氟联苯丙酸预防角膜移植免疫排斥反应的机制探讨
作者：李志杰 李 辰
单位：广州暨南大学组织移植与免疫中心、眼科学教研室 510632
关键词：氟比洛芬；角膜移植；移植物排斥
眼科990214 摘 要 在兔眼建立偏中心同种异体穿透性角膜移植模型。观察了局部使用氟联苯丙酸对角膜移植术后植片新生血管内生、病理反应和存活时间的影响。结果表明：与使用生理盐水的对照组相比，1%氟联苯丙酸生理盐水滴眼治疗组植片的存活时间显著延长，炎性细胞浸润减轻，新生血管反应显著下降。提示：氟联苯丙酸可能通过抑制炎症反应、减少新生血管和下调免疫反应来阻断排斥反应的发生，具有作为临床防治角膜移植免疫排斥反应辅助性药物的潜在性。
分类号 R779.65
Effects of flurbiprofen on eccentrically penetrating keratoplasty in rabbits/Li Zhijie …∥Ophthalmol CHN.-1999，8(2).-113～115(Institute of Tissue Transplantation and Immunology ＆ Department of Ophthalmology，Jinan University，Guangzhou 510632)
, http://www.100md.com
The effects of flurbiprofen，a cyclooxygenase inhibitor，on eccentrically penetrating keratoplasty was investigated.It was found that topical application of flurbiprofen reduced the corneal neovascular response and inflammatory infiltration induced by surgical trauma and sutures，and prolonged survival of corneal grafts.We concluded that flurbiprofen could be a useful therapeutic adjuvant to prevent corneal graft rejection.
Subject terms Flurbiprofen；Corneal transplantation；Graft rejection
, 百拇医药
最近的研究表明：发生角膜移植排斥反应前常伴有局部非特异性的炎症反应[1，2]。这种炎症背景一方面可导致并加速受体抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)对供体抗原的识别，另一方面构成诱导角膜新生血管化的前体条件[1]。另外，眼前节炎症所导致的血-房水屏障的开放，也可破坏或削弱眼前房的免疫赦免状态[3]。因此，阻断上述过程的发生可能是预防角膜移植排斥反应的有效途径。本文旨在观察新型环氧酶抑制剂氟联苯丙酸(flurbiprofen)对角膜移植排斥反应的预防作用，并探讨其作用机制。
1 材料与方法
1.1 动物和药物
新西兰白兔，重2.5～3.0kg，作为角膜移植受体；日本大耳白兔，重2.0～2.5kg，作为移植供体。氟联苯丙酸由美国Louisville大学Kentucky Lions眼科研究所Bhattacherjee教授惠赠。按所需浓度称取粉剂，加入生理盐水内，滴少量10%碳酸氢钠溶液，缓缓搅动，直至药物颗粒完全溶解，0.2μm微孔滤膜除菌，-20℃保存备用。根据文献[4]研究结果，本实验选用浓度为1%。
, 百拇医药
1.2 偏中心穿透性角膜移植术及排斥反应的评价
参照Liu等[5]的方法建立角膜移植模型。7mm环钻钻取供眼角膜植片，用10/0单丝尼龙缝线间断缝合于受眼距角巩缘1mm处偏中心同直径植孔。线结留植床侧以刺激新生血管生长。当出现下述一种或一种以上体征：(1)手术成功、维持透明至少7天的植片，出现部分或全部混浊；(2)上皮排斥线；(3)内皮排斥线，即可判定排斥反应发生。
1.3 角膜新生血管化的评价
分别在术后7、17、27天，在局麻下用两脚规从手术部位的角巩膜缘测量新生血管的内生情况。为了设计需要将其分为1～4级：1级，新生血管位于角巩膜缘区；2级，新生血管进入角膜，但<1mm；3级，1.25～3.00mm；4级，>3.25mm。
1.4 实验设计及动物分组
, 百拇医药
手术动物分为二组。第一组为正常对照组，共8只动物，术后术眼滴生理盐水；第二组为药物治疗组，共8只动物，术后滴1%氟联苯丙酸生理盐水，每日3次，1～2滴/次，连续用药至发生排斥反应。
1.5 组织学检查
常规角膜组织学制片，镜下观察病理改变。
2 结果
2.1 氟联苯丙酸延长角膜植片存活时间
与对照组相比，药物治疗组角膜植片的存活时间显著延长。结果见表1。
表1 氟联苯丙酸对角膜移植片存活的影响(n＝8) 组别
植片存活时间(天)
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对照组
药物组
25，30，22，27，34，28，27，30
35，40，28，38，37，40，>60，>60
27.9±3.4
42.3±10.8?
