HBcAg DNA疫苗诱导小鼠(H2b)特异性细胞和体液免疫应答
作者：黄祖瑚 卢山 刘宁 王世霞
单位：210029 南京医科大学第一附属医院传染病科(黄祖瑚、刘宁)；美国马萨诸塞大学医学中心(卢山、王世霞)
关键词：肝炎核心抗原，乙型；DNA疫苗；小鼠
中华传染病杂志/990210 摘要 目的 观察HBcAg DNA疫苗(pJW4303/HBc)免疫C57BL/6小鼠(H-2b)的特异性细胞和体液免疫应答。方法 基因枪和肌肉注射两种方法接种DNA疫苗；ELISA法检测小鼠血清抗-HBc(IgG)及IgG亚类(IgG1,IgG2a)；51铬释放法检测小鼠脾细胞HBcAg特异性CTL活性。结果 该DNA疫苗体外可表达HBcAg；小鼠经基因枪或肌肉注射接种该疫苗后血清抗-HBc滴度分别达1∶328 050和1∶109 350；肌肉注射组抗-HBc亚类以IgG2a为主；两种方法接种小鼠的特异性CTL杀伤率分别达53.1%和52.8%。结论 HBcAg DNA疫苗在H-2b小鼠实验中表现出良好的细胞免疫和体液免疫原性。
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Specific cellular and humoral immune responses in H-2b mice
induced by DNA immunization of HBV core gene
HUANG Zuhu,LU Shan, LIU Ning,et al. The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029
Abstract Objective To observe the specific cellular and humoral immune responses in H-2b mice after DNA immunization of HBV core gene.Methods The DNA vaccine(pJW4303/HBc) was constructed by inserting HBV core gene fragment into the reading frame of plasmid pJW4303.The immunization was performed by gene gun and intramuscular injection in this experiment.Anti-HBc(IgG)and its subtypes(IgG1,IgG2a)in mice sera were detected by ELISA.HBcAg specific cytotoxic T lymphocyte (CTL) activity was measured by 51 Chromium release assay.Results The expression of HBcAg was demonstrated by ELISA and Western-blot in 293T cells transfected with pJW4303/HBc.The end-point titers of serum anti-HBc in immunized mice were 1∶328 050 (gene gun method) and 1∶109 350 (intramuscular method).In both groups of gene gun and intramuscular immunization,IgG2a level was sightly higher than that of IgG1.HBcAg specific CTL activities were 53.1% in gene gun group and 52.85%in intramuscular group.ConclusionThe results showed that the DNA vaccine of pJW4303/HBc had strong antigenecity in both cellular and humoral immunity.
, 百拇医药
Key words Hepatitis B core antigen DNA vaccine Mice
DNA疫苗(基因疫苗)是近几年免疫学和分子生物学研究的新兴领域，被称之为疫苗的“第三次革命”。DNA疫苗的显著特点之一是目的基因进入机体后的表达产物系内源性抗原，主要通过MHC-Ⅰ类途径激发机体的免疫应答，其中特异性CTL应答尤为突出[1]。大量资料表明，慢性乙型肝炎患者和乙型肝炎病毒(HBV)慢性携带者体内针对HBV的特异性CTL应答明显低下，纠正这种CTL低反应状态，对于机体有效地清除HBV至关重要[2]。鉴于HBV核心区基因产物HBcAg是机体CTL的主要靶抗原，我们构建了HBcAg DNA疫苗，并观察了该DNA疫苗经基因枪和肌肉注射法接种后H-2b小鼠的特异性细胞和体液免疫应答。
材料与方法
一、HBcAg DNA疫苗的构建
