一种缓症链球菌毒素蛋白的分离纯化及其致病性的初步研究
作者：卢洪洲 翁心华 尹有宽 石尧忠 陈一平 姜夕南 王华雨 钱开成 朱白
单位：200040 上海医科大学华山医院(卢洪洲、翁心华、尹有宽、石尧忠、陈一平)；江苏省海安县人民医院(姜夕南、王华雨、钱开成、朱白)
关键词：缓症链球菌；链球菌中毒性休克综合征；致热性外毒素
中华传染病杂志/990208 摘要 目的 分离与纯化致中毒性休克综合征缓症链球菌外毒素蛋白，并对其致病性进行初步研究。方法 将分离的缓症链球菌在Bact API 20培养基增菌培养后，所得上清液分别用20%、40%、60%、80%硫酸铵分段盐析，进一步快速蛋白液相色谱系统(FPLC)最终纯化，分别皮下注射新西兰兔观察有否体温升高、耳部及粘膜充血、腹泻等致热性表现。结果 增菌培养上清液20%盐析段蛋白(外毒素)有致热性作用，可复制新西兰兔致热模型。结论 缓症链球菌外毒素蛋白是一种新的链球菌致热性外毒素。
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Isolation and purification of a toxin from
Streptococcus mitis and preliminary study
on its pathogenicity
LU Hongzhou, WENG Xinhua, YIN Youkuan, et al. Huashan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200040
Abstract Objective In order to isolate and purify an exotoxin of Streptococcus mitis which can cause toxic shock syndrome and investigate its pathogenicity. Methods The Streptococcus mitis isolated from patient's throat was shaking cultivated in Bact API 20 culture medium, the supernant fluid of which was precipitated with 20%、40%、60%、80%(NH4)2SO4, respectively. The fast protein liquid chromatography(FPLC) was used for final purification. The finally purified proteins were used to challenge rabbits suboutaneously and the responses of fever, diarrhea and reddening of the ears as well as mucous membranes were monitored.Results 20%(NH4)2SO4 precipitated protein(exotoxin) of culture supernant fluid had a pyrogenic effect on rabbits.Conclusion Streptococcus mitis exotoxin is a novel Streptococcus pyrogenic exotoxin(SPE).
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Key words Streptococcus mitis Streptococcus toxic shock syndrome Pyrogenic exotoxin
1990年冬至1991年春，江苏海安、无锡、如东等长江三角洲地区有数千例猩红热样疾病流行[1-3]，20%表现为中毒性休克综合征(TSS)，但经积极治疗多能很快康复，鲜见死亡。此后每年这个季节均有散发。多数分离菌是从咽拭培养获得，仅少数血液培养阳性。经对病原体进行鉴定、生化试验、动物试验及血清学调查，并结合临床症状和流行病学分析，确定致病菌为缓症链球菌(α溶血性草绿色链球菌)[4]。本试验从病原菌分泌物中提取外毒素，并复制其致热性动物模型，现报道如下。
材料与方法
一、菌体的采集和保存
致病性缓症链球菌(由中国药品生物制品鉴定所最后鉴定，鉴定号SJFS980814)取自疾病爆发流行区患者口咽部，采用标准α溶血性链球菌作为对照(从上海市防疫站购得，菌种号32209,批号：3.5)，并均经真空干燥-20°C低温保存。
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二、仪器、主要试剂及培养基
电泳槽及电泳仪：MiniTRANSBLOT槽、200/2.0型电泳仪、1000×500型电泳仪、3000×电泳仪、微型等电聚集电泳槽(Rotofor cell)均为美国BIORAD公司产品。硫酸铵[(NH4)2SO4]为美国Merck公司产品。FPLC纯化仪(1.00型)，瑞典Pharmacia公司制造。低分子量标准蛋白：中国科学院上海生物化学研究所生产。培养基：为法国生产的BioMero Bact API 20培养基，其成分为：半胱氨酸、胰胨、氯化钠、亚硫酸钠、酚红、蒸馏水，pH7.8。