?与对照组相比，P<0.005
2.2 氟联苯丙酸抑制新生血管化
角膜移植术后，角膜新生血管化的程度逐渐增加。术后七天两组之间未见显著差异。术后17和27天，两组之间具有显著差异，其P值分别为<0.025和<0.05(见图1、2、3)。
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2.3 组织学改变
与对照排斥角膜相比，药物治疗组排斥角膜的炎性细胞浸润明显减轻(见图4，5)。
3 讨论
本实验结果表明：氟联苯丙酸具有减轻炎
性反应、抑制新生血管化、预防排斥反应发生和延长植片存活的作用。
氟联苯丙酸是一类新型的环氧酶抑制剂。其作用机制与消炎痛类药物相似，主要通过抑制环氧酶的活性来阻断前列腺素的合成。但与消炎痛相比，具有较强的血-房水屏障保护作用和眼前节炎症抑制作用。眼局部使用，可减轻自身免疫葡萄膜炎和角膜炎的多形核白细胞浸润[6，7]；对白细胞介素-1(IL-1)诱导的眼前节炎症反应也具有较强的抑制作用，可抑制虹膜睫状体的炎细胞浸润和渗出[8]。本实验发现，氟联苯丙酸治疗组动物的角膜移植片主要表现为慢性排斥反应，细胞浸润的数量显著减少。其他研究表明：角膜移植后，局部各种原因(如缝线刺激)所致的非特异性炎症反应是排斥反应的始动环节。其中最重要的原因是，伴随炎症反应的浸润炎细胞可分泌许多细胞因子，如IL-1、IL-2、γ-干扰素(γ-IFN)和肿瘤坏死因子(TNF)；这些因子一方面吸引更多的免疫活性细胞进入局部，另一方面诱导局部细胞表达MHC-Ⅱ类抗原，从而触发淋巴细胞对供体抗原的识别和攻击[1，2]。因此，抑制局部炎症反应可阻断上述的免疫识别环节。这可能是氟联苯丙酸预防角膜移植免疫排斥反应的主要机制。
, 百拇医药
环氧酶途径的代谢产物对免疫功能也有一定的影响，主要表现为加强MHC-Ⅱ类抗原和γ-IFN受体的表达，以及IL-1和IL-2的产生[9，10]。Jaramillo等[6]发现全身使用氟联苯丙酸既可抑制大鼠针对视网膜S抗原刺激的细胞免疫反应，又可抑制抗原特异性的体液免疫反应；另外，还可降低自身免疫性葡萄膜炎发病期间房水γ-IFN的水平。这提示：环氧酶途径的代谢产物参与了细胞和体液免疫反应的基本过程，氟联苯丙酸对该代谢途径的阻断在某些环节上有助于免疫反应的阻断性或下降性调节。该机制可部分解释本实验治疗组角膜移植片存活时间的延长。
角膜新生血管化常伴随淋巴管的侵入，从而加速了角膜内外免疫活性细胞和介质的交换，促使免疫排斥反应的发生[11]。与其他研究结果相一致，本实验发现氟联苯丙酸治疗组角膜新生血管的生长显著受到抑制。其机制可能与减轻局部炎细胞浸润和抑制炎症介质合成有关[4]。这可能是氟联苯丙酸延长角膜植片存活的另一主要原因。
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综上所述，氟联苯丙酸可能在多个环节上可以阻止角膜移植排斥反应的发生。据此，我们认为氟联苯丙酸可以作为预防和治疗角膜移植排斥反应的辅助性药物。
*本文为国家自然科学基金和广东省自然科学基金资助项目
4 参考文献
[1] 李志杰.角膜移植免疫排斥反应的研究现状.国外医学眼科学分册，1993，17：238.