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将经过5′端修饰的HBV核心区基因片段[3](购自中国预防医学科学院病毒研究所)插入质粒pUC18(Promega)的PstI和BamH1酶切位点，克隆成功后，再将该重组质粒中含HBV核心区基因片段的Hind III和BamH1酶切片段定向克隆进质粒pJW4303(系真核表达质粒，含CMV即刻早期启动子，由美国马萨诸塞大学医学中心HL Robinson教授惠赠)的相应克隆位点。该重组质粒即为HBcAg DNA疫苗，命名为pJW4303/HBc。
二、pJW4303/HBc体外表达产物的鉴定
分别取纯化的pJW4303/HBc和pJW4303(无目的基因的对照质粒)约20μg，用磷酸钙法转染293T细胞(一种用于瞬间转染的人胚肾细胞系)，72小时后收集并裂解细胞，低温下离心取上清。该细胞裂解产物经间接ELISA法检出HBcAg,经Western-blot证实在21Kd处有一清晰蛋白质条带，与HBcAg分子量相符；对照质粒的转染细胞裂解产物未检出HBcAg。
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三、pJW4303/HBc和pJW4303的大量制备
采用QIAGEN Plasmid Purification(Giga)Kit(GIAGEN Inc.,Germany)。每2000mlHB101转化株菌液可获高纯度质粒约10mg。
四、小鼠来源、分组及血清标本采集
6～8周龄雌性C57BL/6(H2b)小鼠由美国马萨诸塞大学医学中心动物实验中心提供。共设4组，每组5只小鼠，耳洞法编号。组别为pJW4303/HBc基因枪组、pJW4303基因枪组、pJW4303/HBc肌内注射组及pJW4303肌内注射组。采用毛细吸管眼静脉采血法采集小鼠血清，-70°C冻存。
五、免疫方法及免疫程序
(一)基因枪法 基因枪为Agrecetus Inc.(U.S.A)产品，系高压氦气驱动类型。按2μm质粒DNA∶1mg金颗粒(1μg,BIORAD)的比例分别制备含pJW4303和pJW4303/HBc的基因枪专用细管状子弹。每粒子弹含质粒DNA 1μg。每只小鼠每次在腹部皮肤6处不同部位接受注射，基因枪所用压力为400psi，接种剂量为6μg质粒DNA/次小鼠。根据文献报道，未设单纯金颗粒对照组[4]。
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(二)肌内注射法 取相应质粒DNA 100μg，以无菌生理盐水稀释至100μl。每只小鼠每次在其两后肢四头肌处各注射50μl，故接种剂量为100μg/次小鼠。
(三)免疫程序 为0周、第4和第8周。每次免疫时接种方法及剂量相同。每次免疫前及第10周时采集小鼠血清。
六、抗HBcIgG及IgG亚类检测
(一) 抗-HBc-IgG检测 以重组HBcAg(南京军区医学研究所张林元研究员惠赠)0.1μg/100μl孔包被96孔ELISA板(Corning)。待测小鼠血清作系列3倍稀释(1∶50，1∶150，1∶450……1∶8857350)。以生物素化羊抗鼠IgG和亲和素偶联HRP(Vector Laboratory Inc.)检测小鼠血清中抗HBc终点滴度。抗HBc高滴度血清采用CORZYME试剂盒(Abbott)作抗HBc定量测定，并转换成PEI(Paul Ehrlich Institute)单位。
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(二) 抗HBcIgG亚类检测 以小鼠IgG1，IgG2a标准品、HRP标记的羊抗鼠IgG1或IgG2a(Southern Biotechnology Associates,Inc.)为主要试剂，分别检测单个小鼠血清中抗HBcIgG1和IgG2a水平，根据A(450nm)值计算IgG2a/IgG1比值。
七、特异性CTL功能测定
pJW4303/HBc或pJW4303末次免疫4周(即第12周)时，在麻醉状态、无菌条件下取小鼠脾脏，制备单个细胞悬液，分别用或不用H-2b小鼠限制性HBcAg特异性CTL表位多肽[5](序列为MGLKFRQL，终浓度为10μg/ml)作体外刺激，37°C培养6天。继以EL4细胞为靶细胞(用或不用上述多肽进行过夜孵育)作51Cr释放试验(4小时孵育法)，测定HBcAg特异性CTL杀伤活性，效应细胞：靶细胞范围为12∶1～0.5∶1。
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特异性CTL杀伤率(%)=[(实验孔Cr释放值-自然Cr释放值)/(最大Cr释放值-自然Cr释放值)]×100。
结果
一、各组小鼠血清抗HBc终点滴度
见表1。接种pJW4303/HBc后小鼠产生了较高滴度的抗HBc。基因枪组的终点滴度3倍于肌内注射组。经定量检测，终点滴度达1∶109 350及以上的血清标本中，抗HBc含量均大于900PEI单位。pJW4303接种后小鼠仅有低滴度非特异性抗体反应(≤1∶450)。
二、单个小鼠血清抗HBc终点滴度的比较
见图1。基因枪组各小鼠血清抗HBc的滴度
表1 各组小组血清抗HBc的终点滴度 组 别
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采 样 时 间
0周
4周
8周
10周
pJW4303基因枪组
50
150
450
450
