多重聚合酶链反应检测产毒性大肠杆菌三种毒力基因
作者：赵敏 王国卿 王红 王雅贤 俞守义
单位：100036 北京，空军总医院感染控制科(赵敏、王国卿)；第一军医大学基础部流行病学教研室(王红、王雅贤、俞守义)
关键词：聚合酶链反应；杂交；产毒性大肠杆菌
中华传染病杂志/990205 摘要 目的 提高普通的单基因聚合酶链反应(PCR)检测产毒性大肠杆菌(ETEC)的时效。方法 以ETEC44813(STp+)、ETEC19449(STh+)和ETEC44815(LT+)三个标准株为模板，建立了检测产毒性大肠杆菌多重PCR扩增系统。结果 杂交工程株H10907(STp+)，PSLM004(STh+)和PMM030(LT+)，杂交的结果都是阳性，54株菌株经PCR检测，其中LT+8株、STp+2株、STh+7株、LT++STp+10株、LT++STh+10株、STp++STh+4株和LT++STp++STh+13株。结论 用一次PCR扩增可检测和鉴别ETEC，比单基因PCR更加快速、经济。
, http://www.100md.com
Three-gene PCR for detection of
enterotoxigenic Escherichia coli
ZHAO Min, WANG Guoqing, WANG Hong, et al. Deptartment of Epidemiology, General Hospital of Air Force PLA, Beijing 100036.
Abstract Objective In order to raise the efficiency of general single-gene amplification in detecting ETEC.Methods Three-gene PCR method had been set up with three standard bacteria of ETEC44815(STp+), ETEC19449(STh+) and ETEC44813(LT+).Results H10907(STp+),PSLM004(STh+) and PMM030(LT+) had been hybrided with the probes labeled by the polymerase chain reaction. The hybridization results of all strains were positive, which demonstrated the speciality of the multiplex PCR method. Fifty-four ETEC had been detected by this three-gene amplificatin system and divided into LT(8), STp(2),STh(7),LT+STP(10),LT+STh(10),STp+STh(4) and LT+STp+STh(13).Conclusion The results suggests that mutiplex PCR is more rapid and economical than single-gene one in the detection and identification of ETEC.
, 百拇医药
Key words Polymerase chain reaction Hybridization Enterotoxigenic Escherichia coli
产毒性大肠杆菌(ETEC)产生的毒素分为不耐热肠毒素(LT)和耐热肠毒素(ST)[1]，根据其来源不同，耐热肠毒素又可分为猪源性(STp)和人源性(STh)，它们分别由位于质粒上的三种毒力基因编码，产毒性大肠杆菌(ETEC)一般含有三个毒力基因中的一个或几个基因。目前，用于检测产毒性大肠杆菌的聚合酶链反应(PCR)方法，一般是单基因PCR，每次扩增只能检测一种毒力基因，虽然具有较高的特异性和敏感性，但往往漏检，也未能充分体现PCR高时效的特点，临床普遍应用尚存在一定的局限性。为提高常规PCR检测的时效，选择ETEC的耐热肠毒素(STp和STh)及热敏肠毒素(LT)的编码基因保守区，设计三对多重PCR引物，建立了快速检测ETEC多重PCR扩增系统，并应用此系统检测了一批菌株，现报告如下。
, http://www.100md.com
材料和方法
一、材料
(一)菌株 ETEC44813、ETEC19449、ETEC44815、EIEC6、ETEC44822、ETEC44823、E.coliDH5α、E.coli8099、S.flexneri 2a(T32)、Salmonella6503为军事医学科学院生物工程研究所提供。PSLM004、PMM030和H10907为中山医科大学提供。O1群霍乱弧菌和非O1群霍乱弧菌为本室保存。54株野生菌株为本室1990年从广州九佛镇现场收集。
(二) 试剂来源 Tris、dNTP、Taq酶和λDNA分子量参照标准购自华美生物工程公司，Dig-dUTP为Boehringer Mannheim公司产品，其余试剂均为分析纯。
