广州地区非甲-戊型肝炎血清中庚型肝炎病毒核酸检测
作者：唐漾波 刘国莲 李涤蓉 魏绍静 吴婉芬 冼超
单位：510060 广州市第八人民医院传染病研究所
关键词：
中华传染病杂志/990215 1995年，美国相继报道[1-3]了两个新发现的与人类肝炎相关的RNA病毒基因组，分别称为GBV-C和HGV，并指出其可能是非甲-戊型肝炎(HNA-E)的致病因子。由于GBV-C和HGV的基因组序列具有较高的同源性，因此目前认为它们属同一病毒的不同基因型，GBV-C为非洲的基因型，HGV为美国的基因型，我国称为庚型肝炎病毒(HGV)。为了解广州地区HNA-E中HGV的感染情况及基因型特点，我们对56例HNA-E患者血清进行了HGV RNA检测，并对其中2例HGV的部分核苷酸进行了测序分析，此外，还对77例急慢性乙型肝炎(HB)和118例急慢性丙型肝炎(HC)中HGV的感染情况进行了研究。
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材料和方法
一、研究对象
共251例急、慢性肝炎病例，均为我院1995～1997年期间的住院及门诊患者，按1995年第五次全国传染病与寄生虫学术会议修订的病毒性肝炎诊断标准，其中HNA-E56例，男41例，女15例；平均年龄42岁(4～75岁)。经检测其抗-HAV-IgM、HBV DNA、HBsAg、HCV RNA、抗-HCV、HDAg、抗-HDV、抗-HEV均为阴性；急、慢性HB77例，男67例，女10例；平均年龄37岁(15～76岁)。经检测其HBV DNA及HBsAg阳性，抗-HAV-IgM、HCV RNA、抗-HCV、HDAg、抗-HDV、抗-HEV均为阴性；急、慢性HC118例，男74例，女44例；平均年龄40岁(3～84岁)。经检测其HCV RNA及抗-HCV阳性，抗-HAV-IgM、HBV DNA、HBsAg、HDAg、抗-HDV、抗-HEV均为阴性。以上抗-HAV、HBsAg、抗-HCV、HDAg、抗-HDV、抗-HEV均采用EIA方法，HBV DNA及HCV RNA检测分别采用聚合酶链反应(PCR)及逆转录-套式-聚合酶链反应(RT-nested-PCR)方法。
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二、研究方法
(一)HGV RNA检测 1.提取血清中HGV RNA：血清100μl溶于300μl变性溶液[4]中，充分混匀后，冰浴30分钟，依次加入2mol/L NaAc 50μl,酚500μl，氯仿与异戊醇混合液(24∶1)100μl，混匀后静置5分钟，12 000r/min 4°C离心10分钟，取上清液加入等量的异丙醇-20°C过夜后，12 000r/min 4°C离心15分钟，真空抽干，加入含0.5U/μl RNasin的无菌水38μl，反复指弹使之溶解。2.逆转录及PCR：两对nested-PCR引物选自报道的GBV-C[2]和HGV[3]全基因序列的非编码区中两者的共同序列，以下为引物序列及扩增产物在HGV基因组[3]中的位置：外正链5′-CCGA-CGCCTATCTAAGTAGA-3′，外负链5′-GCCTATTGGTCAAGAGAGAC-3′(52-370nts)；内正链5′-AAGGTGGTGGATGGGTGATG-3′，内负链5′-TGAAGGGCGACGTGGACCGT-3′(107～348nts)。在上述RNA提取管内加入10×PCR缓冲液、4×10mmol/L dNTP、一对外引物、AMV逆转录酶及Taq DNA聚合酶，混匀，石蜡油封顶，42°C 30分钟逆转录，预变性94°C 3分钟，进行第一次PCR循环，循环参数为94°C 60秒，50°C 60秒，72°C 60秒，共35个循环，最后延伸5分钟。于离心管中加入10×PCR缓冲液、4×10mmol/L dNTP、一对内引物、Taq DNA聚合酶及第1次PCR产物，混匀，石蜡油封顶，预变性94°C 3分钟，进行第2次PCR循环，循环参数同第1次PCR。3.产物检测：取第2次PCR产物10μl进行2.0%琼脂糖凝胶(含EB 0.5μg/μl)电泳，紫外检测仪下观测结果，于242bp处发现特异性荧光条带为阳性，否则为阴性，用100bp DNA Ladder作为DNA分子量标记，检测过程中采用已知HGV RNA阴性和阳性血清作为阴阳性对照。
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(二)核苷酸序列测定 采用荧光标记的双脱氧链末端终止法对HNA-E中2例HGV RNA阳性血清的第2次PCR产物进行直接测序，使用仪器为PE ABIPRISMTM 310Genetic Analyzer。2株核苷酸序列分别命名为HGV-GZ1和HGV-GZ2。