pJW4303/HBc基因枪组
50
4050
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109350
328050
pJW4303肌内注射组
50
150
150
450
pJW4303/HBc肌内注射组
50
4050
36450
109350
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图1 个体小鼠血清抗HBc终点滴度
高且均衡，4/5达1∶328 050;而肌内注射组的抗体滴度则普遍降低3倍，最低者仅1∶4 050。
三、单个小鼠血清抗HBc亚类比值
见表2。除基因枪组第5号小鼠外，两组其余小鼠的抗HBcIgG2a/IgG1比值均大于1，提示以IgG2a为主。比较两组的平均IgC2a/IgG1比值，肌内注射组显著高于基因枪组(P<0.05)。
表2 个体小鼠血清抗HBcIgG亚类比值(IgG2a/IgG1) 组 别
小 鼠 序 号
1
2
, 百拇医药
3
4
5
±s
pJW4303/HBc
基因枪组
1.22*
1.20
2.92
1.51
0.89
1.55
, 百拇医药
0.80
pJW4303/HBc
肌内注射组
14.42
10.38
12.36
45.95
12.56
19.13
15.06
*表中数值为ELISA(A450nm)测定之IgG2a/IgG1比值
注：两组相比差异有显著性，P<0.05
, 百拇医药
四、小鼠脾细胞HBcAg特异性CTL杀伤活性
见图2。
图2 小鼠脾细胞HBcAg特异性CTL杀伤活性
pJW4303/HBc两组小鼠均产生了较强的CTL杀伤活性(杀伤率大于50%)；基因枪组又稍优于肌内注射组。对照质粒pJW4303接种后，基因枪组几乎测不出CTL活性，肌肉注射组则有低水平非特异性反应。
讨论
DNA疫苗作为一种全新的高效免疫方法，已在许多难治性感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病和肿瘤性疾病的预防及治疗领域显示出诱人的应用前景[1]。DNA疫苗可刺激机体特异性CTL功能的特性给HBV慢性持续感染的治疗带来新的希望。Kuhober和Geissler等[6,7]作了HBcAg DNA疫苗肌内注射法免疫小鼠的初步观察。本实验同时采用基因枪和肌内注射方法，观察了自行构建的HBcAg DNA疫苗接种后H-2b小鼠的特异性免疫应答。
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就特异性体液免疫反应而言，基因枪组和肌肉注射组小鼠在接种pJW4303/HBc后，抗HBc终点滴度均达1∶10万以上，经定量检测，两组小鼠血清抗HBc含量均大于900PEI单位。Geissler等[7]将其构建的HBcAg DNA疫苗用肌内注射法接种小鼠，其血清抗HBc含量仅为5～6PEI单位。我们推测本研究所以获得高滴度的抗HBc反应，可能是由于1.所采用的HBV核心区基因片断经5′端修饰而具高效表达能力[3]；2.所选用的载体质粒pJW4303是一种哺乳动物细胞高效表达载体[8]；3. 没有采用预先注射肌肉坏死剂的方法，避免了局部炎症对免疫应答的干扰； 4. 3次免疫之间的间隔为4周，使免疫应答更为充分。
一般认为，机体的Th1型免疫反应可促进病原体的清除，而Th2型免疫反应则可加重机体的病理损害[9]。Feltquate等[10]发现，DNA疫苗经基因枪法接种后宿主以Th2型(IgG1为主)反应多见，而经肌内注射法接种后则Th1型(IgG2a为主)反应多见。本实验结果与以上报告有同有异。同者是肌肉注射法接种后表现为IgG2a占绝对优势，为典型的Th1型反应；异者是本实验中基因枪法接种后亦以IgG2a占优势，倾向于Th1型反应。我们认为这种差异可能与DNA疫苗中目的基因及其产物的结构与功能、宿主对其产生的免疫反应不尽相同有关。
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pJW4303/HBc能否诱导小鼠产生良好的特异性CTL活性，这是本研究的核心问题所在。结果表明，该DNA疫苗无论用基因枪法或肌内注射法接种小鼠后，在效应细胞∶靶细胞=12∶1时，小鼠脾细胞的HBcAg特异性CTL杀伤率即达到50%以上，说明该DNA疫苗具有良好的细胞免疫原性，确可刺激宿主产生较强的CTL反应。这一结果为我们进一步探索该DNA疫苗在治疗主要因机体CTL功能低下所致HBV慢性持续感染方面的应用前景奠定了初步的实验研究基础。
本课题受卫生部科学研究基金资助(编号961347)
参考文献
1 Robinson HL, Torres CAT. DNA vaccine. Seminars in Immunology, 1997,9:271-283.
2 Chisari FV, Ferrari C. Hepatitis B virus immunopathogenesis. Ann Rew Immunol, 1995,13;29-60.
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3 叶廷安，詹美云.通过乙型肝炎病毒核心基因5′端的修饰使核心抗原在大肠杆菌中高效表达.病毒学报，1988，4：312-318.
