我国猪瘟病毒兔化弱毒株囊膜糖蛋白E0基因的克隆及序列测定*
作者：李红卫 刘湘涛 李小兵 韩雪清 殷 震
单位：李红卫 李小兵 殷 震(长春农牧大学，长春130062)；刘湘涛 韩雪清 (兰州兽医研究所，兰州730046)
关键词：猪瘟病毒兔化弱毒株；囊膜糖蛋白E0基因；克隆；序列测定
我国猪瘟病毒兔化弱毒株囊膜糖蛋白E0基因的 克隆及序列测定
摘 要 采用异硫氰酸胍一步法从480代猪瘟病毒兔化弱毒株(HCLV)脾毒中提取总RNA，以该RNA为模板，进行反转录，然后采用套式PCR扩增出HCLV的囊膜糖蛋白E0基因，琼脂糖凝胶电泳表明其大小与预计相符。将扩增出的E0基因克隆到pGEM-T载体中，用自动序列分析仪对其进行序列测定。将测得的序列及推导的氨基酸序列与国外测得的C株相应序列进行比较，结果发现，它们之间核苷酸序列同源性为99.08%，氨基酸序列同源性为98.42%。
, 百拇医药
Cloning and Sequencing of Envelope Glycoprotein E0 Gene of Hog Cholera Virus Strain C
Li Hongwei Liu Xiangtao* Li Xiaobing Han Xueqing* Yin Zhen
(Changchun University of Agricultural and Animal Sciences, Changchun 130062)
* (Lanzhou Veterinary Institute, Lanzhou 730046)
Abstract The envelope glycoprotein E0 gene of hog cholera virus (HCV) strain C was amplified from total RNA extracted from HCV strain C infected rabbit spleen by reverse transcription and nested PCR. The PCR product was cloned into pGEM-T vector. Nucleotide sequencing was performed using an ABI PRISM sequencing device. Based on the incorporation of fluorescence labelled dideoxynuclotide teminators, the sequence was compared with HCV strain C sequenced by Moormann et al. The result showed that their homologies on nucleotide and amino acid sequences were 99.08% and 98.42%, respectively.
, http://www.100md.com
Key words Hog cholera virus strain C, Envelope glycoprotein E0 gene, Cloning, Sequencing
猪瘟病毒兔化弱毒株(HCLV)又称C株，是我国50年代培育的。它是目前国际上应用最广泛、国内唯一应用的疫苗毒株。该疫苗株对我国猪瘟的防治起到了决定性作用，有效地控制了猪瘟在我国的急性发生和大流行，也为欧洲一些国家的猪瘟控制和消灭作出了贡献。
猪瘟病毒(HCV)为黄病毒科瘟病毒属成员，其基因组为单股正链RNA，长度为12.3 kb,仅含有一个大的开放阅读框架，编码一个含3898个氨基酸残基(AA)的多聚前体蛋白[1，2]。目前已经定位的蛋白有p23、p14和E0、E1、E2，它们均由HCV RNA 5′端所编码，除p23外，其它4种均为HCV的结构蛋白。E0 N末端为Glu-268，它由227AA构成，分子量为44～48 kDa[3]。
, http://www.100md.com
近几年，HCV的基因克隆和序列测定进展很快，仅在GenBank中可查到的HCV基因组全序列就达10个。其中Moormann等测定了C株细胞毒的基因组全序列并构建了其全长的cDNA克隆，在体外可转录为感染性RNA[4]。我国近几年在HCV的基因克隆和序列分析方面也取得了较大进展，已经克隆了HCV石门系强毒株部分5′端非编码区、E2基因及兔化弱毒株(细胞毒)的E2基因等，并对它们进行了序列分析，但未见到有关兔化弱毒株组织毒的基因克隆和序列分析的报道[5，6]。
