定量研究EB病毒潜在膜蛋白对人鼻咽癌细胞系CNE1的作用*
作者：张钦明 孙 宁 陈小毅
单位：广东医学院病理学教研室(湛江 524023)
关键词：电穿孔；鼻咽肿瘤；EBV-LMP；转染；图像处理，计算机辅助；细胞株/病理学
肿瘤990207 目的 研究EB病毒LMP对人高分化鼻咽癌细胞株CNE1细胞形态及DNA含量的影响。 方法 采用电穿孔基因转染技术，将重组EBV-LMP表达质粒转染鼻咽癌细胞株CNE1细胞。以载体质粒转染及CNE1细胞为对照，用免疫荧光和图像分析方法，观察细胞LMP表达、细胞形态及DNA含量的变化。 结果 LMP表达质粒转染后细胞浆及细胞膜LMP强阳性表达。形态定量及DNA含量测定表明，LMP表达后，CNE1细胞明显变小(P<0.01)，核浆比显著增大(P<0.01)，核浆的变化主要由胞浆面积的增减所致，而与核面积的改变则无明显正比关系；DNA含量明显增高(P<0.01/0.05)，且倍体分布更分散而右移。 结论 LMP对CNE1细胞生长有明显的促进作用，可致细胞恶性程度增高且分化受抑，有向低分化鳞癌发展倾向，提示LMP在NPC的发生发展过程及其演进中可能起重要作用。
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MORPHOLOGICAL QUANTITATIVE STUDY ON HUMAN
NASOPHARYNGEAL CARCINOMA CELL LINE CNE1
TRANFECTED WITH EB VIRUS LMP GENE
Zhang Qinming,Sun Ning, Chen Xiaoyi.Dept.of Pathology,Guangdong Medical College,Zhanjiang 524023
Objective：Effects on human nasopharyngeal carcinoma (NPC) cell line CNE1 transfected by EBV-LMP gene were studied.Methods：Electroporation was used to transfect LMP gene and the vector into CNE1 cells. Immunofluorescence technique (IFT) and image analysis technique were used. Results：:LMP gene was expressed stably on NPC CNE1 cells after transfection.The LMP expressive CNE1 cell showed that cytoplasmic area reduced significantly (P<0.01) with a higher nuclear/cytoplasm ratio(P<0.01),DNA content increased sufficiently (P<0.01/0.05),chromosomal ploidy presented a wider distribution and shifted to right.The nuclear/cytoplasm ratio change chiefly caused by the reduction of cytoplasm area,not by the nuclear area.Conclusion：The EBV-LMP can promote the growth of NPC CNE1 cells,resulted in higher malignancy and poorer differentiation.The CNE1 cells tends to change to low differentiated squamous cell carczinoma.These results indicated that LMP may have an important role on the progression of NPC cells.
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Key words Electroporation Nasopharyngeal neoplasms EBV-LMP Transfection Image processing,computer-assisted Differentiation Cell line/Pathology
EBV(Epstein-Barr Virus)与鼻咽癌(NPC)关系十分密切[1]，而LMP(Latent Membrane Protein)则是目前所知EBV基因编码的唯一具有转化上皮细胞活性的蛋白，它可降低某些啮齿类纤维母细胞株的血清依赖、接触抑制及停泊依赖性生长[2～3]；LMP的表达伴有子宫颈上皮细胞表型变化及对终末分化信号反应下降[4]。EBV-LMP在NPC发生发展中的作用及其作用机理如何，现在还不清楚。本文采用LMP表达质粒转染人高分化鼻咽癌细胞株(CNE1，不表达LMP的细胞)，观察LMP对其形态和DNA含量的影响。