结果
一、HGV RNA检测结果
从251例急、慢性肝炎患者血清中共检出25例HGV RNA阳性，总阳性率为9.96%，其中56例HNA-E中检出4例阳性(7.14%)，77例HB中检出8例阳性(10.39%)，118例HC中检出13例阳性(11.17%)。
二、序列测定结果
HGV非编码区部分核苷酸测序结果表明，广州株HGV-GZ1和HGV-GZ2株核苷酸之间的同源性为98.0%，与美国株HGV[3]的同源性均为91.1%，与非洲株GBV-C[2]的同源性分别为81.7%和84.2%，而美国株与非洲株在相应区域的同源性为81.7%；此外，HGV-GZ1株在HGV序列[3]的155位与156位之间有一个胞嘧啶的插入突变。
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讨论
Linnen等[3]研究表明在HNA-E中8.33%存在HGV感染，国内常锦红等[5]从35例HNA-E中仅检出1例阳性(2.9%)。我们的结果56例HNA-E中检出4例HGV RNA阳性，阳性率为7.14%，与美国的结果较接近，表明HGV为HNA-E的病原之一。目前普遍认为HGV经肠道外途径传播，因而在接受输血和血制品者及静脉吸毒者中感染情况较严重。我们检出的4例阳性病例的临床表现各异，分别表现为急性或不同程度的慢性肝炎，其中3例有外科手术史，术中输血情况不详(其中1例曾被临床上怀疑为乳癌术后化疗药物引起的药物性肝炎)，另外1例无可疑感染病史，说明尚存在感染原因不明的HGV感染病例。因此，对于临床上HNA-E病例，包括怀疑为非病毒因素引起的肝炎病例，应进行HGV RNA检测。
目前已发现HGV与HBV及HCV合并感染的情况较严重，我们的结果显示HGV/HBV合并感染率与HGV/HCV合并感染率相近，均高于HNA-E中的HGV的感染率，可能与HBV、HCV及HGV感染途径类似，使得合并感染的可能性增大有关。此外，本组中有10例为静脉吸毒者，其中HNA-E 1例，HB 2例，HC 7例，除1例HB患者临床表现为慢性重型肝炎外，其余均为急性黄疸型肝炎，此10例吸毒者中检出2例HGV RNA阳性(20%)，均为HC患者，说明可通过静脉吸毒传播HGV。
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HGV非编码区部分核苷酸测序结果表明2株广州HGV-GZ1和HGV-GZ2可能为同一基因型，它们与Linnen等[3]报道的美国株HGV具有较高的同源性；有资料显示HGV5′端较为保守的非编码区的核苷酸的插入或缺失突变，可引起多聚蛋白读码框架转换，我们HGV-GZ1株的155位与156位之间的胞嘧啶的插入突变对其的影响尚不清楚，需进一步实验证实。
本课题由广州市医药卫生青年科研计划赞助
参考文献
1 Simons JN,Leary TP,Dawson GJ,et al.Isolation of novel virus-like sequences associated with human hepatitis.Nature Medicine,1995,1:564-569.
2 Leary TP,Muerhoff AS,Simons JN,et al.Sequence and genomic organization of GBV-C:a novel member of the flaviviridae associated with human non-A-E hepatitis.J Med Virol,1996,48:60-67.
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3 Linnen J,Wages J,Zhang-keck ZY,et al.Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus:a transfusion-transmissibleagent.Science,1996,271:505-508.
4 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acidguani-dinium thiocyanate-phenol-chloroform ex-
traction.Ann Biochem,1987,162:156-159.
5 常锦红，魏来，杜绍财，等.慢性非甲-戊型肝炎血清中庚型肝炎病毒核酸的检测及部分核苷酸序列分析.中华肝脏病杂志，1997，5：8-11.