三、细菌增菌培养上清液及全菌蛋白的制备
离心上清液中不含菌体成分，将真空干燥-20°C低温保存的致病性缓症链球菌菌株，在Bact API 20培养瓶中35°C振荡培养18小时，经3 000r/min离心15分钟，取上清液置4°C冰箱备用(时间不超过7天)。取沉淀菌，用0.05mol/L PBS(pH7.4)洗2次，0.4ml洗涤液悬浮后缓慢加入10%SDS 30μl，边加边轻轻摇动，置55°C 20分钟，将高频超声探头置菌液中进行粉碎(200mA×1/2min)，超声处理时烧杯置于冰浴中。10 000r/min离心15分钟。取上清，测定A 260和A 280,按下公式计算出蛋白含量为5mg/ml∶C(蛋白)=1.45A280-0.74×A260[5]。加入等量灭菌甘油(蛋白浓度即为2.5mg/ml)分装置-20°C保存备用。标准菌株按同样方法培养及离心，取上清液置4°C冰箱备用。
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四、试验动物
新西兰兔36只，雄性，2kg/只，左背部剪毛2cm×2cm，碘酒消毒。随机分为9组，每组4只。
五、上清液所含蛋白的纯化
将所得上清液用硫酸铵分段盐析，沉淀经0.1mol/L磷酸盐缓冲液充分透析，仅20%、40%和80%盐析段有微量蛋白，将三种蛋白经充分透析，各取样品15μl与2倍缓冲液混合，煮沸3分钟，用12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE),各出现一条主要电泳带。再经快速蛋白液相色谱系统(FPLC)最终纯化。
六、毒素蛋白的确定
将纯化的三种蛋白分别皮下注射3组新西兰兔，20%硫酸铵盐析段蛋白可引起致热性表现，局部呈化脓性改变。将此20%盐析段蛋白用SDS-PAGE，据低分子量标准蛋白质算出其相对分子质量为34000。
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结果
一、细菌致病性的动物试验
3组新西兰兔，将上述致病性缓症链球菌10倍浓缩培养上清液0.5ml注射新西兰兔皮内，约15分钟后开始出现体温升高(体温计于注射前1小时插入肛门)，4小时后达峰值，持续约8小时后体温渐下降，体温在峰值期间动物耳部、注射局部及眼睑充血，眼睑并有大量分泌物，有腹泻及后肢无力，食量降低，第4天起体温降至正常，症状亦随之消失，病理见注射局部出现真皮层细胞变性、坏死，并伴炎性细胞重度浸润等化脓性改变。注射上述超声粉碎的等量菌体及10倍浓缩培养基的新西兰兔无此反应，说明致病性由细菌分泌的外毒素引起。
二、毒素蛋白动物试验结果
见图1。取新西兰兔3组，每组分别皮下注射34 000蛋白(0.5mg/ml)0.5ml(含0.25mg)、对照组标准链球菌10倍浓缩上清液0.5ml、培养基10倍浓缩液0.5ml。注射后第1小时每10分钟测一次体温，以后每小时测一次并算出平均体温，并观察眼睑充血程度、注射局部情况及有否腹泻等。所有注射34 000蛋白的4只动物约15分钟后均渐开始出现体温升高，4小 时后达峰值，持续约8小时后体温渐下降，体温在峰值期间动物耳部、注射局部及眼睑充血，眼睑并有大量分泌物，有腹泻及后肢无力，食量降低，第4天起体温降至正常，症状亦随之消失。而对照组体温仅略有升高(<0.1°C)，且约24小时后即降至正常，亦无充血等症状。
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图1 34 000毒素蛋白致家兔发热模型
讨论
自80年代中期以来，由链球菌引起的感染明显增加，其严重的临床表现为中毒性休克综合征(Streptococcus Toxic Shock Syndrome, STSS)[6]。国外报道的STSS均为β溶血性化脓性链球菌引起[7]，可造成多器官功能损害，病死率高达30%[8]。能引起STSS的链球菌绝大多数是A组β-溶血性链球菌[9,10]，α溶血性草绿色链球菌引起的STSS罕见，且均发生于有肿瘤、器官移植、免疫缺陷等严重基础疾病的败血症患者[11]；但国内α-溶血性缓症链球菌可引起健康中青年发生TSS，且呈爆发流行。我们将现场分离所得的致病菌株培养18小时(在对数生长期)，这就保证了离心上清液中不含菌体溶解成分，说明致病因子是细菌的外分泌产物。离心上清液经20%硫酸铵盐析，再经FPLC最终纯化，纯化的毒素可引起动物发热，腹泻及后肢无力，食量降低、耳朵、注射局部及眼睑充血，眼睑并有大量分泌物，此特性表明本毒素为一种致热性外毒素。
, 百拇医药
传统的观念认为α-溶血性链球菌为条件致病菌，不产生毒素[12]，但我们从疫区分离的α-溶血性缓症链球菌可产生相对分子质量为34 000的链球菌外毒素，其引起动物的临床表现与已报道的STSS相似。目前多数学者认为STSS的发病机制与超抗原(superantigen, SAg)有关。SAg主要指一些细菌和病毒的产物，可与抗原提呈细胞(APC)上MHCⅡ类分子及T细胞受体(TCR)Vβ区结合，非特异性刺激T细胞增殖后释放一定量的细胞因子。缓症链球菌为口咽部正常寄生菌，为何会引起如此严重的病情，考虑在某些因素的作用下，细菌发生变异，导致毒素的产生，起到SAg作用。对其致病性的分子机制正在作进一步研究。
参考文献
1 朱白，孙兴海，王广和，等.缓症链球菌引起的类猩红热的临床与实验研究.中华传染病杂志，1993，11：68-71.