[2] Holland EJ，Chan CC，Wetig P，et al.Clinical and immunohistologic studies of corneal rejection in the rat penetrating keratoplasty model.Cornea，1991，5：374.
[3] 李志杰.角膜移植免疫赦免和免疫排斥反应的实验研究.暨南大学博士研究生学位论 文.1994，100.
, http://www.100md.com
[4] Haynes WL，Proia AD，Klintworth GK，et al.Effect of inhibitors of arachidonic acid metabolism on corneal neovascularization in the rat.Invest Ophthalmol Vis Sci，1989，30：1588.
[5] Liu EY，Raizman MB，Rosner B，et al.Effects of blood transfusion and cyclosporine on cornea graft survival.Curr Eye Res，1989，8：523.
[6] Jaramillo A，Bhattacherjee P，Sonnenfeld G，et al.Modulation of immune responses by cyclo-oxygenase inhibitors during intraocular inflammation.Curr Eye Res，1992，11：571.
, 百拇医药
[7] Gretz DC，Lee TY，Kwitko S，et al.Topical antiinflammatory agents in an animal model of microbial keratitis.Arch Ophthalmol，1990，108：1001.
[8] 李志杰，李辰.环氧酶抑制剂对IL-1诱导眼内炎症和免疫反应的影响.暨南大学研究生学报，1993，9：69-72.
[9] Plescia OJ，Racis S.Prostaglandins as physiological immunoregulators.Prog Allergy，1988，44：153-171.
[10] Roal-Pleszcynski M.Immunoregulation by leukotrienes and other lipoxygenase metabolites.Immunol Today，1985，6：302-307.
[11] Collin HB.Corneal lymphatics in alloxan vascularized rabbit eyes.Invest Ophthalmol，1966，5：1.
(1997-01-16收稿), 百拇医药
单位：广州暨南大学组织移植与免疫中心、眼科学教研室 510632
关键词：氟比洛芬；角膜移植；移植物排斥
眼科990214 摘 要 在兔眼建立偏中心同种异体穿透性角膜移植模型。观察了局部使用氟联苯丙酸对角膜移植术后植片新生血管内生、病理反应和存活时间的影响。结果表明：与使用生理盐水的对照组相比，1%氟联苯丙酸生理盐水滴眼治疗组植片的存活时间显著延长，炎性细胞浸润减轻，新生血管反应显著下降。提示：氟联苯丙酸可能通过抑制炎症反应、减少新生血管和下调免疫反应来阻断排斥反应的发生，具有作为临床防治角膜移植免疫排斥反应辅助性药物的潜在性。
分类号 R779.65
Effects of flurbiprofen on eccentrically penetrating keratoplasty in rabbits/Li Zhijie …∥Ophthalmol CHN.-1999，8(2).-113～115(Institute of Tissue Transplantation and Immunology ＆ Department of Ophthalmology，Jinan University，Guangzhou 510632)
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The effects of flurbiprofen，a cyclooxygenase inhibitor，on eccentrically penetrating keratoplasty was investigated.It was found that topical application of flurbiprofen reduced the corneal neovascular response and inflammatory infiltration induced by surgical trauma and sutures，and prolonged survival of corneal grafts.We concluded that flurbiprofen could be a useful therapeutic adjuvant to prevent corneal graft rejection.