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材料和方法
1.材料 CNE1癌细胞由本研究室提供；pCMVa载体质粒及pCMVa-LMP重组质粒由湖南医科大学肿瘤研究所陈主初教授惠赠；G481、LB培养基及PI(Propidium Iodide)，RPMI 1640培养液等均为美国Sigma公司产品；LMP(cs1-4)单克隆抗体、及FITC标记的二抗为丹麦DAKO公司生产；细胞电穿孔仪(Gene Pulser)美国Bio-RAD公司产品；TJTY-500型全自动图像分析系统(同济医科大学)。
2.质粒DNA的提取、鉴定及质粒转染见文献[5] C1组表示空白未经转染的CNE1细胞组；C1P组表示阴性对照组，即经转染pCMVa载体质粒的CNE1细胞组；C1L组表示实验组，即LMP表达质粒转染的CNE1细胞组。
3.LMP表达检测 将各组细胞涂片做LMP免疫荧光染色。同时设阳性(B95-8细胞)、阴性对照(一抗用PBS代替)。单抗皆1：50稀释。荧光显微镜下观察细胞LMP表达。
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4.细胞培养 分别将成功转染的癌细胞及CNE1癌细胞置入含15%小牛血清的RPMI 1640培养液(加青霉素100 kU/L和链霉素100 mg/L)常规培养，细胞长满瓶后收集备用。
5.细胞形态参数测定 细胞涂片HE染色后，参照文献[6]从涂片中随机选取5～10个视野，在图象监视器上显示图像，测定每个细胞的形态参数(胞面积、核面积、形状因子和核形状因子等)，并据胞面积和核面积计算出核浆比：
核浆比=核面积/(胞面积-核面积)
6.细胞DNA含量测定 参照文献[6]每组测100个细胞以上，同时测正常人鼻咽上皮细胞30个，取其DNA含量(积分光密度)平均值作为正常2倍体(2C)细胞的DNA标准值，换算肿瘤细胞的相对DNA含量倍体数(U值)，计算机作数值处理，绘出直方图。
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7.数据处理 本文数据资料采用医学统计学程序作方差分析、q检验及U检验。
结 果
1.LMP检测 LMP表达检测显示，C1组(空白组)及C1P组(对照组)LMP表达均阴性；C1L组(实验组)细胞膜及细胞浆显示强荧光，即LMP表达强阳性(见插页第3页图2)，说明转染成功。
图2 转染后CENI细胞LMP表达(免疫荧光染色)
2.转染前后细胞形态参数测定(见表1)
表1 各组细胞胞面积、核面积及核浆比值检测结果 细胞
胞浆面积(μm2)
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核面积(μm2)
核浆比值
C1
359.14±54.71
441.91±68.41
1.32±0.17
C1P
306.97±58.56
419.28±61.63
1.36±0.30
C1L
209.26±61.47
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373.87±75.70
2.03±0.22
(1)胞浆面积：CIL组胞浆面积显著减少(与C1，C1P相比P<0.01)；C1P组胞浆面积也较C1组小，但比较无显著性差异(P>0.05)，C1P组胞浆面积减小幅度没C1L组明显。
(2)核面积：C1L组核面积小于C1组(P<0.05)，C1P组的胞核面积虽然减小，但C1P组与C1组两两比较无显著性差异(P>0.05)，但与C1L组比较也无显著性差异(P>0.05)。
(3)核浆比：C1L组核浆比显著大于C1和C1P组(P<0.01)，说明CNE-1细胞经EBV-LMP表达质粒转染后，细胞的核浆比有升高趋势，结合胞浆面积的显著减小，可见CNE1细胞表达LMP有向恶性度升高、小细胞化的发展趋势；而C1P组尽管胞浆面积、胞核面积较C1组小，但无显著性差异，细胞核浆比无显著改变，与C1组相比P>0.05，说明载体质粒转染对CNE1细胞的恶性度无质的影响。
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(4)细胞形状因子：C1L组细胞形状因子为1.73±0.19，大于C1P(1.49±0.18)组(P<0.05)，而C1组为1.69±0.19，与C1L及C1P组比较无显著性差异(P>0.05)。
(5)核形状因子：C1L组核形状因子为1.83±0.32较C1组(1.67±0.19)增大，而C1P为1.57±0.17较C1则减小，两者有差异(P<0.01，P<0.05)，C1L与C1则无差别(P>0.05)。