2 唐国卫，张国玲.重症猩红热疾病27例分析.南京医科大学学报，1994，14：686.
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3 陈俊麟.缓症链球菌中毒性脑病11例报告.江苏医药，1994,20:52-53.
4 卢洪洲，翁心华.链球菌中毒性休克综合征研究进展.中华传染病杂志，1996，14：97-100.
5 Fishcher L. Gelfiltration chromatography. 2nd ed. North-Amsterdan:Holland Biomedical Press, 1990,238.
6 Todd J, Frishant M, Kapral F, et al. Toxic shock syndrome associated with phage-group-1 staphycocci. Lancet, 1978,2:116-118.
7 Willoughby R, Greenberg RN. The toxic shock syndrome and streptococcal pyrogen extoxins. Am Intern Med, 1983,98:559.
, 百拇医药
8 The woking group on severe streptococcal infection [Commend] Defining the group a streptococcal to xic shock syndrome-rationale and consensuc definition. JAMA, 1993,269:390-391.
9 Kohler W. Streptococcal toxic shock syndrome. Zentralbl Bakteriol, 1990,2272,257-264.
10 Gaworzewska ET, Hallas G. Group-a streptococcal infections and a toxic shock-like syndrome[letter]. N Engl J Med, 1989,321:1546.
, 百拇医药
11 Bochud PY, Cometta A, Francioli P. Virulent infectious caused by alpha-hamolytic streptocci in cancer patients and their management. Current Opin Infect Dis, 1997,110:422-430.
12 Mulle AH, Gerlach D, Desreumaux P, et al. Streptococcal pyrogenic exotoxin a (SPEA) superantigen induced production of hematopoietic cytokines, IL-2 and IL-13 by human peripheral blood mononclear cells. Microbiol Pathol, 1997,23:265-272.
收稿：1997-12-29 修回：1998-12-14, http://www.100md.com
单位：200040 上海医科大学华山医院(卢洪洲、翁心华、尹有宽、石尧忠、陈一平)；江苏省海安县人民医院(姜夕南、王华雨、钱开成、朱白)
关键词：缓症链球菌；链球菌中毒性休克综合征；致热性外毒素
中华传染病杂志/990208 摘要 目的 分离与纯化致中毒性休克综合征缓症链球菌外毒素蛋白，并对其致病性进行初步研究。方法 将分离的缓症链球菌在Bact API 20培养基增菌培养后，所得上清液分别用20%、40%、60%、80%硫酸铵分段盐析，进一步快速蛋白液相色谱系统(FPLC)最终纯化，分别皮下注射新西兰兔观察有否体温升高、耳部及粘膜充血、腹泻等致热性表现。结果 增菌培养上清液20%盐析段蛋白(外毒素)有致热性作用，可复制新西兰兔致热模型。结论 缓症链球菌外毒素蛋白是一种新的链球菌致热性外毒素。
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Isolation and purification of a toxin from
Streptococcus mitis and preliminary study
on its pathogenicity
LU Hongzhou, WENG Xinhua, YIN Youkuan, et al. Huashan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200040
Abstract Objective In order to isolate and purify an exotoxin of Streptococcus mitis which can cause toxic shock syndrome and investigate its pathogenicity. Methods The Streptococcus mitis isolated from patient's throat was shaking cultivated in Bact API 20 culture medium, the supernant fluid of which was precipitated with 20%、40%、60%、80%(NH4)2SO4, respectively. The fast protein liquid chromatography(FPLC) was used for final purification. The finally purified proteins were used to challenge rabbits suboutaneously and the responses of fever, diarrhea and reddening of the ears as well as mucous membranes were monitored.Results 20%(NH4)2SO4 precipitated protein(exotoxin) of culture supernant fluid had a pyrogenic effect on rabbits.Conclusion Streptococcus mitis exotoxin is a novel Streptococcus pyrogenic exotoxin(SPE).