本研究利用RT-PCR技术首次扩增了我国HCLV细胞毒E0基因，对其进行了克隆和序列分析，并与Moormann等测定的C株序列进行了比较。这将为进一步研究E0的功能打下基础，也可能为猪瘟的防治提供新的途径。
1 材料和方法
1.1 病毒的增殖及RNA的提取[7]
, http://www.100md.com
HCLV 479代冻干毒引自中国兽药监察所，在健康家兔体内增殖，采取呈定型热反应家兔的脾脏，用异硫氰酸胍一步法提取其总RNA(采用BRL公司TRIZOL试剂盒)，琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，Gene Quant (Pharmacia公司)测定其纯度和浓度。
1.2 引物的设计与合成
根据HCV C株的序列设计合成两对引物[4]，引物的序列及在基因组中的位置分别为：
PA：5′ACTATGG↓AACCACCAGAATCTAGGAAG 3′(正链，1075～1095，划线部分为另加的起始密码子等)
PB：5′GTGTTTTTGGGGAGGCAAGC 3′(负链，1941～1922)
, http://www.100md.com Pa：5′AAAGCCCTATTGGCATGGG 3′(正链，1108～1126)
Pb:5′ GGTGCAGTTGTTAGTGTACC 3′(负链，1918～1897)
1.3 RT-PCR
取上面提取的RNA 10μg，加引物PB 1μL(200ng/μL)，65℃ 5min,立即冰浴5min;然后依次加入5×RT buffer 4μL,dNTP(10mmol/L)1μL,AMV(10u/μL)1μL，RNasin(40u/μL) 1μL，加水补充至20μL，42℃ 1h。
取反转录产物5μL,加引物PA、PB各1μL(200ng/μL),10×PCR buffer 5μL, 2.5mmol/L MgCl2 5μL (25mmol/L)，dNTP(10mmol/L)1μL，加水至49μL;然后98℃ 8min,加Taq DNA聚合酶1μL(1u/μL,Promega公司)，以95℃ 50s，48℃ 1min,72℃ 2min，于Bio Techs-97 DNA Themocycler (Beijing Biotechs Co Ltd)进行循环反应。取PCR产物1μL 50倍稀释，取5μL作为模板，以Pa、Pb为引物，与上面相同条件进行PCR。
, http://www.100md.com
1.4 PCR产物的克隆与序列测定
用Agarose Gel DNA Extraction kit (Boehringer Mannheim公司)纯化PCR产物，然后采用pGEM-T载体(Promega公司)进行克隆(按操作说明书进行)。克隆后用ABI PRISM 377 DNA Sequencer对扩增片段进行序列测定。
2 结果与讨论
按照要求HCLV需要来自组织毒，但组织毒不易纯化，又因为其含HCLV量较低，单独一次PCR均不能成功扩增出特异性片段。有时竟扩增出与预计大小相符的片段，但经测序证明为非特异性插入。扩增HCLV基因组其它区域，也遇到了同样的问题。后来采用套式PCR才成功扩增出了与预计大小(803 bp)相符的片段，即E0基因(电泳图略)。
将扩增的片段克隆到pGEM-T载体中，然后采用全自动序列分析仪对插入片段进行序列测定，结果见图1。将所测定的序列与Moormann等测得的C株序列进行比较(见图2和图3)，其同源性达99.08%(762个碱基中共有7个不同)，推导的氨基酸序列同源性为98.42%(253个氨基酸中共有4个差异)，这种差异的产生可能由HCLV的来源不同而引起(据与Moormann等所在实验室了解，其C株来自台湾)。
, 百拇医药
图1 猪瘟病毒兔化弱毒株E0基因的核苷酸及推导的氨基酸序列
Fig.1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of E0 gene of hog cholera virus strain C
图2 不同来源E0基因序列的比较
E0来自本实验，CE0来自Moormaan等测得的C株序列。
Fig.2 Sequence comparison of E0 gene from different sources
, 百拇医药
E0 was from our lab,CE0 was sequenced by Moormann et al.