3.细胞DNA含量及倍体分布特点 细胞DNA含量检测显示，C1L组DNA含量均值高于C1及C1P组(P<0.01，P<0.05)，C1组与C1P组比较则无显著性(P>0.05)。C1L组DNA含量直方图DNA倍体分布宽而分散，3～4C显著增多，达17.02%，5C为0.71%(见图2)；C1组及C1P组DNA倍体分布集中，左移至2C前部，3～4C比C1L组显著减少，C1组为5.88%，C1P为5.56%，两组都没有5C的细胞。
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图2 C1L组细胞DNA倍体分布直方图
*纵轴数值为百分率
讨 论
EBV与鼻咽癌的关系以往研究多着眼于NPC的发病学上，人们对EBV的研究多是基于其诱导恶性转化而设计的，所得出的大量结果也证明其与细胞的转化、增殖和去分化有关[1～3]。Dauwson等在转染LMP基因的人子宫颈永生化鳞状上皮细胞株实验表明，LMP的表达伴有上皮细胞表型变化，抑制上皮细胞终末分化，角蛋白表达下降，在功能上似激活的ras蛋白[4]，提示EBV参与NPC多阶段癌变，上皮细胞分化受抑制，停留在分化过程中的某一阶段，因而增加了对各种致癌因素的敏感性，为进一步完成恶性转化提供了条件。恶性肿瘤细胞的核染色体变化在于数量增减和结构畸变，其异常必将影响到细胞形态及DNA含量的变化，因此测试病变细胞形态参数和DNA含量及倍体分布，可作为直接反映肿瘤生长分化的重要生物学指标[6]，还有助于了解肿瘤生长分化过程中干系的选择情况[7]。
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本研究表明，CNE1及载体转染细胞为大细胞、低核浆比、高DNA含量且倍体分布宽而散的细胞群体，即为高分化鳞癌；LMP表达质粒转染后CNE-1细胞变小，DNA含量增高，且倍体分布更分散而右移，此结果与目前公认的恶性肿瘤细胞恶性程度越高，其DNA含量越高，倍体分布也越宽、越分散的变化规律一致。形态测量同时发现LMP表达质粒转染CNE1细胞后，核浆的变化主要由胞浆面积的增减所致，而与核面积的改变则无明显正比关系。核浆比一直是判断细胞分化程度的一个重要指标，它随肿瘤恶性程度增加而递增。本实验的结果表明在判断形态上差异较大的瘤细胞的增殖分化程度时，核浆比是一个良好的指标，优于其它形态参数。上述结果说明LMP表达质粒转染CNE1细胞后，使其形态参数、核浆比、DNA含量和倍体分布朝类似于低分化癌细胞的方向转变。结合有关文献报道的结果[2～3]，提示EBV-LMP的表达，可使CNE1细胞亚群发生变化，出现一个或几个优势的细胞亚群，亚群中细胞增殖能力增强而分化受抑制，从而影响整个细胞群体的生长分化。此外，观察细胞形状因子和核形状因子的改变，发现其在细胞转染前后变化不明显或与细胞的形态变化无一定的相关性，提示在细胞形态参数测定时，形状因子的测量不应作为衡量细胞的增殖分化状态的指标。本研究结果提示EBV-LMP可能在NPC演进过程中起重要作用，值得进一步深入研究。
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卫生部立项课题 编号：94-2-293
第一作者简介 张钦明，男，医学硕士，讲师。
参 考 文 献
1 郭忠民，吴枫，沈淑静，等.EB病毒及化学致癌物DNP对人胚鼻咽粘膜裸鼠移植的诱癌研究.北京实验动物科学，1992，9(4)：58
2 Fahraeus R,Rymo L,Phim JS, et al. Morphological transformation of human keratinocytes expressing the LMP gene of EBV.Nature,1990,345:447
3 Dawson CW,Eliopoulos AG,Dawson J, et al. EBV latent membrane protein inhibits human epithelial cell differentiation.Nature,1990,344:777
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4 Wang D,Liebowitz D, Kieff E ,et al. The trancated form of the EB virus latent-infection membrane protein expressed in virus replication does not transform rodent fibroblasts.J Virol,1988,62:2337
5 张钦明，孙宁，陈小毅.电穿孔技术在EBV-LMP表达质粒转染人鼻咽癌细胞中的应用.广东医学院学报，1997，3：205
6 王栩.DNA计量分析、正常二倍体参照细胞及校正因子.中华病理学杂志，1995，24(6)：390
7 张中华，徐元鼎.肝癌细胞核形态的分形分析.中国体视学与图像分析，1996，1(1)：81
