重组体pCD-HCV1诱发小鼠免疫反应的研究
作者：窦骏 刘克洲 陈智 沃建尔 刘勇 何南祥 徐陈槐 陈明华
单位：310006 杭州，浙江医科大学附属一院传染病研究所(窦骏现在南京铁道医学院微生物学教研室，210009)
关键词：肝炎病毒，丙型；丙型肝炎病毒DNA重组体；抗体反应；脾细胞增殖反应
中华传染病杂志/990206 摘要 目的 探讨丙型肝炎病毒(HCV)基因重组体诱发小鼠免疫反应。方法 将编码Ⅱ型HCV结构蛋白的基因片段C、E1和大部分E2插入到真核细胞表达载体pCD-SRα1中，构建成重组体pCD-HCV1。经肌内注射将此重组体免疫Balb/c小鼠。结果 pCD-HCV1(100μg/只，n=12)3～4次接种小鼠后，血清抗体水平达0.71～0.77(A值，下同)，空载体pCD-SRα1免疫鼠(n=8)，血清抗体阴性；对其中8只免疫鼠持续检测18周，未见抗体水平有下降趋势(0.68～0.75)。重组体pCD-HCV1免疫鼠(n=12)的脾细胞对HCV合成肽CP9、基因重组抗原C、E1刺激后，均出现增殖反应(cpm)，SI分别为4.14±0.9，3.98±1.6，4.02±1.2，与pCD-SRα1免疫鼠(n=8)相比，差异有显著性(P<0.001)。结论 构建的HCV DNA重组体可诱发Balb/c小鼠产生免疫反应。
, 百拇医药
Study on immune responses to recombinant protein in
mice inoculated with pCD-HCV1 DNA recombinant
DOU Jun, LIU Kezhou, CHEN Zhi, et al. Institute of Infectious Disease, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310006
Abstract Objective To inquire into the immune responses to expression protein in mice immunized with pCD-HCV1 recombinant.Methods The gene fragment encoding C and HCV-Ⅱ type was inserted into pCD-SRα1 of expression vector and formed pCD-HCV1 and then was injected into quadriceps muscles of Balb/c mice. Results The serum antibody level reached to 0.71～0.77(A value, the same below) after recombinant pCD-HCV1(100μg/mouse) were inoculated into mice(n=12) three times or four times and blank vector pCD-SRα1 could not induce mice(n=8) to generate antibody in the same way. After the antibody levels in mice(n=8) immunized by pCD-HCV1 ascended to peak value(0.71), it did not occur to be the trend of descending during 18 weeks detected (0.68～0.75). The spleen cells prolitferative responses to HCV synthetic peptide CP9 and gene recombinant antigens C and E1 in mice immunized with pCD-HCV1 were detected and its stimulation index (SI) were 4.14±0.9, 3.98±1.6 and 4.02±1.2 respectively and there was a significant difference (P<0.001) comparing with that of spleen cells of mice immunized with pCD-SRα1.Conclusion The investigations demonstrated that recombinant pCD-HCV1 can elicite Blab/c mice to generate antibody and spleen cells proliferative responses to HCV antigens via DNA immunization.