图3 不同来源HCV C株E0序列的比较
Fig.3 Sequnece comparison of E0 from different sources of HCV strain C
E0是唯一可分泌到HCV侵染的细胞培养上清液中的糖蛋白，具有产生中和抗体的能力[8]。进一步研究发现，从HCV感染的细胞中分离纯化的E0和杆状病毒载体表达的E0蛋白均具有RNase活性，而这种RNase活性在HCV的复制过程中起着重要的作用，并且有可能是HCV在其自然宿主持续存在的原因[9]。HCLV E0基因的成功克隆将对我们进一步研究E0的功能及如何利用该基因在猪瘟的防治中发挥作用打下了基础。
, 百拇医药
* 国家攀登计划B类项目资助课题
参考文献
[1] Meyers G, Rumenapf T, Thiel H J. Molecular cloning and nucleotide sequence of the genome of hog cholera virus. Virology, 1989,171:555～567
[2] Moormann R J M, Warmerdam P A M, Meer B V D et al. Molecular cloning and nucleotide sequence of hog cholera virus strain Brescia and mapping of the genome region encoding envelope protein E1. Virology, 1990,177:184～198
, 百拇医药
[3] Stark R, Rumenapf G, Meyers et al. Genomic localization of hog cholera virus glycoproteins. Virology, 1990,174:286～289
[4] Moormann R J, van Gennip H G, Miedema G K et al. Infectious RNA transcribed from an engineered full-length cDNA template of the genome of a pestivirus. J Virol, 1996,70:763～770
[5] 涂长春，李红卫，金扩世等. 猪瘟病毒石门株特异cDNA片段的扩增与序列分析. 病毒学报，1994，10(1)：33～38
[6] 李红卫，涂长春，金扩世等. 猪瘟病毒石门株与兔化弱毒株主要保护性抗原E2基因的序列测定. 畜禽重大疫病免疫防治研究进展(谢庆阁等主编)，中国农业科技出版社，1997，22～26
, 百拇医药
[7] Chomezynski P, Piotr, Nicoletta S. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenolchloroform extraction. Analytical Biochemistry, 1987,162:156～159
[8] Weiland E, Ahl R, Stark R et al. A second envelope glycoprotein mediates neutralization a pestivirus, hog cholera virus. J Virol, 1992,66:3677～3682
[9] Hulst MM, Panoto FE, Hoekman A et al. Inactivation of the RNase activity of glyoprotein E (rns) of classical swine fever virus results in a cytopathogenic virus. J Virol, 1998,72:151～157
收稿日期：1998-05-04，修回日期：1998-10-26, 百拇医药
单位：李红卫 李小兵 殷 震(长春农牧大学，长春130062)；刘湘涛 韩雪清 (兰州兽医研究所，兰州730046)
关键词：猪瘟病毒兔化弱毒株；囊膜糖蛋白E0基因；克隆；序列测定
我国猪瘟病毒兔化弱毒株囊膜糖蛋白E0基因的 克隆及序列测定
摘 要 采用异硫氰酸胍一步法从480代猪瘟病毒兔化弱毒株(HCLV)脾毒中提取总RNA，以该RNA为模板，进行反转录，然后采用套式PCR扩增出HCLV的囊膜糖蛋白E0基因，琼脂糖凝胶电泳表明其大小与预计相符。将扩增出的E0基因克隆到pGEM-T载体中，用自动序列分析仪对其进行序列测定。将测得的序列及推导的氨基酸序列与国外测得的C株相应序列进行比较，结果发现，它们之间核苷酸序列同源性为99.08%，氨基酸序列同源性为98.42%。
, 百拇医药
Cloning and Sequencing of Envelope Glycoprotein E0 Gene of Hog Cholera Virus Strain C
Li Hongwei Liu Xiangtao* Li Xiaobing Han Xueqing* Yin Zhen
(Changchun University of Agricultural and Animal Sciences, Changchun 130062)
* (Lanzhou Veterinary Institute, Lanzhou 730046)
Abstract The envelope glycoprotein E0 gene of hog cholera virus (HCV) strain C was amplified from total RNA extracted from HCV strain C infected rabbit spleen by reverse transcription and nested PCR. The PCR product was cloned into pGEM-T vector. Nucleotide sequencing was performed using an ABI PRISM sequencing device. Based on the incorporation of fluorescence labelled dideoxynuclotide teminators, the sequence was compared with HCV strain C sequenced by Moormann et al. The result showed that their homologies on nucleotide and amino acid sequences were 99.08% and 98.42%, respectively.