(收稿：1997-08-12 修回：1998-05-19), 百拇医药
单位：广东医学院病理学教研室(湛江 524023)
关键词：电穿孔；鼻咽肿瘤；EBV-LMP；转染；图像处理，计算机辅助；细胞株/病理学
肿瘤990207 目的 研究EB病毒LMP对人高分化鼻咽癌细胞株CNE1细胞形态及DNA含量的影响。 方法 采用电穿孔基因转染技术，将重组EBV-LMP表达质粒转染鼻咽癌细胞株CNE1细胞。以载体质粒转染及CNE1细胞为对照，用免疫荧光和图像分析方法，观察细胞LMP表达、细胞形态及DNA含量的变化。 结果 LMP表达质粒转染后细胞浆及细胞膜LMP强阳性表达。形态定量及DNA含量测定表明，LMP表达后，CNE1细胞明显变小(P<0.01)，核浆比显著增大(P<0.01)，核浆的变化主要由胞浆面积的增减所致，而与核面积的改变则无明显正比关系；DNA含量明显增高(P<0.01/0.05)，且倍体分布更分散而右移。 结论 LMP对CNE1细胞生长有明显的促进作用，可致细胞恶性程度增高且分化受抑，有向低分化鳞癌发展倾向，提示LMP在NPC的发生发展过程及其演进中可能起重要作用。
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MORPHOLOGICAL QUANTITATIVE STUDY ON HUMAN
NASOPHARYNGEAL CARCINOMA CELL LINE CNE1
TRANFECTED WITH EB VIRUS LMP GENE
Zhang Qinming,Sun Ning, Chen Xiaoyi.Dept.of Pathology,Guangdong Medical College,Zhanjiang 524023
Objective：Effects on human nasopharyngeal carcinoma (NPC) cell line CNE1 transfected by EBV-LMP gene were studied.Methods：Electroporation was used to transfect LMP gene and the vector into CNE1 cells. Immunofluorescence technique (IFT) and image analysis technique were used. Results：:LMP gene was expressed stably on NPC CNE1 cells after transfection.The LMP expressive CNE1 cell showed that cytoplasmic area reduced significantly (P<0.01) with a higher nuclear/cytoplasm ratio(P<0.01),DNA content increased sufficiently (P<0.01/0.05),chromosomal ploidy presented a wider distribution and shifted to right.The nuclear/cytoplasm ratio change chiefly caused by the reduction of cytoplasm area,not by the nuclear area.Conclusion：The EBV-LMP can promote the growth of NPC CNE1 cells,resulted in higher malignancy and poorer differentiation.The CNE1 cells tends to change to low differentiated squamous cell carczinoma.These results indicated that LMP may have an important role on the progression of NPC cells.
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Key words Electroporation Nasopharyngeal neoplasms EBV-LMP Transfection Image processing,computer-assisted Differentiation Cell line/Pathology
EBV(Epstein-Barr Virus)与鼻咽癌(NPC)关系十分密切[1]，而LMP(Latent Membrane Protein)则是目前所知EBV基因编码的唯一具有转化上皮细胞活性的蛋白，它可降低某些啮齿类纤维母细胞株的血清依赖、接触抑制及停泊依赖性生长[2～3]；LMP的表达伴有子宫颈上皮细胞表型变化及对终末分化信号反应下降[4]。EBV-LMP在NPC发生发展中的作用及其作用机理如何，现在还不清楚。本文采用LMP表达质粒转染人高分化鼻咽癌细胞株(CNE1，不表达LMP的细胞)，观察LMP对其形态和DNA含量的影响。