, 百拇医药
Key words Hepatitis C virus HCV DNA recombinant Antibody reactions Spleen cells proliferative response
丙型肝炎病毒(HCV)感染人体后，大部分患者转为慢性肝炎，迄今尚无特效治疗药物和免疫预防方法。由于HCV至少存在6种不同基因型，各型间异源性在25%～35%，又易发生突变，使目前HCV疫苗研制面临重重困难[1]。随着分子生物学理论和技术发展，核酸免疫技术已开始应用于HCV疫苗研究[2-3]。本研究选择我国Ⅱ型HCV主要流行株为研究毒株，将编码HCV结构蛋白的基因片段C、E1和大部分E2插入到真核细胞表达载体pCD-SRα1中，构建成重组体pCD-HCV1，经鉴定后再将其免疫Balb/c小鼠，从抗体产生脾淋巴细胞对HCV抗原的增殖反应等方面，探讨HCV核酸免疫的可能性和有效性，拟为今后进行HCV核酸疫苗研制提供实验依据。
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材料与方法
一、材料
(一) 质粒 CDZ2由本所陈智博士构建，含有HCV结构区基因，长1693bp，基因型为OkamotoⅡ型。真核细胞表达载体pCD-SRα1，由日本九洲大学惠赠。重组质粒pCD-HCV1，含有SV40早期启动子和HTLV-Ⅰ型末端重复RU-5片段的真核表达载体，内含1693bp的HCV cDNA片段。
(二) PCR引物 正链一部分和负链引物根据CDZ2DNA序列设计，在5′末端引入EcoR-Ⅰ识别序列，PCR产物为1.73kb。正链5′ATGAATTCGCTGCAGCAGACCGTGCATC 3′负链5′GGTACCGAATTCTCTAGAGG3′。
(三) HCV抗原 合成肽CP9由中国科学院上海细胞生物研究所合成。基因重组抗原C、E由北京医科大学庄辉教授、北京药品生物制品检定所汪兴太、张庶民博士等提供和惠赠。
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(四) 抗体 HRP标记的羊抗鼠单克隆抗体IgG，购自上海华美公司。
(五) 动物 Balb/c小鼠，雄性，6～8周龄，由浙江医科大学实验动物中心提供。
二、方法
(一) 重组体pCD-HCV1的构建 以CDZ2为模板，用PCR扩增出约为1.73kb产物，将pCD-SRα1和PCR产物经EcoR-Ⅰ酶切后，再经T4连接酶连结，形成重组体pCD-HCV1。
(二) 重组体pCD-HCV1免疫Balb/c小鼠 (1) 实验分组：随机将小鼠分成实验组(n=12，注射pCD-HCV1)和对照组(n=8，注射pCD-SRα1空载体)。(2) 免疫途径：于小鼠四肢肌肉多点注射。(3) 免疫剂量：每次100μg/只，间隔2周免疫1次，共3次或4次。
(三) 鼠血清抗体检测 Balb/c免疫鼠血清经1∶40倍稀释后再进行抗体检测，具体方法见文献[4]。脾细胞制备见文献[5]。
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在96孔细胞培养板中每孔加入200μl细胞(1×107/ml)和0.8μg抗原培育5天，再加入3H-TdR0.5μCi/孔，继续培养18小时，收集细胞在液闪仪上检测A值，并以刺激指数(SI)≥2.1为阳性[6]。
三、统计
采用t检验对实验资料进行统计处理。
结果
一、pCD-HCV1重组体诱发小鼠的抗体反应
随着免疫次数增加，抗体水平逐步升高，3次免疫后A值达0.71，第4次免疫后抗体水平虽较前次略升高(0.77)，但经t检验，与前次相比差异无显著性(P>0.05)。对照组用空载体pCD-SRα1免疫4次，均未见血清抗体阳转(0.04～0.05)，见表1。
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表1 小鼠对重组体pCD-HCV1免疫后的抗体反应(A值) 免疫次数
实验组*(n=12)
对照组(n=8)
一次免疫
0.188±0.04
0.04±0.02
二次免疫
0.466±0.05
0.06±0.01
三次免疫
0.710±0.06
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0.06±0.02
四次免疫
0.773±0.05
0.05±0.03
*与对照组相比P<0.001
二、pCD-HCV1重组体免疫鼠抗体水平动态观察
由图1可见，pCD-HCV1重组体3次免疫小鼠后(100μg/次)，于第6周血清抗体水平已趋于峰值(0.71)，在随后18周检测中，抗体水平仍几乎维持在同一水平(0.68～0.75),并未随着时间延长呈下降趋势。