收稿：1997-10-07 修回：1998-05-25, http://www.100md.com
单位：510060 广州市第八人民医院传染病研究所
关键词：
中华传染病杂志/990215 1995年，美国相继报道[1-3]了两个新发现的与人类肝炎相关的RNA病毒基因组，分别称为GBV-C和HGV，并指出其可能是非甲-戊型肝炎(HNA-E)的致病因子。由于GBV-C和HGV的基因组序列具有较高的同源性，因此目前认为它们属同一病毒的不同基因型，GBV-C为非洲的基因型，HGV为美国的基因型，我国称为庚型肝炎病毒(HGV)。为了解广州地区HNA-E中HGV的感染情况及基因型特点，我们对56例HNA-E患者血清进行了HGV RNA检测，并对其中2例HGV的部分核苷酸进行了测序分析，此外，还对77例急慢性乙型肝炎(HB)和118例急慢性丙型肝炎(HC)中HGV的感染情况进行了研究。
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材料和方法
一、研究对象
共251例急、慢性肝炎病例，均为我院1995～1997年期间的住院及门诊患者，按1995年第五次全国传染病与寄生虫学术会议修订的病毒性肝炎诊断标准，其中HNA-E56例，男41例，女15例；平均年龄42岁(4～75岁)。经检测其抗-HAV-IgM、HBV DNA、HBsAg、HCV RNA、抗-HCV、HDAg、抗-HDV、抗-HEV均为阴性；急、慢性HB77例，男67例，女10例；平均年龄37岁(15～76岁)。经检测其HBV DNA及HBsAg阳性，抗-HAV-IgM、HCV RNA、抗-HCV、HDAg、抗-HDV、抗-HEV均为阴性；急、慢性HC118例，男74例，女44例；平均年龄40岁(3～84岁)。经检测其HCV RNA及抗-HCV阳性，抗-HAV-IgM、HBV DNA、HBsAg、HDAg、抗-HDV、抗-HEV均为阴性。以上抗-HAV、HBsAg、抗-HCV、HDAg、抗-HDV、抗-HEV均采用EIA方法，HBV DNA及HCV RNA检测分别采用聚合酶链反应(PCR)及逆转录-套式-聚合酶链反应(RT-nested-PCR)方法。
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二、研究方法
(一)HGV RNA检测 1.提取血清中HGV RNA：血清100μl溶于300μl变性溶液[4]中，充分混匀后，冰浴30分钟，依次加入2mol/L NaAc 50μl,酚500μl，氯仿与异戊醇混合液(24∶1)100μl，混匀后静置5分钟，12 000r/min 4°C离心10分钟，取上清液加入等量的异丙醇-20°C过夜后，12 000r/min 4°C离心15分钟，真空抽干，加入含0.5U/μl RNasin的无菌水38μl，反复指弹使之溶解。2.逆转录及PCR：两对nested-PCR引物选自报道的GBV-C[2]和HGV[3]全基因序列的非编码区中两者的共同序列，以下为引物序列及扩增产物在HGV基因组[3]中的位置：外正链5′-CCGA-CGCCTATCTAAGTAGA-3′，外负链5′-GCCTATTGGTCAAGAGAGAC-3′(52-370nts)；内正链5′-AAGGTGGTGGATGGGTGATG-3′，内负链5′-TGAAGGGCGACGTGGACCGT-3′(107～348nts)。在上述RNA提取管内加入10×PCR缓冲液、4×10mmol/L dNTP、一对外引物、AMV逆转录酶及Taq DNA聚合酶，混匀，石蜡油封顶，42°C 30分钟逆转录，预变性94°C 3分钟，进行第一次PCR循环，循环参数为94°C 60秒，50°C 60秒，72°C 60秒，共35个循环，最后延伸5分钟。于离心管中加入10×PCR缓冲液、4×10mmol/L dNTP、一对内引物、Taq DNA聚合酶及第1次PCR产物，混匀，石蜡油封顶，预变性94°C 3分钟，进行第2次PCR循环，循环参数同第1次PCR。3.产物检测：取第2次PCR产物10μl进行2.0%琼脂糖凝胶(含EB 0.5μg/μl)电泳，紫外检测仪下观测结果，于242bp处发现特异性荧光条带为阳性，否则为阴性，用100bp DNA Ladder作为DNA分子量标记，检测过程中采用已知HGV RNA阴性和阳性血清作为阴阳性对照。
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(二)核苷酸序列测定 采用荧光标记的双脱氧链末端终止法对HNA-E中2例HGV RNA阳性血清的第2次PCR产物进行直接测序，使用仪器为PE ABIPRISMTM 310Genetic Analyzer。2株核苷酸序列分别命名为HGV-GZ1和HGV-GZ2。