(三) 引物 选择产生LT、STp和STh毒素的编码基因的保守区，自行设计3对多重PCR引物，扩增片段分别为LT(686bp)、STh(151bp)和STp(334bp)。
, 百拇医药
(四) 探针制备 采用PCR方法标记探针。
二、方法
(一) PCR扩增 挑取单个菌落接种于5mlLB中，37°C振荡1～2小时。取3μl菌液，10μl菌裂解液(5×PCR缓冲液、0.5%NP-40和0.5%吐温20)，10μl dNTP(2mmol/μl),6μl引物(0.2μmol/L),2μl MgCl2(15mmol/L),18μl去离子水和50μl石蜡油。经100°C煮沸裂解15分钟，再加入1μl Taq酶(1U/μl)。在DNA扩增仪中94°C变性1分钟，55°C退火2分钟，72°C延伸2分钟。30个循环后，72°C延伸5分钟。
(二) 引物测试 在上述PCR反应体系中，各加入LT、STp和STh引物2μl(0.2μmol/L)，不加标本DNA，同时以LT+、STp+和STh+菌株DNA为阳性对照，扩增条件同上。
, 百拇医药
(三) 菌落原位杂交 将硝酸纤维素滤膜上的待检工程菌落经裂解变性和中和固定后，37°C预杂交4小时，再经37°C杂交20小时。洗膜：用洗膜液Ⅰ(2×SSC、0.1%SDS)洗膜3次，每次5分钟，然后于42°C用洗膜液Ⅱ(1×SSC、0.1%SDS)洗膜2次，每次30分钟。最后加抗体和底物在室温26°C下显色6小时，观察结果。
(四) 应用 分别用单基因和多重PCR扩增系统检测本室54株ETEC，扩增条件同上。
(五) 扩增产物检测 取10～15μl扩增产物，加3μl溴酚蓝，1.0%琼脂糖凝胶电泳。稳压100V，25～50分钟，于紫外灯下观察结果。
结果
一、多重PCR扩增系统的建立
选择ETEC44815(LT)、ETEC44813(STp)和ETEC19449(STh)3个标准株作对照，采用拉丁方设计和热启动等技术逐步优化多重PCR反应系统。通过排列了所有的可能组合来比较扩增的特异性，即LT+STp(E)、LT+STh(F)、STh+STp(G)和LT+STh+STp(H)。结果显示ETEC44815、ETEC44813和ETEC19449均扩增出各自的特异带，阴性对照E.coli DH5α未见扩增带，见图1。
, http://www.100md.com
A:Marker λDNA/HindIII；B：LT(686bp)；C:STp(334bp)；D：STh(151bp)；E：LT+STp；F:LT+STh；G：STh+STp；H:LT+STh+STp；I：阴性对照(E.coli DH5α)
图1 三基因PCR扩增系统的建立
二、引物测试
3对引物混合后PCR扩增，未见特异DNA带，而阳性对照可见3条清晰的带，表明引物之间不会因互相干扰而形成假阳性。
三、引物扩增的特异性
选择ETEC44822、ETEC44823、EIEC6、E.coli 8099、S.flexneri 2a(T32)、Salmonella 6503、O1群霍乱弧菌和非O1群霍乱弧菌作此3对引物的特异性检测。除ETEC44822和ETEC44823有阳性扩增外，其余菌株均未见扩增带，证实3对引物在多重PCR扩增系统中具有高度的特异性。
, 百拇医药
四、菌落原位杂交
用此PCR标记的3个探针分别杂交三个工程株H10907(STp+)、PSLM004(STh+)和PMM030(LT+)，均获得阳性结果(未显示)。
五、多重PCR和单基因PCR相比
对54株ETEC菌株分别进行多基因PCR和单基因PCR检测，符合率为94.4%(51/54)。
六、现场收集菌株多重PCR结果
只产生一种毒素的ETEC扩增后只有1条特异DNA带；产生多种毒素的ETEC可见2条或3条特异性扩增带。54株ETEC含有多种毒力基因的株数为LT++STp+10株(18.5%)、LT++STh+10株(18.5%)、STp++STh+4株(7.4%)和LT++STp++STp+13株(24.1%)。
, http://www.100md.com
讨论
多重PCR是单基因PCR的发展和完善，是在同一PCR反应体系中加入多对特异性引物，1次扩增多个靶基因，实现多个基因型鉴别或多种病原体的同时检出。单基因PCR1次只能检测一种病原体或一个基因型别，基因分型或混合感染检测显得操作繁琐，费时且成本较高。多重PCR有效地解决了上述问题,使得混合感染的诊断和基因分型变得简捷，减少漏诊率，提高了检验效率[2]。
多重PCR与单基因PCR操作基本一样，只是在同一反应体系中同时加入几对引物，但对引物的设计和选择比常规PCR更严格。设计PCR引物的起始位置应考虑整个多重反应，灵活选择扩增区域的大小，使多重PCR反应产物很容易用琼脂糖凝胶电泳分离；多重PCR的寡核苷酸引物一般为23～28个碱基，较一般PCR的引物长，主要是引物在多重PCR扩增反应中应具有较高的特异性，各对引物的G+C含量应大致相近，使彼此的Tm不会相差太大；同时还必须充分考虑多对引物之间的关系，避免形成引物二聚体，如果它们之间形成粘性末端或部分双链，就会导致实验失败或假阳性。
, 百拇医药