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Key words Streptococcus mitis Streptococcus toxic shock syndrome Pyrogenic exotoxin
1990年冬至1991年春，江苏海安、无锡、如东等长江三角洲地区有数千例猩红热样疾病流行[1-3]，20%表现为中毒性休克综合征(TSS)，但经积极治疗多能很快康复，鲜见死亡。此后每年这个季节均有散发。多数分离菌是从咽拭培养获得，仅少数血液培养阳性。经对病原体进行鉴定、生化试验、动物试验及血清学调查，并结合临床症状和流行病学分析，确定致病菌为缓症链球菌(α溶血性草绿色链球菌)[4]。本试验从病原菌分泌物中提取外毒素，并复制其致热性动物模型，现报道如下。
材料与方法
一、菌体的采集和保存
致病性缓症链球菌(由中国药品生物制品鉴定所最后鉴定，鉴定号SJFS980814)取自疾病爆发流行区患者口咽部，采用标准α溶血性链球菌作为对照(从上海市防疫站购得，菌种号32209,批号：3.5)，并均经真空干燥-20°C低温保存。
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二、仪器、主要试剂及培养基
电泳槽及电泳仪：MiniTRANSBLOT槽、200/2.0型电泳仪、1000×500型电泳仪、3000×电泳仪、微型等电聚集电泳槽(Rotofor cell)均为美国BIORAD公司产品。硫酸铵[(NH4)2SO4]为美国Merck公司产品。FPLC纯化仪(1.00型)，瑞典Pharmacia公司制造。低分子量标准蛋白：中国科学院上海生物化学研究所生产。培养基：为法国生产的BioMero Bact API 20培养基，其成分为：半胱氨酸、胰胨、氯化钠、亚硫酸钠、酚红、蒸馏水，pH7.8。
三、细菌增菌培养上清液及全菌蛋白的制备
离心上清液中不含菌体成分，将真空干燥-20°C低温保存的致病性缓症链球菌菌株，在Bact API 20培养瓶中35°C振荡培养18小时，经3 000r/min离心15分钟，取上清液置4°C冰箱备用(时间不超过7天)。取沉淀菌，用0.05mol/L PBS(pH7.4)洗2次，0.4ml洗涤液悬浮后缓慢加入10%SDS 30μl，边加边轻轻摇动，置55°C 20分钟，将高频超声探头置菌液中进行粉碎(200mA×1/2min)，超声处理时烧杯置于冰浴中。10 000r/min离心15分钟。取上清，测定A 260和A 280,按下公式计算出蛋白含量为5mg/ml∶C(蛋白)=1.45A280-0.74×A260[5]。加入等量灭菌甘油(蛋白浓度即为2.5mg/ml)分装置-20°C保存备用。标准菌株按同样方法培养及离心，取上清液置4°C冰箱备用。
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四、试验动物
新西兰兔36只，雄性，2kg/只，左背部剪毛2cm×2cm，碘酒消毒。随机分为9组，每组4只。
五、上清液所含蛋白的纯化
将所得上清液用硫酸铵分段盐析，沉淀经0.1mol/L磷酸盐缓冲液充分透析，仅20%、40%和80%盐析段有微量蛋白，将三种蛋白经充分透析，各取样品15μl与2倍缓冲液混合，煮沸3分钟，用12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE),各出现一条主要电泳带。再经快速蛋白液相色谱系统(FPLC)最终纯化。
六、毒素蛋白的确定
将纯化的三种蛋白分别皮下注射3组新西兰兔，20%硫酸铵盐析段蛋白可引起致热性表现，局部呈化脓性改变。将此20%盐析段蛋白用SDS-PAGE，据低分子量标准蛋白质算出其相对分子质量为34000。
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结果
一、细菌致病性的动物试验
3组新西兰兔，将上述致病性缓症链球菌10倍浓缩培养上清液0.5ml注射新西兰兔皮内，约15分钟后开始出现体温升高(体温计于注射前1小时插入肛门)，4小时后达峰值，持续约8小时后体温渐下降，体温在峰值期间动物耳部、注射局部及眼睑充血，眼睑并有大量分泌物，有腹泻及后肢无力，食量降低，第4天起体温降至正常，症状亦随之消失，病理见注射局部出现真皮层细胞变性、坏死，并伴炎性细胞重度浸润等化脓性改变。注射上述超声粉碎的等量菌体及10倍浓缩培养基的新西兰兔无此反应，说明致病性由细菌分泌的外毒素引起。