图1 免疫鼠抗体水平动态观察
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三、pCD-HCV1重组体免疫鼠脾细胞增殖反应
pCD-HCV1重组体3次免疫小鼠后(100μg/次)，脾细胞对特异性抗原HCV CP9、C、E1刺激均出现明显的增殖反应，SI为3.88～4.07，与空载体pCD-SRα1免疫组相比(SI为1.28～1.4)，经t检验显示，差异有显著性(P<0.001)。该结果表明，pCD-HCV1免疫小鼠后，表达的蛋白抗原可使小鼠脾细胞致敏，当再次遇到相同抗原刺激后，脾细胞表现出比对照组脾细胞有明显的增殖反应，见表2。
表2 小鼠脾细胞对HCV抗原的增殖反应(SI，
+s) 抗原
实验组*(n=12)
对照组(n=8)
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CP9
4.14±0.90
1.4±0.56
C
3.98±1.6
1.2±0.68
E1
4.02±1.2
1.2±0.62
*与对照组相比P<0.001
讨论
1993年Ulmer等[7]首次报道DNA免疫技术用于流感病毒疫苗研制，随后HBV、HCV等核酸疫苗研制已逐步展开。根据HCV包膜区蛋白的免疫原性较强的特点，本研究除选用C区基因外，增加了E1和大部分E2区基因，构建成重组体pCDα-HCV1，将其转染HeLa细胞，蛋白表达抽提物经Western blot证实，可表达HCV抗原[8]。用此重组体免疫Balb/c小鼠，可诱导特异性抗体产生，抗体产生水平达高峰后(第6周)到24周内，抗体产生水平并未见下降趋势。该结果提示，重组体pCD-HCV1在小鼠体内能持续表达HCV抗原，不断激发免疫系统，使不同克隆B细胞先后活化增殖，因而可持续产生抗体。
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核酸疫苗免疫机体后，不仅可诱导抗体产生，还可诱导细胞免疫反应，这是核酸疫苗的一大特点[1-3]。本研究结果显示，重组体pCD-HCV1 3次免疫小鼠后，能诱导脾细胞对HCV抗原CP9、C、E1出现增殖反应和小鼠外周血单个核细胞(PBMC)对HCV抗原的增殖反应(资料未显示)。当然，脾细胞和PBMC对特异性HCV抗原的增殖反应，只是机体细胞免疫反应的一个方面。本研究报道了pCD-HCV1诱发Balb/c小鼠的免疫反应，与此同时还探讨了不同免疫途径、剂量、被接种小鼠处理方法等因素对抗体产生的影响[9]，下一步还将继续研究pCD-HCV1核酸免疫诱导Balb/c小鼠细胞毒T细胞的免疫反应，这在抗HCV感染的免疫防护方面具有更重要意义。
本研究受国家自然科学基金(39670665)和浙江省自然科学基金资助(396461)
参考文献
1 Zuckerman AJ, Zuckerman JN. Prospects for hepatitis C vaccine. J Hepatol, 1995, 22 Suppl 11:97-100.
, http://www.100md.com
2 Lagging LM, Meyer K， Hoft D, et al. Immune responses to plasmid DNA encoding the hepatitis C virus core protein. J Virol, 1995, 69:5859-5864.
3 窦骏，刘克洲，陈智.丙型肝炎病毒核酸疫苗研究进展.国外医学免疫学分册，1998，21：24-26.
4 戚中田，杜平，主编.丙型肝炎病毒与丙型肝炎.第1版.上海：上海科技出版社，1992.55-85.
5 窦骏，吴敏毓.四君子汤对小鼠脾细胞ADCC和NK活性的影响.中药药理与临床，1989，5：24-27.
6 徐永耀，闻玉梅，胡德昌，等.慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞对乙型肝炎病毒前S区合成肽的增殖反应.中华传染病杂志，1992，10：68-71.
, 百拇医药
7 Ulmer JB, Donnelly JJ, Parker SE, et al. Heterologus protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein. Science, 1993， 259:1745-1749.
8 窦骏，刘克洲，陈智，等.HCV结构区基因重组体构建、蛋白表达及诱发小鼠产生抗体反应的研究.中国实验与临床免疫学杂志，1998，10：170-176.