4 Fynan EF, Webster RG, Fuller DH, et al. DNA vaccines:protective immunizations by parenteral, mucosal, and gene-gun inoculations. Proc Natl Acad Sci USA, 1993,90:11478-11482.
5 Kuhober A, Wild J, Pudollek HP, et al. DNA vaccination with plasmid encoding the intracellular (HBcAg) or secreted (HBeAg) form of the core protein of hepatitis B virus primes T cell responses to two overelapping Kb-and Kd-restricted epitopes. International Immunology, 1997,9:1203-1212.
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6 Kuhober A, Pudollek HP, Reifenberg K, et al. DNA immunization induces antibody and cytotoxic T cell responses to hepatitis B core antigen in H-2b mice. J Immunol, 1996,156:3687-3695.
7 Geissler M, Tokushige K, Chante CC, et al. Cellular and humoral immune response to hepatitis B virus structure proteins in mice after DNA-based immunization. Gastroenterology, 1997,112:1307-1320.
8 Yasutomi Y, Robinson HL, Lu S, et al. Simian immunodeficiency virus-specific cytotoxic T-lymphocyte induction through DNA vaccination of rhesus monkeys. J Virol, 1996,70:678-681.
, 百拇医药
9 Heizel F. Thl and Th2 cells in the cure and pathogensis of infectious diseases. Current Opinion in Infectious Diseases, 1995,8:151-155.
10 Feltquate DM, Heaney S, Webster RG, et al. Different TH cell-types and antibody isotypes generated by saline and gene gun DNA immunization. J Immunol, 1997,158:2278-2284.
收稿：1998-10-05 修回：1998-12-26, 百拇医药
单位：210029 南京医科大学第一附属医院传染病科(黄祖瑚、刘宁)；美国马萨诸塞大学医学中心(卢山、王世霞)
关键词：肝炎核心抗原，乙型；DNA疫苗；小鼠
中华传染病杂志/990210 摘要 目的 观察HBcAg DNA疫苗(pJW4303/HBc)免疫C57BL/6小鼠(H-2b)的特异性细胞和体液免疫应答。方法 基因枪和肌肉注射两种方法接种DNA疫苗；ELISA法检测小鼠血清抗-HBc(IgG)及IgG亚类(IgG1,IgG2a)；51铬释放法检测小鼠脾细胞HBcAg特异性CTL活性。结果 该DNA疫苗体外可表达HBcAg；小鼠经基因枪或肌肉注射接种该疫苗后血清抗-HBc滴度分别达1∶328 050和1∶109 350；肌肉注射组抗-HBc亚类以IgG2a为主；两种方法接种小鼠的特异性CTL杀伤率分别达53.1%和52.8%。结论 HBcAg DNA疫苗在H-2b小鼠实验中表现出良好的细胞免疫和体液免疫原性。
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Specific cellular and humoral immune responses in H-2b mice
induced by DNA immunization of HBV core gene
HUANG Zuhu,LU Shan, LIU Ning,et al. The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029
Abstract Objective To observe the specific cellular and humoral immune responses in H-2b mice after DNA immunization of HBV core gene.Methods The DNA vaccine(pJW4303/HBc) was constructed by inserting HBV core gene fragment into the reading frame of plasmid pJW4303.The immunization was performed by gene gun and intramuscular injection in this experiment.Anti-HBc(IgG)and its subtypes(IgG1,IgG2a)in mice sera were detected by ELISA.HBcAg specific cytotoxic T lymphocyte (CTL) activity was measured by 51 Chromium release assay.Results The expression of HBcAg was demonstrated by ELISA and Western-blot in 293T cells transfected with pJW4303/HBc.The end-point titers of serum anti-HBc in immunized mice were 1∶328 050 (gene gun method) and 1∶109 350 (intramuscular method).In both groups of gene gun and intramuscular immunization,IgG2a level was sightly higher than that of IgG1.HBcAg specific CTL activities were 53.1% in gene gun group and 52.85%in intramuscular group.ConclusionThe results showed that the DNA vaccine of pJW4303/HBc had strong antigenecity in both cellular and humoral immunity.