二、毒素蛋白动物试验结果
见图1。取新西兰兔3组，每组分别皮下注射34 000蛋白(0.5mg/ml)0.5ml(含0.25mg)、对照组标准链球菌10倍浓缩上清液0.5ml、培养基10倍浓缩液0.5ml。注射后第1小时每10分钟测一次体温，以后每小时测一次并算出平均体温，并观察眼睑充血程度、注射局部情况及有否腹泻等。所有注射34 000蛋白的4只动物约15分钟后均渐开始出现体温升高，4小 时后达峰值，持续约8小时后体温渐下降，体温在峰值期间动物耳部、注射局部及眼睑充血，眼睑并有大量分泌物，有腹泻及后肢无力，食量降低，第4天起体温降至正常，症状亦随之消失。而对照组体温仅略有升高(<0.1°C)，且约24小时后即降至正常，亦无充血等症状。
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图1 34 000毒素蛋白致家兔发热模型
讨论
自80年代中期以来，由链球菌引起的感染明显增加，其严重的临床表现为中毒性休克综合征(Streptococcus Toxic Shock Syndrome, STSS)[6]。国外报道的STSS均为β溶血性化脓性链球菌引起[7]，可造成多器官功能损害，病死率高达30%[8]。能引起STSS的链球菌绝大多数是A组β-溶血性链球菌[9,10]，α溶血性草绿色链球菌引起的STSS罕见，且均发生于有肿瘤、器官移植、免疫缺陷等严重基础疾病的败血症患者[11]；但国内α-溶血性缓症链球菌可引起健康中青年发生TSS，且呈爆发流行。我们将现场分离所得的致病菌株培养18小时(在对数生长期)，这就保证了离心上清液中不含菌体溶解成分，说明致病因子是细菌的外分泌产物。离心上清液经20%硫酸铵盐析，再经FPLC最终纯化，纯化的毒素可引起动物发热，腹泻及后肢无力，食量降低、耳朵、注射局部及眼睑充血，眼睑并有大量分泌物，此特性表明本毒素为一种致热性外毒素。
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参考文献
1 朱白，孙兴海，王广和，等.缓症链球菌引起的类猩红热的临床与实验研究.中华传染病杂志，1993，11：68-71.
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6 Todd J, Frishant M, Kapral F, et al. Toxic shock syndrome associated with phage-group-1 staphycocci. Lancet, 1978,2:116-118.
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10 Gaworzewska ET, Hallas G. Group-a streptococcal infections and a toxic shock-like syndrome[letter]. N Engl J Med, 1989,321:1546.
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11 Bochud PY, Cometta A, Francioli P. Virulent infectious caused by alpha-hamolytic streptocci in cancer patients and their management. Current Opin Infect Dis, 1997,110:422-430.
12 Mulle AH, Gerlach D, Desreumaux P, et al. Streptococcal pyrogenic exotoxin a (SPEA) superantigen induced production of hematopoietic cytokines, IL-2 and IL-13 by human peripheral blood mononclear cells. Microbiol Pathol, 1997,23:265-272.
收稿：1997-12-29 修回：1998-12-14, http://www.100md.com