9 窦骏，刘克洲，陈智，等.不同处理方式对HCV基因重组体诱发小鼠产生抗体的影响.中华微生物学和免疫学杂志，1998，18：288.
收稿：1998-05-05 修回：1998-10-30, http://www.100md.com
单位：310006 杭州，浙江医科大学附属一院传染病研究所(窦骏现在南京铁道医学院微生物学教研室，210009)
关键词：肝炎病毒，丙型；丙型肝炎病毒DNA重组体；抗体反应；脾细胞增殖反应
中华传染病杂志/990206 摘要 目的 探讨丙型肝炎病毒(HCV)基因重组体诱发小鼠免疫反应。方法 将编码Ⅱ型HCV结构蛋白的基因片段C、E1和大部分E2插入到真核细胞表达载体pCD-SRα1中，构建成重组体pCD-HCV1。经肌内注射将此重组体免疫Balb/c小鼠。结果 pCD-HCV1(100μg/只，n=12)3～4次接种小鼠后，血清抗体水平达0.71～0.77(A值，下同)，空载体pCD-SRα1免疫鼠(n=8)，血清抗体阴性；对其中8只免疫鼠持续检测18周，未见抗体水平有下降趋势(0.68～0.75)。重组体pCD-HCV1免疫鼠(n=12)的脾细胞对HCV合成肽CP9、基因重组抗原C、E1刺激后，均出现增殖反应(cpm)，SI分别为4.14±0.9，3.98±1.6，4.02±1.2，与pCD-SRα1免疫鼠(n=8)相比，差异有显著性(P<0.001)。结论 构建的HCV DNA重组体可诱发Balb/c小鼠产生免疫反应。
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Study on immune responses to recombinant protein in
mice inoculated with pCD-HCV1 DNA recombinant
DOU Jun, LIU Kezhou, CHEN Zhi, et al. Institute of Infectious Disease, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310006
Abstract Objective To inquire into the immune responses to expression protein in mice immunized with pCD-HCV1 recombinant.Methods The gene fragment encoding C and HCV-Ⅱ type was inserted into pCD-SRα1 of expression vector and formed pCD-HCV1 and then was injected into quadriceps muscles of Balb/c mice. Results The serum antibody level reached to 0.71～0.77(A value, the same below) after recombinant pCD-HCV1(100μg/mouse) were inoculated into mice(n=12) three times or four times and blank vector pCD-SRα1 could not induce mice(n=8) to generate antibody in the same way. After the antibody levels in mice(n=8) immunized by pCD-HCV1 ascended to peak value(0.71), it did not occur to be the trend of descending during 18 weeks detected (0.68～0.75). The spleen cells prolitferative responses to HCV synthetic peptide CP9 and gene recombinant antigens C and E1 in mice immunized with pCD-HCV1 were detected and its stimulation index (SI) were 4.14±0.9, 3.98±1.6 and 4.02±1.2 respectively and there was a significant difference (P<0.001) comparing with that of spleen cells of mice immunized with pCD-SRα1.Conclusion The investigations demonstrated that recombinant pCD-HCV1 can elicite Blab/c mice to generate antibody and spleen cells proliferative responses to HCV antigens via DNA immunization.
