军事医学科学院产品，粒-巨噬细胞生长刺激因子(GM-CSF)为美国先灵葆雅公司产品。PCR引物：BCR 5′-AGGGTGCACAGCCGCAACGGC-3′，ABL： 5′-GGCTTCCACTCAGACCCTGAGG-3′由北京医科大学人民医院血研所提供，内参 2-tubulin引物5′-CCCGTCTTCAGGGCTTC-3′，5′-TTAAGGTAA-GTG-3′，由中国医学科学院肿瘤研究所孟祥文博士惠赠。
1.3 粒-巨噬系细胞集落(GM-CFU)琼脂半固体培养 取单个核细胞2×105/ml，放在含10%胎牛血清、10%马血清和50U/ml GM-CSF的含IMDM(Gibco公司，美国)培养体系中 37°C、5%CO2里行半固体培养 10d，计数 40 个以上细胞组成的集落。
1.4 RT-PCR方法测定bcr/ab1 mRNA的表达 取 1×106 细胞提取总RNA后，行RT-PCR方法检测bcr/ab1 mRNA的表达及敏感度测定〔1〕。
, 百拇医药
1.5 骨髓净化实验 根据文献，骨髓净化时IL-2 和IFN-γ的最适宜浓度均为 1 000U/ml〔2〕。取骨髓单个核细胞1×106/ml 分别加入 1×104/ml 的K562细胞、IL-2、IFN-γ和IL-2+IFN-γ，上述 4 组在含 10% 胎牛血清的RPMI 1640 (Gibco公司，美国)液体培养体系下培养 1～6d，培养d 3 时换液 1 次，换液后重新加净化开始时相同浓度的IL-2，IFN-γ和GM-CSF及调整至实验开始时细胞浓度，将分别收集经 1～6d 培养的细胞按比例稀释后用RT-PCR 方法检测bcr/ab1 mRNA，以评价净化效果，同时做半固体培养，计数净化 1～6d GM-CFU集落，以观察净化对骨髓造血祖细胞的影响。
1.6 统计学处理 本实验所有数据均用SAS软件进行分析处理。
2 结果
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2.1 各净化组不同时间GM-CFU的比较 经GM-CFU测定发现各实验组随培养时间的延长GM-CFU生长的抑制日趋明显，IL-2 未显示出对骨髓GM-CFU的生长有抑制作用，而IFN-γ及INF+IL-2 组与K562 组比均有显著区别。表 1、表 2。
表1 各净化实验组GM-CFU集落计数
[(
±s)/2×105单个核细胞,n=6] 净化时间(d)
净化方法
1%K562
IL-2
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IL-2+IFN-γ
1
145±11
132±13
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67±4
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75±9
70±5
22±4
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24±5
6
69±5
62±8
17±5
13±3
注：净化前对照组(1%K562组)GM-CFU集落计数为 169±15表2 各净化实验组GM-CFU集落计数6d结果的平均数
〔(x±s)/2×105单个核细胞〕 1%K562
IL-2
IFN-γ
IL-2+IFN-γ
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F
P
x±s
104.7±31.1
97.3±28.5
46.3±31.2
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133.72
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37.3±9.0
* 与1%K562比较，P<0.05； ** 与IL-2比较，P<0.05
2.2 RT-PCR方法检测bcr/ab1 mRNA表达的敏感度 见图 1 ，其敏感度为 10-4。
图1 RT-PCR检测bcr/ab1 mRNA敏感度测定
K562 细胞与HL60 梯度稀释后提取RNA进行RT-RXR扩增结果。
M是PBR322hinf Ⅰ 分子量标准(其片段大小自加样孔近端依次为
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1631bp、517bp、396bp、344bp、298bp、221bp、154bp、75bp)，1 为HL60 阴性对照，2～7 分别为K562 被稀释成 100～10-5倍
2.3 RT-PCR检测不同净化时间bcr/ab1 mRNA的表达 净化 3d 时只有IFN-γ+IL-2 组未检测到bcr/ab1 mRNA的表达，见表 3 和图 2。
表3 各净化实验组bcr/ab1 mRNA检测结果 净化时间
(d)
净化方法
1%K562
IL-2
IFN-γ
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IL-2+IFN-γ
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图2 RT-PCR检测 6d 净化效果