ETEC是引起儿童和成人急性感染性腹泻的主要致病菌，在腹泻病原谱中居前三位，在旅游者腹泻中占首位[3]。ETEC在霍乱样腹泻患者中的检出率很高，在外环境和海产品中污染严重[4]。由于ETEC和一般大肠埃希菌用细菌培养和生化反应难以区分，血清鉴定又不够敏感和特异，故而主要通过检测肠毒素的有无来鉴定ETEC。目前检测肠毒素的方法主要有兔肠袢结扎试验、乳鼠灌胃法、CHO细胞培养法和ELISA等，操作繁杂，费时耗力，直接影响对本病的深入研究。应用此研究建立的多重PCR扩增系统，通过检测位于质粒上的编码肠毒素的毒力基因来检测ETEC，不仅敏感性特异性好，而且操作简便，同时也解决了单基因PCR扩增所带来的漏诊问题。多重PCR在混合感染的基因诊断和病原体的基因分型等研究领域有着广泛的应用前景，已有逐步取代单基因PCR的趋势。
本课题系全军“九五”指令性课题资助项目(96L032)
参考文献
, 百拇医药
1 Sandrina SP, James JM, Judith BW. Multiplex PCR assay and simple preparation method for stool specimens detect Enterotoxigenic Escherichia coli DNA during course of infection. J Clin Microbiol, 1995, 33：1045-1059.
2 郑兴武，肖桂元，戴盛明，等.多重聚合酶链反应检测淋病奈瑟菌等多种菌感染.中华医学检验杂志，1996，3：176-178.
3 Frankel G, Giron JA, Valmassoi J, et al. Multi-gene amplification: simultaneous detection of three virulence genes in diarrhoeal stool. Mol Microbiol, 1989, 3:1729-1734.
4 林成水，曾昭鸿，曾凝梅，等.国内产肠毒素大肠杆菌的发现和所进行的调查研究.中华流行病学杂志，1996，5：264-266.
收稿：1998-07-07 修回：1998-12-10, 百拇医药
单位：100036 北京，空军总医院感染控制科(赵敏、王国卿)；第一军医大学基础部流行病学教研室(王红、王雅贤、俞守义)
关键词：聚合酶链反应；杂交；产毒性大肠杆菌
中华传染病杂志/990205 摘要 目的 提高普通的单基因聚合酶链反应(PCR)检测产毒性大肠杆菌(ETEC)的时效。方法 以ETEC44813(STp+)、ETEC19449(STh+)和ETEC44815(LT+)三个标准株为模板，建立了检测产毒性大肠杆菌多重PCR扩增系统。结果 杂交工程株H10907(STp+)，PSLM004(STh+)和PMM030(LT+)，杂交的结果都是阳性，54株菌株经PCR检测，其中LT+8株、STp+2株、STh+7株、LT++STp+10株、LT++STh+10株、STp++STh+4株和LT++STp++STh+13株。结论 用一次PCR扩增可检测和鉴别ETEC，比单基因PCR更加快速、经济。
, http://www.100md.com
Three-gene PCR for detection of
enterotoxigenic Escherichia coli
ZHAO Min, WANG Guoqing, WANG Hong, et al. Deptartment of Epidemiology, General Hospital of Air Force PLA, Beijing 100036.
Abstract Objective In order to raise the efficiency of general single-gene amplification in detecting ETEC.Methods Three-gene PCR method had been set up with three standard bacteria of ETEC44815(STp+), ETEC19449(STh+) and ETEC44813(LT+).Results H10907(STp+),PSLM004(STh+) and PMM030(LT+) had been hybrided with the probes labeled by the polymerase chain reaction. The hybridization results of all strains were positive, which demonstrated the speciality of the multiplex PCR method. Fifty-four ETEC had been detected by this three-gene amplificatin system and divided into LT(8), STp(2),STh(7),LT+STP(10),LT+STh(10),STp+STh(4) and LT+STp+STh(13).Conclusion The results suggests that mutiplex PCR is more rapid and economical than single-gene one in the detection and identification of ETEC.