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Key words Hepatitis C virus HCV DNA recombinant Antibody reactions Spleen cells proliferative response
丙型肝炎病毒(HCV)感染人体后，大部分患者转为慢性肝炎，迄今尚无特效治疗药物和免疫预防方法。由于HCV至少存在6种不同基因型，各型间异源性在25%～35%，又易发生突变，使目前HCV疫苗研制面临重重困难[1]。随着分子生物学理论和技术发展，核酸免疫技术已开始应用于HCV疫苗研究[2-3]。本研究选择我国Ⅱ型HCV主要流行株为研究毒株，将编码HCV结构蛋白的基因片段C、E1和大部分E2插入到真核细胞表达载体pCD-SRα1中，构建成重组体pCD-HCV1，经鉴定后再将其免疫Balb/c小鼠，从抗体产生脾淋巴细胞对HCV抗原的增殖反应等方面，探讨HCV核酸免疫的可能性和有效性，拟为今后进行HCV核酸疫苗研制提供实验依据。
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材料与方法
一、材料
(一) 质粒 CDZ2由本所陈智博士构建，含有HCV结构区基因，长1693bp，基因型为OkamotoⅡ型。真核细胞表达载体pCD-SRα1，由日本九洲大学惠赠。重组质粒pCD-HCV1，含有SV40早期启动子和HTLV-Ⅰ型末端重复RU-5片段的真核表达载体，内含1693bp的HCV cDNA片段。
(二) PCR引物 正链一部分和负链引物根据CDZ2DNA序列设计，在5′末端引入EcoR-Ⅰ识别序列，PCR产物为1.73kb。正链5′ATGAATTCGCTGCAGCAGACCGTGCATC 3′负链5′GGTACCGAATTCTCTAGAGG3′。
(三) HCV抗原 合成肽CP9由中国科学院上海细胞生物研究所合成。基因重组抗原C、E由北京医科大学庄辉教授、北京药品生物制品检定所汪兴太、张庶民博士等提供和惠赠。
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(四) 抗体 HRP标记的羊抗鼠单克隆抗体IgG，购自上海华美公司。
(五) 动物 Balb/c小鼠，雄性，6～8周龄，由浙江医科大学实验动物中心提供。
二、方法
(一) 重组体pCD-HCV1的构建 以CDZ2为模板，用PCR扩增出约为1.73kb产物，将pCD-SRα1和PCR产物经EcoR-Ⅰ酶切后，再经T4连接酶连结，形成重组体pCD-HCV1。
(二) 重组体pCD-HCV1免疫Balb/c小鼠 (1) 实验分组：随机将小鼠分成实验组(n=12，注射pCD-HCV1)和对照组(n=8，注射pCD-SRα1空载体)。(2) 免疫途径：于小鼠四肢肌肉多点注射。(3) 免疫剂量：每次100μg/只，间隔2周免疫1次，共3次或4次。
(三) 鼠血清抗体检测 Balb/c免疫鼠血清经1∶40倍稀释后再进行抗体检测，具体方法见文献[4]。脾细胞制备见文献[5]。
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在96孔细胞培养板中每孔加入200μl细胞(1×107/ml)和0.8μg抗原培育5天，再加入3H-TdR0.5μCi/孔，继续培养18小时，收集细胞在液闪仪上检测A值，并以刺激指数(SI)≥2.1为阳性[6]。
三、统计
采用t检验对实验资料进行统计处理。
结果
一、pCD-HCV1重组体诱发小鼠的抗体反应
随着免疫次数增加，抗体水平逐步升高，3次免疫后A值达0.71，第4次免疫后抗体水平虽较前次略升高(0.77)，但经t检验，与前次相比差异无显著性(P>0.05)。对照组用空载体pCD-SRα1免疫4次，均未见血清抗体阳转(0.04～0.05)，见表1。
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表1 小鼠对重组体pCD-HCV1免疫后的抗体反应(A值) 免疫次数
实验组*(n=12)
对照组(n=8)
一次免疫
0.188±0.04
0.04±0.02
二次免疫
0.466±0.05
0.06±0.01
三次免疫
0.710±0.06
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0.06±0.02
四次免疫
0.773±0.05
0.05±0.03
*与对照组相比P<0.001
二、pCD-HCV1重组体免疫鼠抗体水平动态观察
由图1可见，pCD-HCV1重组体3次免疫小鼠后(100μg/次)，于第6周血清抗体水平已趋于峰值(0.71)，在随后18周检测中，抗体水平仍几乎维持在同一水平(0.68～0.75),并未随着时间延长呈下降趋势。