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材料和方法
1.材料 CNE1癌细胞由本研究室提供；pCMVa载体质粒及pCMVa-LMP重组质粒由湖南医科大学肿瘤研究所陈主初教授惠赠；G481、LB培养基及PI(Propidium Iodide)，RPMI 1640培养液等均为美国Sigma公司产品；LMP(cs1-4)单克隆抗体、及FITC标记的二抗为丹麦DAKO公司生产；细胞电穿孔仪(Gene Pulser)美国Bio-RAD公司产品；TJTY-500型全自动图像分析系统(同济医科大学)。
2.质粒DNA的提取、鉴定及质粒转染见文献[5] C1组表示空白未经转染的CNE1细胞组；C1P组表示阴性对照组，即经转染pCMVa载体质粒的CNE1细胞组；C1L组表示实验组，即LMP表达质粒转染的CNE1细胞组。
3.LMP表达检测 将各组细胞涂片做LMP免疫荧光染色。同时设阳性(B95-8细胞)、阴性对照(一抗用PBS代替)。单抗皆1：50稀释。荧光显微镜下观察细胞LMP表达。
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4.细胞培养 分别将成功转染的癌细胞及CNE1癌细胞置入含15%小牛血清的RPMI 1640培养液(加青霉素100 kU/L和链霉素100 mg/L)常规培养，细胞长满瓶后收集备用。
5.细胞形态参数测定 细胞涂片HE染色后，参照文献[6]从涂片中随机选取5～10个视野，在图象监视器上显示图像，测定每个细胞的形态参数(胞面积、核面积、形状因子和核形状因子等)，并据胞面积和核面积计算出核浆比：
核浆比=核面积/(胞面积-核面积)
6.细胞DNA含量测定 参照文献[6]每组测100个细胞以上，同时测正常人鼻咽上皮细胞30个，取其DNA含量(积分光密度)平均值作为正常2倍体(2C)细胞的DNA标准值，换算肿瘤细胞的相对DNA含量倍体数(U值)，计算机作数值处理，绘出直方图。
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7.数据处理 本文数据资料采用医学统计学程序作方差分析、q检验及U检验。
结 果
1.LMP检测 LMP表达检测显示，C1组(空白组)及C1P组(对照组)LMP表达均阴性；C1L组(实验组)细胞膜及细胞浆显示强荧光，即LMP表达强阳性(见插页第3页图2)，说明转染成功。
图2 转染后CENI细胞LMP表达(免疫荧光染色)
2.转染前后细胞形态参数测定(见表1)
表1 各组细胞胞面积、核面积及核浆比值检测结果 细胞
胞浆面积(μm2)
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核面积(μm2)
核浆比值
C1
359.14±54.71
441.91±68.41
1.32±0.17
C1P
306.97±58.56
419.28±61.63
1.36±0.30
C1L
209.26±61.47
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373.87±75.70
2.03±0.22
(1)胞浆面积：CIL组胞浆面积显著减少(与C1，C1P相比P<0.01)；C1P组胞浆面积也较C1组小，但比较无显著性差异(P>0.05)，C1P组胞浆面积减小幅度没C1L组明显。
(2)核面积：C1L组核面积小于C1组(P<0.05)，C1P组的胞核面积虽然减小，但C1P组与C1组两两比较无显著性差异(P>0.05)，但与C1L组比较也无显著性差异(P>0.05)。
(3)核浆比：C1L组核浆比显著大于C1和C1P组(P<0.01)，说明CNE-1细胞经EBV-LMP表达质粒转染后，细胞的核浆比有升高趋势，结合胞浆面积的显著减小，可见CNE1细胞表达LMP有向恶性度升高、小细胞化的发展趋势；而C1P组尽管胞浆面积、胞核面积较C1组小，但无显著性差异，细胞核浆比无显著改变，与C1组相比P>0.05，说明载体质粒转染对CNE1细胞的恶性度无质的影响。
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(4)细胞形状因子：C1L组细胞形状因子为1.73±0.19，大于C1P(1.49±0.18)组(P<0.05)，而C1组为1.69±0.19，与C1L及C1P组比较无显著性差异(P>0.05)。
(5)核形状因子：C1L组核形状因子为1.83±0.32较C1组(1.67±0.19)增大，而C1P为1.57±0.17较C1则减小，两者有差异(P<0.01，P<0.05)，C1L与C1则无差别(P>0.05)。