, 百拇医药
Key words Polymerase chain reaction Hybridization Enterotoxigenic Escherichia coli
产毒性大肠杆菌(ETEC)产生的毒素分为不耐热肠毒素(LT)和耐热肠毒素(ST)[1]，根据其来源不同，耐热肠毒素又可分为猪源性(STp)和人源性(STh)，它们分别由位于质粒上的三种毒力基因编码，产毒性大肠杆菌(ETEC)一般含有三个毒力基因中的一个或几个基因。目前，用于检测产毒性大肠杆菌的聚合酶链反应(PCR)方法，一般是单基因PCR，每次扩增只能检测一种毒力基因，虽然具有较高的特异性和敏感性，但往往漏检，也未能充分体现PCR高时效的特点，临床普遍应用尚存在一定的局限性。为提高常规PCR检测的时效，选择ETEC的耐热肠毒素(STp和STh)及热敏肠毒素(LT)的编码基因保守区，设计三对多重PCR引物，建立了快速检测ETEC多重PCR扩增系统，并应用此系统检测了一批菌株，现报告如下。
, http://www.100md.com
材料和方法
一、材料
(一)菌株 ETEC44813、ETEC19449、ETEC44815、EIEC6、ETEC44822、ETEC44823、E.coliDH5α、E.coli8099、S.flexneri 2a(T32)、Salmonella6503为军事医学科学院生物工程研究所提供。PSLM004、PMM030和H10907为中山医科大学提供。O1群霍乱弧菌和非O1群霍乱弧菌为本室保存。54株野生菌株为本室1990年从广州九佛镇现场收集。
(二) 试剂来源 Tris、dNTP、Taq酶和λDNA分子量参照标准购自华美生物工程公司，Dig-dUTP为Boehringer Mannheim公司产品，其余试剂均为分析纯。
(三) 引物 选择产生LT、STp和STh毒素的编码基因的保守区，自行设计3对多重PCR引物，扩增片段分别为LT(686bp)、STh(151bp)和STp(334bp)。
, 百拇医药
(四) 探针制备 采用PCR方法标记探针。
二、方法
(一) PCR扩增 挑取单个菌落接种于5mlLB中，37°C振荡1～2小时。取3μl菌液，10μl菌裂解液(5×PCR缓冲液、0.5%NP-40和0.5%吐温20)，10μl dNTP(2mmol/μl),6μl引物(0.2μmol/L),2μl MgCl2(15mmol/L),18μl去离子水和50μl石蜡油。经100°C煮沸裂解15分钟，再加入1μl Taq酶(1U/μl)。在DNA扩增仪中94°C变性1分钟，55°C退火2分钟，72°C延伸2分钟。30个循环后，72°C延伸5分钟。
(二) 引物测试 在上述PCR反应体系中，各加入LT、STp和STh引物2μl(0.2μmol/L)，不加标本DNA，同时以LT+、STp+和STh+菌株DNA为阳性对照，扩增条件同上。
, 百拇医药
(三) 菌落原位杂交 将硝酸纤维素滤膜上的待检工程菌落经裂解变性和中和固定后，37°C预杂交4小时，再经37°C杂交20小时。洗膜：用洗膜液Ⅰ(2×SSC、0.1%SDS)洗膜3次，每次5分钟，然后于42°C用洗膜液Ⅱ(1×SSC、0.1%SDS)洗膜2次，每次30分钟。最后加抗体和底物在室温26°C下显色6小时，观察结果。
(四) 应用 分别用单基因和多重PCR扩增系统检测本室54株ETEC，扩增条件同上。
(五) 扩增产物检测 取10～15μl扩增产物，加3μl溴酚蓝，1.0%琼脂糖凝胶电泳。稳压100V，25～50分钟，于紫外灯下观察结果。
结果
一、多重PCR扩增系统的建立
选择ETEC44815(LT)、ETEC44813(STp)和ETEC19449(STh)3个标准株作对照，采用拉丁方设计和热启动等技术逐步优化多重PCR反应系统。通过排列了所有的可能组合来比较扩增的特异性，即LT+STp(E)、LT+STh(F)、STh+STp(G)和LT+STh+STp(H)。结果显示ETEC44815、ETEC44813和ETEC19449均扩增出各自的特异带，阴性对照E.coli DH5α未见扩增带，见图1。
, http://www.100md.com
A:Marker λDNA/HindIII；B：LT(686bp)；C:STp(334bp)；D：STh(151bp)；E：LT+STp；F:LT+STh；G：STh+STp；H:LT+STh+STp；I：阴性对照(E.coli DH5α)
图1 三基因PCR扩增系统的建立
二、引物测试