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Key words Hepatitis B core antigen DNA vaccine Mice
DNA疫苗(基因疫苗)是近几年免疫学和分子生物学研究的新兴领域，被称之为疫苗的“第三次革命”。DNA疫苗的显著特点之一是目的基因进入机体后的表达产物系内源性抗原，主要通过MHC-Ⅰ类途径激发机体的免疫应答，其中特异性CTL应答尤为突出[1]。大量资料表明，慢性乙型肝炎患者和乙型肝炎病毒(HBV)慢性携带者体内针对HBV的特异性CTL应答明显低下，纠正这种CTL低反应状态，对于机体有效地清除HBV至关重要[2]。鉴于HBV核心区基因产物HBcAg是机体CTL的主要靶抗原，我们构建了HBcAg DNA疫苗，并观察了该DNA疫苗经基因枪和肌肉注射法接种后H-2b小鼠的特异性细胞和体液免疫应答。
材料与方法
一、HBcAg DNA疫苗的构建
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将经过5′端修饰的HBV核心区基因片段[3](购自中国预防医学科学院病毒研究所)插入质粒pUC18(Promega)的PstI和BamH1酶切位点，克隆成功后，再将该重组质粒中含HBV核心区基因片段的Hind III和BamH1酶切片段定向克隆进质粒pJW4303(系真核表达质粒，含CMV即刻早期启动子，由美国马萨诸塞大学医学中心HL Robinson教授惠赠)的相应克隆位点。该重组质粒即为HBcAg DNA疫苗，命名为pJW4303/HBc。
二、pJW4303/HBc体外表达产物的鉴定
分别取纯化的pJW4303/HBc和pJW4303(无目的基因的对照质粒)约20μg，用磷酸钙法转染293T细胞(一种用于瞬间转染的人胚肾细胞系)，72小时后收集并裂解细胞，低温下离心取上清。该细胞裂解产物经间接ELISA法检出HBcAg,经Western-blot证实在21Kd处有一清晰蛋白质条带，与HBcAg分子量相符；对照质粒的转染细胞裂解产物未检出HBcAg。
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三、pJW4303/HBc和pJW4303的大量制备
采用QIAGEN Plasmid Purification(Giga)Kit(GIAGEN Inc.,Germany)。每2000mlHB101转化株菌液可获高纯度质粒约10mg。
四、小鼠来源、分组及血清标本采集
6～8周龄雌性C57BL/6(H2b)小鼠由美国马萨诸塞大学医学中心动物实验中心提供。共设4组，每组5只小鼠，耳洞法编号。组别为pJW4303/HBc基因枪组、pJW4303基因枪组、pJW4303/HBc肌内注射组及pJW4303肌内注射组。采用毛细吸管眼静脉采血法采集小鼠血清，-70°C冻存。
五、免疫方法及免疫程序
(一)基因枪法 基因枪为Agrecetus Inc.(U.S.A)产品，系高压氦气驱动类型。按2μm质粒DNA∶1mg金颗粒(1μg,BIORAD)的比例分别制备含pJW4303和pJW4303/HBc的基因枪专用细管状子弹。每粒子弹含质粒DNA 1μg。每只小鼠每次在腹部皮肤6处不同部位接受注射，基因枪所用压力为400psi，接种剂量为6μg质粒DNA/次小鼠。根据文献报道，未设单纯金颗粒对照组[4]。
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(二)肌内注射法 取相应质粒DNA 100μg，以无菌生理盐水稀释至100μl。每只小鼠每次在其两后肢四头肌处各注射50μl，故接种剂量为100μg/次小鼠。
(三)免疫程序 为0周、第4和第8周。每次免疫时接种方法及剂量相同。每次免疫前及第10周时采集小鼠血清。
六、抗HBcIgG及IgG亚类检测
(一) 抗-HBc-IgG检测 以重组HBcAg(南京军区医学研究所张林元研究员惠赠)0.1μg/100μl孔包被96孔ELISA板(Corning)。待测小鼠血清作系列3倍稀释(1∶50，1∶150，1∶450……1∶8857350)。以生物素化羊抗鼠IgG和亲和素偶联HRP(Vector Laboratory Inc.)检测小鼠血清中抗HBc终点滴度。抗HBc高滴度血清采用CORZYME试剂盒(Abbott)作抗HBc定量测定，并转换成PEI(Paul Ehrlich Institute)单位。
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(二) 抗HBcIgG亚类检测 以小鼠IgG1，IgG2a标准品、HRP标记的羊抗鼠IgG1或IgG2a(Southern Biotechnology Associates,Inc.)为主要试剂，分别检测单个小鼠血清中抗HBcIgG1和IgG2a水平，根据A(450nm)值计算IgG2a/IgG1比值。
七、特异性CTL功能测定