3.细胞DNA含量及倍体分布特点 细胞DNA含量检测显示，C1L组DNA含量均值高于C1及C1P组(P<0.01，P<0.05)，C1组与C1P组比较则无显著性(P>0.05)。C1L组DNA含量直方图DNA倍体分布宽而分散，3～4C显著增多，达17.02%，5C为0.71%(见图2)；C1组及C1P组DNA倍体分布集中，左移至2C前部，3～4C比C1L组显著减少，C1组为5.88%，C1P为5.56%，两组都没有5C的细胞。
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图2 C1L组细胞DNA倍体分布直方图
*纵轴数值为百分率
讨 论
EBV与鼻咽癌的关系以往研究多着眼于NPC的发病学上，人们对EBV的研究多是基于其诱导恶性转化而设计的，所得出的大量结果也证明其与细胞的转化、增殖和去分化有关[1～3]。Dauwson等在转染LMP基因的人子宫颈永生化鳞状上皮细胞株实验表明，LMP的表达伴有上皮细胞表型变化，抑制上皮细胞终末分化，角蛋白表达下降，在功能上似激活的ras蛋白[4]，提示EBV参与NPC多阶段癌变，上皮细胞分化受抑制，停留在分化过程中的某一阶段，因而增加了对各种致癌因素的敏感性，为进一步完成恶性转化提供了条件。恶性肿瘤细胞的核染色体变化在于数量增减和结构畸变，其异常必将影响到细胞形态及DNA含量的变化，因此测试病变细胞形态参数和DNA含量及倍体分布，可作为直接反映肿瘤生长分化的重要生物学指标[6]，还有助于了解肿瘤生长分化过程中干系的选择情况[7]。
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本研究表明，CNE1及载体转染细胞为大细胞、低核浆比、高DNA含量且倍体分布宽而散的细胞群体，即为高分化鳞癌；LMP表达质粒转染后CNE-1细胞变小，DNA含量增高，且倍体分布更分散而右移，此结果与目前公认的恶性肿瘤细胞恶性程度越高，其DNA含量越高，倍体分布也越宽、越分散的变化规律一致。形态测量同时发现LMP表达质粒转染CNE1细胞后，核浆的变化主要由胞浆面积的增减所致，而与核面积的改变则无明显正比关系。核浆比一直是判断细胞分化程度的一个重要指标，它随肿瘤恶性程度增加而递增。本实验的结果表明在判断形态上差异较大的瘤细胞的增殖分化程度时，核浆比是一个良好的指标，优于其它形态参数。上述结果说明LMP表达质粒转染CNE1细胞后，使其形态参数、核浆比、DNA含量和倍体分布朝类似于低分化癌细胞的方向转变。结合有关文献报道的结果[2～3]，提示EBV-LMP的表达，可使CNE1细胞亚群发生变化，出现一个或几个优势的细胞亚群，亚群中细胞增殖能力增强而分化受抑制，从而影响整个细胞群体的生长分化。此外，观察细胞形状因子和核形状因子的改变，发现其在细胞转染前后变化不明显或与细胞的形态变化无一定的相关性，提示在细胞形态参数测定时，形状因子的测量不应作为衡量细胞的增殖分化状态的指标。本研究结果提示EBV-LMP可能在NPC演进过程中起重要作用，值得进一步深入研究。
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卫生部立项课题 编号：94-2-293
第一作者简介 张钦明，男，医学硕士，讲师。
参 考 文 献
1 郭忠民，吴枫，沈淑静，等.EB病毒及化学致癌物DNP对人胚鼻咽粘膜裸鼠移植的诱癌研究.北京实验动物科学，1992，9(4)：58
2 Fahraeus R,Rymo L,Phim JS, et al. Morphological transformation of human keratinocytes expressing the LMP gene of EBV.Nature,1990,345:447
3 Dawson CW,Eliopoulos AG,Dawson J, et al. EBV latent membrane protein inhibits human epithelial cell differentiation.Nature,1990,344:777
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4 Wang D,Liebowitz D, Kieff E ,et al. The trancated form of the EB virus latent-infection membrane protein expressed in virus replication does not transform rodent fibroblasts.J Virol,1988,62:2337
5 张钦明，孙宁，陈小毅.电穿孔技术在EBV-LMP表达质粒转染人鼻咽癌细胞中的应用.广东医学院学报，1997，3：205
6 王栩.DNA计量分析、正常二倍体参照细胞及校正因子.中华病理学杂志，1995，24(6)：390
7 张中华，徐元鼎.肝癌细胞核形态的分形分析.中国体视学与图像分析，1996，1(1)：81
(收稿：1997-08-12 修回：1998-05-19), 百拇医药