, http://www.100md.com
Key words Hog cholera virus strain C, Envelope glycoprotein E0 gene, Cloning, Sequencing
猪瘟病毒兔化弱毒株(HCLV)又称C株，是我国50年代培育的。它是目前国际上应用最广泛、国内唯一应用的疫苗毒株。该疫苗株对我国猪瘟的防治起到了决定性作用，有效地控制了猪瘟在我国的急性发生和大流行，也为欧洲一些国家的猪瘟控制和消灭作出了贡献。
猪瘟病毒(HCV)为黄病毒科瘟病毒属成员，其基因组为单股正链RNA，长度为12.3 kb,仅含有一个大的开放阅读框架，编码一个含3898个氨基酸残基(AA)的多聚前体蛋白[1，2]。目前已经定位的蛋白有p23、p14和E0、E1、E2，它们均由HCV RNA 5′端所编码，除p23外，其它4种均为HCV的结构蛋白。E0 N末端为Glu-268，它由227AA构成，分子量为44～48 kDa[3]。
, http://www.100md.com
近几年，HCV的基因克隆和序列测定进展很快，仅在GenBank中可查到的HCV基因组全序列就达10个。其中Moormann等测定了C株细胞毒的基因组全序列并构建了其全长的cDNA克隆，在体外可转录为感染性RNA[4]。我国近几年在HCV的基因克隆和序列分析方面也取得了较大进展，已经克隆了HCV石门系强毒株部分5′端非编码区、E2基因及兔化弱毒株(细胞毒)的E2基因等，并对它们进行了序列分析，但未见到有关兔化弱毒株组织毒的基因克隆和序列分析的报道[5，6]。
本研究利用RT-PCR技术首次扩增了我国HCLV细胞毒E0基因，对其进行了克隆和序列分析，并与Moormann等测定的C株序列进行了比较。这将为进一步研究E0的功能打下基础，也可能为猪瘟的防治提供新的途径。
1 材料和方法
1.1 病毒的增殖及RNA的提取[7]
, http://www.100md.com
HCLV 479代冻干毒引自中国兽药监察所，在健康家兔体内增殖，采取呈定型热反应家兔的脾脏，用异硫氰酸胍一步法提取其总RNA(采用BRL公司TRIZOL试剂盒)，琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，Gene Quant (Pharmacia公司)测定其纯度和浓度。
1.2 引物的设计与合成
根据HCV C株的序列设计合成两对引物[4]，引物的序列及在基因组中的位置分别为：
PA：5′ACTATGG↓AACCACCAGAATCTAGGAAG 3′(正链，1075～1095，划线部分为另加的起始密码子等)
PB：5′GTGTTTTTGGGGAGGCAAGC 3′(负链，1941～1922)
, http://www.100md.com Pa：5′AAAGCCCTATTGGCATGGG 3′(正链，1108～1126)
Pb:5′ GGTGCAGTTGTTAGTGTACC 3′(负链，1918～1897)
1.3 RT-PCR
取上面提取的RNA 10μg，加引物PB 1μL(200ng/μL)，65℃ 5min,立即冰浴5min;然后依次加入5×RT buffer 4μL,dNTP(10mmol/L)1μL,AMV(10u/μL)1μL，RNasin(40u/μL) 1μL，加水补充至20μL，42℃ 1h。
取反转录产物5μL,加引物PA、PB各1μL(200ng/μL),10×PCR buffer 5μL, 2.5mmol/L MgCl2 5μL (25mmol/L)，dNTP(10mmol/L)1μL，加水至49μL;然后98℃ 8min,加Taq DNA聚合酶1μL(1u/μL,Promega公司)，以95℃ 50s，48℃ 1min,72℃ 2min，于Bio Techs-97 DNA Themocycler (Beijing Biotechs Co Ltd)进行循环反应。取PCR产物1μL 50倍稀释，取5μL作为模板，以Pa、Pb为引物，与上面相同条件进行PCR。
, http://www.100md.com
1.4 PCR产物的克隆与序列测定
用Agarose Gel DNA Extraction kit (Boehringer Mannheim公司)纯化PCR产物，然后采用pGEM-T载体(Promega公司)进行克隆(按操作说明书进行)。克隆后用ABI PRISM 377 DNA Sequencer对扩增片段进行序列测定。
2 结果与讨论
按照要求HCLV需要来自组织毒，但组织毒不易纯化，又因为其含HCLV量较低，单独一次PCR均不能成功扩增出特异性片段。有时竟扩增出与预计大小相符的片段，但经测序证明为非特异性插入。扩增HCLV基因组其它区域，也遇到了同样的问题。后来采用套式PCR才成功扩增出了与预计大小(803 bp)相符的片段，即E0基因(电泳图略)。