pJW4303/HBc或pJW4303末次免疫4周(即第12周)时，在麻醉状态、无菌条件下取小鼠脾脏，制备单个细胞悬液，分别用或不用H-2b小鼠限制性HBcAg特异性CTL表位多肽[5](序列为MGLKFRQL，终浓度为10μg/ml)作体外刺激，37°C培养6天。继以EL4细胞为靶细胞(用或不用上述多肽进行过夜孵育)作51Cr释放试验(4小时孵育法)，测定HBcAg特异性CTL杀伤活性，效应细胞：靶细胞范围为12∶1～0.5∶1。
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特异性CTL杀伤率(%)=[(实验孔Cr释放值-自然Cr释放值)/(最大Cr释放值-自然Cr释放值)]×100。
结果
一、各组小鼠血清抗HBc终点滴度
见表1。接种pJW4303/HBc后小鼠产生了较高滴度的抗HBc。基因枪组的终点滴度3倍于肌内注射组。经定量检测，终点滴度达1∶109 350及以上的血清标本中，抗HBc含量均大于900PEI单位。pJW4303接种后小鼠仅有低滴度非特异性抗体反应(≤1∶450)。
二、单个小鼠血清抗HBc终点滴度的比较
见图1。基因枪组各小鼠血清抗HBc的滴度
表1 各组小组血清抗HBc的终点滴度 组 别
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采 样 时 间
0周
4周
8周
10周
pJW4303基因枪组
50
150
450
450
pJW4303/HBc基因枪组
50
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109350
328050
pJW4303肌内注射组
50
150
150
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pJW4303/HBc肌内注射组
50
4050
36450
109350
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图1 个体小鼠血清抗HBc终点滴度
高且均衡，4/5达1∶328 050;而肌内注射组的抗体滴度则普遍降低3倍，最低者仅1∶4 050。
三、单个小鼠血清抗HBc亚类比值
见表2。除基因枪组第5号小鼠外，两组其余小鼠的抗HBcIgG2a/IgG1比值均大于1，提示以IgG2a为主。比较两组的平均IgC2a/IgG1比值，肌内注射组显著高于基因枪组(P<0.05)。
表2 个体小鼠血清抗HBcIgG亚类比值(IgG2a/IgG1) 组 别
小 鼠 序 号
1
2
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3
4
5
±s
pJW4303/HBc
基因枪组
1.22*
1.20
2.92
1.51
0.89
1.55
, 百拇医药
0.80
pJW4303/HBc
肌内注射组
14.42
10.38
12.36
45.95
12.56
19.13
15.06
*表中数值为ELISA(A450nm)测定之IgG2a/IgG1比值
注：两组相比差异有显著性，P<0.05
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四、小鼠脾细胞HBcAg特异性CTL杀伤活性
见图2。
图2 小鼠脾细胞HBcAg特异性CTL杀伤活性
pJW4303/HBc两组小鼠均产生了较强的CTL杀伤活性(杀伤率大于50%)；基因枪组又稍优于肌内注射组。对照质粒pJW4303接种后，基因枪组几乎测不出CTL活性，肌肉注射组则有低水平非特异性反应。
讨论
DNA疫苗作为一种全新的高效免疫方法，已在许多难治性感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病和肿瘤性疾病的预防及治疗领域显示出诱人的应用前景[1]。DNA疫苗可刺激机体特异性CTL功能的特性给HBV慢性持续感染的治疗带来新的希望。Kuhober和Geissler等[6,7]作了HBcAg DNA疫苗肌内注射法免疫小鼠的初步观察。本实验同时采用基因枪和肌内注射方法，观察了自行构建的HBcAg DNA疫苗接种后H-2b小鼠的特异性免疫应答。
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就特异性体液免疫反应而言，基因枪组和肌肉注射组小鼠在接种pJW4303/HBc后，抗HBc终点滴度均达1∶10万以上，经定量检测，两组小鼠血清抗HBc含量均大于900PEI单位。Geissler等[7]将其构建的HBcAg DNA疫苗用肌内注射法接种小鼠，其血清抗HBc含量仅为5～6PEI单位。我们推测本研究所以获得高滴度的抗HBc反应，可能是由于1.所采用的HBV核心区基因片断经5′端修饰而具高效表达能力[3]；2.所选用的载体质粒pJW4303是一种哺乳动物细胞高效表达载体[8]；3. 没有采用预先注射肌肉坏死剂的方法，避免了局部炎症对免疫应答的干扰； 4. 3次免疫之间的间隔为4周，使免疫应答更为充分。