M是分子量标准，1 为K562 阳性对照，2 为 1% K562 组，3 为IL-2 组，4 为IFN-γ组，5 为IL-2+IFN-γ组
3 讨论
, 百拇医药
IL-2 是T细胞的自分泌或旁分泌生长因子，主要由抗原或丝裂原激活的CD4+ T细胞产生，人的IL-2 由 133 个氨基酸残基组成，分子量约为 13.89～16.86 ku ，是一种糖蛋白，它的某些重要生物学特性可用于体外净化自体骨髓中残留白血病细胞，例如：①IL-2 能激活NK细胞以发挥抗肿瘤效应；②在体外与自体骨髓一起培养可激活骨髓(ABM)，这种ABM细胞具有广谱抗肿瘤活性；③IL-2 可激发骨髓中的LAK等杀伤细胞分泌TNF和IFN，如自体骨髓加IL-2 在体外共同培养 24h 后TNF-α、IFN-γ含量较对照组明显增加，有人经实验证明，经与IL-2 共同培养的骨髓，其NK细胞和LAK细胞的活性明显增强，而LAK细胞还具有非MHC限制性的肿瘤杀伤作用，它具有选择性杀伤瘤细胞而又不杀伤正常造血祖细胞〔2～5〕特点。
IFN-γ由活化的T细胞产生，它对白血病等肿瘤细胞具有强的增殖抑制作用，还可通过增加Tac抗原的表达来增强LAK细胞活性〔5〕，IFN-γ还具有明显的增强ABM的细胞毒效应。据文献报告，IL-2 与IFN-γ合用，在体外能净化比较大负荷量的白血病细胞，而对正常造血祖细胞的生长无明显损害，已成功地用于CML的ABMT〔4〕。
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根据以上理论根据，本研究采用细胞培养技术，将IL-2、IFN-γ与模拟CML缓解期的骨髓(由正常人骨髓+含 1% K562 细胞系组成)在体外液体培养体系中分别培养 1～6d，IL-2 和IFN-γ的浓度参照文献所报告的各为 10000U/ml〔2〕。
用免疫学、细胞遗传学、体外克隆形成培养法来评估体外白血病细胞净化效果均不能发现<1%～5%的微小残留白血病细胞，而RT-PCR具有简便，快速和极高灵敏度，本研究采用RT-PCR技术来检测bcr/ab1 mRNA，以评估体外净化效果。为防止出现假阴性，本研究设立了内对照(2-tubulin,扩增产物为 295 bp )、阴性对照(HL60 细胞)和阳性对照，从而保证了检测结果的准确性。
实验结果表明，经和IL-2 培养24h、48h 和 72h 的骨髓，仍可应用RT-PCR技术检测出bcr/ab1 mRNA，但经 6d 的培养则检测不出bcr/ab1 mRNA。因本实验中RT-PCR检测bcr/ab1 mRNA的敏感度为 10-4，故经IL-2 处理 24h、48 和 72h 的骨髓中微小残留白血病细胞(MRLC)水平>10-4，而经 6d 培养的骨髓其MRLC<10-4。同理，经IFN-γ处理 24h、48 和 72h的骨髓其MRLC>10-4，经IFN-γ 6d 培养的骨髓其MRLC<10-4。经IL-2、IFN-γ联合培养 24h、48h 的骨髓其MRLC>10-4，但经联合培养 72h 、6d 的骨髓其MRLC<10-4，而对照组( 1% K562 组)MRLC始终在10-4以上，经多次重复检测，结果均如此(见表 3 和图 2 )。说明IL-2、IFN-γ具有净化骨髓中K562 细胞的作用，且随着净化时间的延长，净化效果日趋明显。若IL-2、IFN-γ联合应用，其净化效果强于单独应用IL-2 或IFN-γ组，说明IL-2 和IFN-γ在体外净化自体骨髓残留白血病细胞过程中具有协同作用，此结果与国外有关文献报告相同〔2，4，5〕。
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最理想的净化效果应该是在最大限度清除骨髓MRLC的同时，能最大限度的保持骨髓中造血潜能细胞活性(PCA)。本实验中，IL-2 未显示出对骨髓中GM-CFU生长具有抑制作用(与 1% K562 组比较，P>0.05)；IFN-γ对骨髓中GM-CFU生长具有抑制作用(与 1% K562 组及IL2 组比较，P<0.05)；IL-2 与IFN-γ合用，其对于骨髓中GM-CFU生长具有抑制作用(与 1% K562 组比较，P<0.05)，但和单独应用INF-γ组相比，二者差异不显著(P>0.05)，随着培养时间的延长，GM-CFU生长的抑制日趋明显(表 2 )。上述实验结果说明骨髓中GM-CFU生长抑制是由于液体培养本身及IFN-γ所致，同以往国外有关文献报导一致〔2，4，5〕。另有文献报道〔4，6，7〕，虽然自体骨髓在净化过程中GM-CFU的生长受抑制，但回输体内后造血功能仍可迅速重建。故不论是IL-2 和IFN-γ在自体骨髓净化中均有一定的临床应用价值。
综上所述，IL-2、IFN-γ对于缓解期骨髓中MRLC具有一定的净化作用，今后有待进一步研究各细胞因子最合适的联合应用方式，以提高骨髓净化的有效性。PCR技术可作为一种敏感、可靠的方法应用于自体骨髓净化效果的评估，随着半定量和定量PCR的应用，PCR技术必将在评估自体骨髓净化效果等方面发挥更加积极的作用。
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*“九五”军队医药卫生基金资助项目，批准号 95M137
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(1998—10—20收稿，1998—12—14修回), http://www.100md.com