Subject terms Flurbiprofen；Corneal transplantation；Graft rejection
, 百拇医药
最近的研究表明：发生角膜移植排斥反应前常伴有局部非特异性的炎症反应[1，2]。这种炎症背景一方面可导致并加速受体抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)对供体抗原的识别，另一方面构成诱导角膜新生血管化的前体条件[1]。另外，眼前节炎症所导致的血-房水屏障的开放，也可破坏或削弱眼前房的免疫赦免状态[3]。因此，阻断上述过程的发生可能是预防角膜移植排斥反应的有效途径。本文旨在观察新型环氧酶抑制剂氟联苯丙酸(flurbiprofen)对角膜移植排斥反应的预防作用，并探讨其作用机制。
1 材料与方法
1.1 动物和药物
新西兰白兔，重2.5～3.0kg，作为角膜移植受体；日本大耳白兔，重2.0～2.5kg，作为移植供体。氟联苯丙酸由美国Louisville大学Kentucky Lions眼科研究所Bhattacherjee教授惠赠。按所需浓度称取粉剂，加入生理盐水内，滴少量10%碳酸氢钠溶液，缓缓搅动，直至药物颗粒完全溶解，0.2μm微孔滤膜除菌，-20℃保存备用。根据文献[4]研究结果，本实验选用浓度为1%。
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1.2 偏中心穿透性角膜移植术及排斥反应的评价
参照Liu等[5]的方法建立角膜移植模型。7mm环钻钻取供眼角膜植片，用10/0单丝尼龙缝线间断缝合于受眼距角巩缘1mm处偏中心同直径植孔。线结留植床侧以刺激新生血管生长。当出现下述一种或一种以上体征：(1)手术成功、维持透明至少7天的植片，出现部分或全部混浊；(2)上皮排斥线；(3)内皮排斥线，即可判定排斥反应发生。
1.3 角膜新生血管化的评价
分别在术后7、17、27天，在局麻下用两脚规从手术部位的角巩膜缘测量新生血管的内生情况。为了设计需要将其分为1～4级：1级，新生血管位于角巩膜缘区；2级，新生血管进入角膜，但<1mm；3级，1.25～3.00mm；4级，>3.25mm。
1.4 实验设计及动物分组
, 百拇医药
手术动物分为二组。第一组为正常对照组，共8只动物，术后术眼滴生理盐水；第二组为药物治疗组，共8只动物，术后滴1%氟联苯丙酸生理盐水，每日3次，1～2滴/次，连续用药至发生排斥反应。
1.5 组织学检查
常规角膜组织学制片，镜下观察病理改变。
2 结果
2.1 氟联苯丙酸延长角膜植片存活时间
与对照组相比，药物治疗组角膜植片的存活时间显著延长。结果见表1。
表1 氟联苯丙酸对角膜移植片存活的影响(n＝8) 组别
植片存活时间(天)
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对照组
药物组
25，30，22，27，34，28，27，30
35，40，28，38，37，40，>60，>60
27.9±3.4
42.3±10.8?
?与对照组相比，P<0.005
2.2 氟联苯丙酸抑制新生血管化
角膜移植术后，角膜新生血管化的程度逐渐增加。术后七天两组之间未见显著差异。术后17和27天，两组之间具有显著差异，其P值分别为<0.025和<0.05(见图1、2、3)。
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2.3 组织学改变
与对照排斥角膜相比，药物治疗组排斥角膜的炎性细胞浸润明显减轻(见图4，5)。
3 讨论
本实验结果表明：氟联苯丙酸具有减轻炎
性反应、抑制新生血管化、预防排斥反应发生和延长植片存活的作用。
氟联苯丙酸是一类新型的环氧酶抑制剂。其作用机制与消炎痛类药物相似，主要通过抑制环氧酶的活性来阻断前列腺素的合成。但与消炎痛相比，具有较强的血-房水屏障保护作用和眼前节炎症抑制作用。眼局部使用，可减轻自身免疫葡萄膜炎和角膜炎的多形核白细胞浸润[6，7]；对白细胞介素-1(IL-1)诱导的眼前节炎症反应也具有较强的抑制作用，可抑制虹膜睫状体的炎细胞浸润和渗出[8]。本实验发现，氟联苯丙酸治疗组动物的角膜移植片主要表现为慢性排斥反应，细胞浸润的数量显著减少。其他研究表明：角膜移植后，局部各种原因(如缝线刺激)所致的非特异性炎症反应是排斥反应的始动环节。其中最重要的原因是，伴随炎症反应的浸润炎细胞可分泌许多细胞因子，如IL-1、IL-2、γ-干扰素(γ-IFN)和肿瘤坏死因子(TNF)；这些因子一方面吸引更多的免疫活性细胞进入局部，另一方面诱导局部细胞表达MHC-Ⅱ类抗原，从而触发淋巴细胞对供体抗原的识别和攻击[1，2]。因此，抑制局部炎症反应可阻断上述的免疫识别环节。这可能是氟联苯丙酸预防角膜移植免疫排斥反应的主要机制。