结果
一、HGV RNA检测结果
从251例急、慢性肝炎患者血清中共检出25例HGV RNA阳性，总阳性率为9.96%，其中56例HNA-E中检出4例阳性(7.14%)，77例HB中检出8例阳性(10.39%)，118例HC中检出13例阳性(11.17%)。
二、序列测定结果
HGV非编码区部分核苷酸测序结果表明，广州株HGV-GZ1和HGV-GZ2株核苷酸之间的同源性为98.0%，与美国株HGV[3]的同源性均为91.1%，与非洲株GBV-C[2]的同源性分别为81.7%和84.2%，而美国株与非洲株在相应区域的同源性为81.7%；此外，HGV-GZ1株在HGV序列[3]的155位与156位之间有一个胞嘧啶的插入突变。
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讨论
Linnen等[3]研究表明在HNA-E中8.33%存在HGV感染，国内常锦红等[5]从35例HNA-E中仅检出1例阳性(2.9%)。我们的结果56例HNA-E中检出4例HGV RNA阳性，阳性率为7.14%，与美国的结果较接近，表明HGV为HNA-E的病原之一。目前普遍认为HGV经肠道外途径传播，因而在接受输血和血制品者及静脉吸毒者中感染情况较严重。我们检出的4例阳性病例的临床表现各异，分别表现为急性或不同程度的慢性肝炎，其中3例有外科手术史，术中输血情况不详(其中1例曾被临床上怀疑为乳癌术后化疗药物引起的药物性肝炎)，另外1例无可疑感染病史，说明尚存在感染原因不明的HGV感染病例。因此，对于临床上HNA-E病例，包括怀疑为非病毒因素引起的肝炎病例，应进行HGV RNA检测。
目前已发现HGV与HBV及HCV合并感染的情况较严重，我们的结果显示HGV/HBV合并感染率与HGV/HCV合并感染率相近，均高于HNA-E中的HGV的感染率，可能与HBV、HCV及HGV感染途径类似，使得合并感染的可能性增大有关。此外，本组中有10例为静脉吸毒者，其中HNA-E 1例，HB 2例，HC 7例，除1例HB患者临床表现为慢性重型肝炎外，其余均为急性黄疸型肝炎，此10例吸毒者中检出2例HGV RNA阳性(20%)，均为HC患者，说明可通过静脉吸毒传播HGV。
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HGV非编码区部分核苷酸测序结果表明2株广州HGV-GZ1和HGV-GZ2可能为同一基因型，它们与Linnen等[3]报道的美国株HGV具有较高的同源性；有资料显示HGV5′端较为保守的非编码区的核苷酸的插入或缺失突变，可引起多聚蛋白读码框架转换，我们HGV-GZ1株的155位与156位之间的胞嘧啶的插入突变对其的影响尚不清楚，需进一步实验证实。
本课题由广州市医药卫生青年科研计划赞助
参考文献
1 Simons JN,Leary TP,Dawson GJ,et al.Isolation of novel virus-like sequences associated with human hepatitis.Nature Medicine,1995,1:564-569.
2 Leary TP,Muerhoff AS,Simons JN,et al.Sequence and genomic organization of GBV-C:a novel member of the flaviviridae associated with human non-A-E hepatitis.J Med Virol,1996,48:60-67.
, http://www.100md.com
3 Linnen J,Wages J,Zhang-keck ZY,et al.Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus:a transfusion-transmissibleagent.Science,1996,271:505-508.
4 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acidguani-dinium thiocyanate-phenol-chloroform ex-
traction.Ann Biochem,1987,162:156-159.
5 常锦红，魏来，杜绍财，等.慢性非甲-戊型肝炎血清中庚型肝炎病毒核酸的检测及部分核苷酸序列分析.中华肝脏病杂志，1997，5：8-11.
收稿：1997-10-07 修回：1998-05-25, http://www.100md.com