将扩增的片段克隆到pGEM-T载体中，然后采用全自动序列分析仪对插入片段进行序列测定，结果见图1。将所测定的序列与Moormann等测得的C株序列进行比较(见图2和图3)，其同源性达99.08%(762个碱基中共有7个不同)，推导的氨基酸序列同源性为98.42%(253个氨基酸中共有4个差异)，这种差异的产生可能由HCLV的来源不同而引起(据与Moormann等所在实验室了解，其C株来自台湾)。
, 百拇医药
图1 猪瘟病毒兔化弱毒株E0基因的核苷酸及推导的氨基酸序列
Fig.1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of E0 gene of hog cholera virus strain C
图2 不同来源E0基因序列的比较
E0来自本实验，CE0来自Moormaan等测得的C株序列。
Fig.2 Sequence comparison of E0 gene from different sources
, 百拇医药
E0 was from our lab,CE0 was sequenced by Moormann et al.
图3 不同来源HCV C株E0序列的比较
Fig.3 Sequnece comparison of E0 from different sources of HCV strain C
E0是唯一可分泌到HCV侵染的细胞培养上清液中的糖蛋白，具有产生中和抗体的能力[8]。进一步研究发现，从HCV感染的细胞中分离纯化的E0和杆状病毒载体表达的E0蛋白均具有RNase活性，而这种RNase活性在HCV的复制过程中起着重要的作用，并且有可能是HCV在其自然宿主持续存在的原因[9]。HCLV E0基因的成功克隆将对我们进一步研究E0的功能及如何利用该基因在猪瘟的防治中发挥作用打下了基础。
, 百拇医药
* 国家攀登计划B类项目资助课题
参考文献
[1] Meyers G, Rumenapf T, Thiel H J. Molecular cloning and nucleotide sequence of the genome of hog cholera virus. Virology, 1989,171:555～567
[2] Moormann R J M, Warmerdam P A M, Meer B V D et al. Molecular cloning and nucleotide sequence of hog cholera virus strain Brescia and mapping of the genome region encoding envelope protein E1. Virology, 1990,177:184～198
, 百拇医药
[3] Stark R, Rumenapf G, Meyers et al. Genomic localization of hog cholera virus glycoproteins. Virology, 1990,174:286～289
[4] Moormann R J, van Gennip H G, Miedema G K et al. Infectious RNA transcribed from an engineered full-length cDNA template of the genome of a pestivirus. J Virol, 1996,70:763～770
[5] 涂长春，李红卫，金扩世等. 猪瘟病毒石门株特异cDNA片段的扩增与序列分析. 病毒学报，1994，10(1)：33～38
[6] 李红卫，涂长春，金扩世等. 猪瘟病毒石门株与兔化弱毒株主要保护性抗原E2基因的序列测定. 畜禽重大疫病免疫防治研究进展(谢庆阁等主编)，中国农业科技出版社，1997，22～26
, 百拇医药
[7] Chomezynski P, Piotr, Nicoletta S. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenolchloroform extraction. Analytical Biochemistry, 1987,162:156～159
[8] Weiland E, Ahl R, Stark R et al. A second envelope glycoprotein mediates neutralization a pestivirus, hog cholera virus. J Virol, 1992,66:3677～3682
[9] Hulst MM, Panoto FE, Hoekman A et al. Inactivation of the RNase activity of glyoprotein E (rns) of classical swine fever virus results in a cytopathogenic virus. J Virol, 1998,72:151～157
收稿日期：1998-05-04，修回日期：1998-10-26, 百拇医药