图1 免疫鼠抗体水平动态观察
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三、pCD-HCV1重组体免疫鼠脾细胞增殖反应
pCD-HCV1重组体3次免疫小鼠后(100μg/次)，脾细胞对特异性抗原HCV CP9、C、E1刺激均出现明显的增殖反应，SI为3.88～4.07，与空载体pCD-SRα1免疫组相比(SI为1.28～1.4)，经t检验显示，差异有显著性(P<0.001)。该结果表明，pCD-HCV1免疫小鼠后，表达的蛋白抗原可使小鼠脾细胞致敏，当再次遇到相同抗原刺激后，脾细胞表现出比对照组脾细胞有明显的增殖反应，见表2。
表2 小鼠脾细胞对HCV抗原的增殖反应(SI，
+s) 抗原实验组*(n=12)
对照组(n=8)
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CP9
4.14±0.90
1.4±0.56
C
3.98±1.6
1.2±0.68
E1
4.02±1.2
1.2±0.62
*与对照组相比P<0.001
讨论
1993年Ulmer等[7]首次报道DNA免疫技术用于流感病毒疫苗研制，随后HBV、HCV等核酸疫苗研制已逐步展开。根据HCV包膜区蛋白的免疫原性较强的特点，本研究除选用C区基因外，增加了E1和大部分E2区基因，构建成重组体pCDα-HCV1，将其转染HeLa细胞，蛋白表达抽提物经Western blot证实，可表达HCV抗原[8]。用此重组体免疫Balb/c小鼠，可诱导特异性抗体产生，抗体产生水平达高峰后(第6周)到24周内，抗体产生水平并未见下降趋势。该结果提示，重组体pCD-HCV1在小鼠体内能持续表达HCV抗原，不断激发免疫系统，使不同克隆B细胞先后活化增殖，因而可持续产生抗体。
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核酸疫苗免疫机体后，不仅可诱导抗体产生，还可诱导细胞免疫反应，这是核酸疫苗的一大特点[1-3]。本研究结果显示，重组体pCD-HCV1 3次免疫小鼠后，能诱导脾细胞对HCV抗原CP9、C、E1出现增殖反应和小鼠外周血单个核细胞(PBMC)对HCV抗原的增殖反应(资料未显示)。当然，脾细胞和PBMC对特异性HCV抗原的增殖反应，只是机体细胞免疫反应的一个方面。本研究报道了pCD-HCV1诱发Balb/c小鼠的免疫反应，与此同时还探讨了不同免疫途径、剂量、被接种小鼠处理方法等因素对抗体产生的影响[9]，下一步还将继续研究pCD-HCV1核酸免疫诱导Balb/c小鼠细胞毒T细胞的免疫反应，这在抗HCV感染的免疫防护方面具有更重要意义。
本研究受国家自然科学基金(39670665)和浙江省自然科学基金资助(396461)
参考文献
1 Zuckerman AJ, Zuckerman JN. Prospects for hepatitis C vaccine. J Hepatol, 1995, 22 Suppl 11:97-100.
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3 窦骏，刘克洲，陈智.丙型肝炎病毒核酸疫苗研究进展.国外医学免疫学分册，1998，21：24-26.
4 戚中田，杜平，主编.丙型肝炎病毒与丙型肝炎.第1版.上海：上海科技出版社，1992.55-85.
5 窦骏，吴敏毓.四君子汤对小鼠脾细胞ADCC和NK活性的影响.中药药理与临床，1989，5：24-27.
6 徐永耀，闻玉梅，胡德昌，等.慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞对乙型肝炎病毒前S区合成肽的增殖反应.中华传染病杂志，1992，10：68-71.
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7 Ulmer JB, Donnelly JJ, Parker SE, et al. Heterologus protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein. Science, 1993， 259:1745-1749.
8 窦骏，刘克洲，陈智，等.HCV结构区基因重组体构建、蛋白表达及诱发小鼠产生抗体反应的研究.中国实验与临床免疫学杂志，1998，10：170-176.
9 窦骏，刘克洲，陈智，等.不同处理方式对HCV基因重组体诱发小鼠产生抗体的影响.中华微生物学和免疫学杂志，1998，18：288.
收稿：1998-05-05 修回：1998-10-30, http://www.100md.com