3对引物混合后PCR扩增，未见特异DNA带，而阳性对照可见3条清晰的带，表明引物之间不会因互相干扰而形成假阳性。
三、引物扩增的特异性
选择ETEC44822、ETEC44823、EIEC6、E.coli 8099、S.flexneri 2a(T32)、Salmonella 6503、O1群霍乱弧菌和非O1群霍乱弧菌作此3对引物的特异性检测。除ETEC44822和ETEC44823有阳性扩增外，其余菌株均未见扩增带，证实3对引物在多重PCR扩增系统中具有高度的特异性。
, 百拇医药
四、菌落原位杂交
用此PCR标记的3个探针分别杂交三个工程株H10907(STp+)、PSLM004(STh+)和PMM030(LT+)，均获得阳性结果(未显示)。
五、多重PCR和单基因PCR相比
对54株ETEC菌株分别进行多基因PCR和单基因PCR检测，符合率为94.4%(51/54)。
六、现场收集菌株多重PCR结果
只产生一种毒素的ETEC扩增后只有1条特异DNA带；产生多种毒素的ETEC可见2条或3条特异性扩增带。54株ETEC含有多种毒力基因的株数为LT++STp+10株(18.5%)、LT++STh+10株(18.5%)、STp++STh+4株(7.4%)和LT++STp++STp+13株(24.1%)。
, http://www.100md.com
讨论
多重PCR是单基因PCR的发展和完善，是在同一PCR反应体系中加入多对特异性引物，1次扩增多个靶基因，实现多个基因型鉴别或多种病原体的同时检出。单基因PCR1次只能检测一种病原体或一个基因型别，基因分型或混合感染检测显得操作繁琐，费时且成本较高。多重PCR有效地解决了上述问题,使得混合感染的诊断和基因分型变得简捷，减少漏诊率，提高了检验效率[2]。
多重PCR与单基因PCR操作基本一样，只是在同一反应体系中同时加入几对引物，但对引物的设计和选择比常规PCR更严格。设计PCR引物的起始位置应考虑整个多重反应，灵活选择扩增区域的大小，使多重PCR反应产物很容易用琼脂糖凝胶电泳分离；多重PCR的寡核苷酸引物一般为23～28个碱基，较一般PCR的引物长，主要是引物在多重PCR扩增反应中应具有较高的特异性，各对引物的G+C含量应大致相近，使彼此的Tm不会相差太大；同时还必须充分考虑多对引物之间的关系，避免形成引物二聚体，如果它们之间形成粘性末端或部分双链，就会导致实验失败或假阳性。
, 百拇医药
ETEC是引起儿童和成人急性感染性腹泻的主要致病菌，在腹泻病原谱中居前三位，在旅游者腹泻中占首位[3]。ETEC在霍乱样腹泻患者中的检出率很高，在外环境和海产品中污染严重[4]。由于ETEC和一般大肠埃希菌用细菌培养和生化反应难以区分，血清鉴定又不够敏感和特异，故而主要通过检测肠毒素的有无来鉴定ETEC。目前检测肠毒素的方法主要有兔肠袢结扎试验、乳鼠灌胃法、CHO细胞培养法和ELISA等，操作繁杂，费时耗力，直接影响对本病的深入研究。应用此研究建立的多重PCR扩增系统，通过检测位于质粒上的编码肠毒素的毒力基因来检测ETEC，不仅敏感性特异性好，而且操作简便，同时也解决了单基因PCR扩增所带来的漏诊问题。多重PCR在混合感染的基因诊断和病原体的基因分型等研究领域有着广泛的应用前景，已有逐步取代单基因PCR的趋势。
本课题系全军“九五”指令性课题资助项目(96L032)
参考文献
, 百拇医药
1 Sandrina SP, James JM, Judith BW. Multiplex PCR assay and simple preparation method for stool specimens detect Enterotoxigenic Escherichia coli DNA during course of infection. J Clin Microbiol, 1995, 33：1045-1059.
2 郑兴武，肖桂元，戴盛明，等.多重聚合酶链反应检测淋病奈瑟菌等多种菌感染.中华医学检验杂志，1996，3：176-178.
3 Frankel G, Giron JA, Valmassoi J, et al. Multi-gene amplification: simultaneous detection of three virulence genes in diarrhoeal stool. Mol Microbiol, 1989, 3:1729-1734.
4 林成水，曾昭鸿，曾凝梅，等.国内产肠毒素大肠杆菌的发现和所进行的调查研究.中华流行病学杂志，1996，5：264-266.
收稿：1998-07-07 修回：1998-12-10, 百拇医药