一般认为，机体的Th1型免疫反应可促进病原体的清除，而Th2型免疫反应则可加重机体的病理损害[9]。Feltquate等[10]发现，DNA疫苗经基因枪法接种后宿主以Th2型(IgG1为主)反应多见，而经肌内注射法接种后则Th1型(IgG2a为主)反应多见。本实验结果与以上报告有同有异。同者是肌肉注射法接种后表现为IgG2a占绝对优势，为典型的Th1型反应；异者是本实验中基因枪法接种后亦以IgG2a占优势，倾向于Th1型反应。我们认为这种差异可能与DNA疫苗中目的基因及其产物的结构与功能、宿主对其产生的免疫反应不尽相同有关。
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pJW4303/HBc能否诱导小鼠产生良好的特异性CTL活性，这是本研究的核心问题所在。结果表明，该DNA疫苗无论用基因枪法或肌内注射法接种小鼠后，在效应细胞∶靶细胞=12∶1时，小鼠脾细胞的HBcAg特异性CTL杀伤率即达到50%以上，说明该DNA疫苗具有良好的细胞免疫原性，确可刺激宿主产生较强的CTL反应。这一结果为我们进一步探索该DNA疫苗在治疗主要因机体CTL功能低下所致HBV慢性持续感染方面的应用前景奠定了初步的实验研究基础。
本课题受卫生部科学研究基金资助(编号961347)
参考文献
1 Robinson HL, Torres CAT. DNA vaccine. Seminars in Immunology, 1997,9:271-283.
2 Chisari FV, Ferrari C. Hepatitis B virus immunopathogenesis. Ann Rew Immunol, 1995,13;29-60.
, http://www.100md.com
3 叶廷安，詹美云.通过乙型肝炎病毒核心基因5′端的修饰使核心抗原在大肠杆菌中高效表达.病毒学报，1988，4：312-318.
4 Fynan EF, Webster RG, Fuller DH, et al. DNA vaccines:protective immunizations by parenteral, mucosal, and gene-gun inoculations. Proc Natl Acad Sci USA, 1993,90:11478-11482.
5 Kuhober A, Wild J, Pudollek HP, et al. DNA vaccination with plasmid encoding the intracellular (HBcAg) or secreted (HBeAg) form of the core protein of hepatitis B virus primes T cell responses to two overelapping Kb-and Kd-restricted epitopes. International Immunology, 1997,9:1203-1212.
, http://www.100md.com
6 Kuhober A, Pudollek HP, Reifenberg K, et al. DNA immunization induces antibody and cytotoxic T cell responses to hepatitis B core antigen in H-2b mice. J Immunol, 1996,156:3687-3695.
7 Geissler M, Tokushige K, Chante CC, et al. Cellular and humoral immune response to hepatitis B virus structure proteins in mice after DNA-based immunization. Gastroenterology, 1997,112:1307-1320.
8 Yasutomi Y, Robinson HL, Lu S, et al. Simian immunodeficiency virus-specific cytotoxic T-lymphocyte induction through DNA vaccination of rhesus monkeys. J Virol, 1996,70:678-681.
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9 Heizel F. Thl and Th2 cells in the cure and pathogensis of infectious diseases. Current Opinion in Infectious Diseases, 1995,8:151-155.
10 Feltquate DM, Heaney S, Webster RG, et al. Different TH cell-types and antibody isotypes generated by saline and gene gun DNA immunization. J Immunol, 1997,158:2278-2284.
收稿：1998-10-05 修回：1998-12-26, 百拇医药