, 百拇医药
环氧酶途径的代谢产物对免疫功能也有一定的影响，主要表现为加强MHC-Ⅱ类抗原和γ-IFN受体的表达，以及IL-1和IL-2的产生[9，10]。Jaramillo等[6]发现全身使用氟联苯丙酸既可抑制大鼠针对视网膜S抗原刺激的细胞免疫反应，又可抑制抗原特异性的体液免疫反应；另外，还可降低自身免疫性葡萄膜炎发病期间房水γ-IFN的水平。这提示：环氧酶途径的代谢产物参与了细胞和体液免疫反应的基本过程，氟联苯丙酸对该代谢途径的阻断在某些环节上有助于免疫反应的阻断性或下降性调节。该机制可部分解释本实验治疗组角膜移植片存活时间的延长。
角膜新生血管化常伴随淋巴管的侵入，从而加速了角膜内外免疫活性细胞和介质的交换，促使免疫排斥反应的发生[11]。与其他研究结果相一致，本实验发现氟联苯丙酸治疗组角膜新生血管的生长显著受到抑制。其机制可能与减轻局部炎细胞浸润和抑制炎症介质合成有关[4]。这可能是氟联苯丙酸延长角膜植片存活的另一主要原因。
, http://www.100md.com
综上所述，氟联苯丙酸可能在多个环节上可以阻止角膜移植排斥反应的发生。据此，我们认为氟联苯丙酸可以作为预防和治疗角膜移植排斥反应的辅助性药物。
*本文为国家自然科学基金和广东省自然科学基金资助项目
4 参考文献
[1] 李志杰.角膜移植免疫排斥反应的研究现状.国外医学眼科学分册，1993，17：238.
[2] Holland EJ，Chan CC，Wetig P，et al.Clinical and immunohistologic studies of corneal rejection in the rat penetrating keratoplasty model.Cornea，1991，5：374.
[3] 李志杰.角膜移植免疫赦免和免疫排斥反应的实验研究.暨南大学博士研究生学位论 文.1994，100.
, http://www.100md.com
[4] Haynes WL，Proia AD，Klintworth GK，et al.Effect of inhibitors of arachidonic acid metabolism on corneal neovascularization in the rat.Invest Ophthalmol Vis Sci，1989，30：1588.
[5] Liu EY，Raizman MB，Rosner B，et al.Effects of blood transfusion and cyclosporine on cornea graft survival.Curr Eye Res，1989，8：523.
[6] Jaramillo A，Bhattacherjee P，Sonnenfeld G，et al.Modulation of immune responses by cyclo-oxygenase inhibitors during intraocular inflammation.Curr Eye Res，1992，11：571.
, 百拇医药
[7] Gretz DC，Lee TY，Kwitko S，et al.Topical antiinflammatory agents in an animal model of microbial keratitis.Arch Ophthalmol，1990，108：1001.
[8] 李志杰，李辰.环氧酶抑制剂对IL-1诱导眼内炎症和免疫反应的影响.暨南大学研究生学报，1993，9：69-72.
[9] Plescia OJ，Racis S.Prostaglandins as physiological immunoregulators.Prog Allergy，1988，44：153-171.
[10] Roal-Pleszcynski M.Immunoregulation by leukotrienes and other lipoxygenase metabolites.Immunol Today，1985，6：302-307.
[11] Collin HB.Corneal lymphatics in alloxan vascularized rabbit eyes.Invest Ophthalmol，1966，5：1.
(1997-01-16收稿), 百拇医药