组织蛋白酶D表达与乳腺癌的关系
作者：袁建达 邵志敏 韩企夏 沈镇宙
单位：上海医科大学肿瘤医院外科分子生物学实验室(上海 200032)
关键词：乳腺肿瘤；组织蛋白酶D；侵袭；肿瘤转移；预后
肿瘤990202 目的 研究组织蛋白酶D(Cath-D)对乳腺癌侵袭、转移和预后的作用。 方法 采用免疫组织化学亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)法，检测105例乳腺癌石蜡切片中肿瘤细胞(实质)和间质细胞组织蛋白酶D的表达，结合临床和病理资料分析其作用。 结果 组织蛋白酶D主要定位于细胞浆，部分增生的细胞可见定位于细胞核，间质细胞与实质细胞的Cath-D的定位基本相似。间质细胞以肿瘤周围的间质细胞组织蛋白酶D的表达量为高。Cath-D在乳腺癌实质和间质中总的表达率分别为49.5%(52/105)，56.2%(59/105)。实质Cath-D的表达与肿瘤细胞组织浸润、肿瘤大小、腋淋巴结转移、随访结果有关(P<0.05)；与乳腺癌组织学分类、组织学分型、分级、年龄、ER、PR状态、局部复发、远处转移无关。间质Cath-D的表达与乳腺癌肿瘤大小、腋淋巴结转移、局部复发、远处转移、年龄、ER、PR状态、局部复发无关。实质与间质Cath-D的表达和乳腺癌患者的无瘤生存率有关(P<0.05)；实质Cath-D表达与总生存率无关(P>0.05)，而间质的Cath-D与总生存率有关(P<0.05)。 结论 实质和间质乳腺癌组织蛋白酶D的表达都和侵袭、转移和预后有关。实质Cath-D反映肿瘤细胞的侵袭能力，而间质的Cath-D与远处转移和预后有关。间质Cath-D与实质Cath-D密切相关，相对而言，间质的Cath-D更能代表乳腺癌细胞的侵袭和转移的能力。组织蛋白酶D可作为一个与乳腺癌预后密切相关的预后指标。
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CATHEPSIN D AND PROGNOSIS IN BREAST CANCER
Yuan Jianda,Shao Zhiming,Han Qixia,et al.Department of Surgery,Cancer Hospital,Shanghai Medical University,Shanghai 200032
Objective：To study the effect of Cathepsin D(Cath-D) on breast cancer invasion, metastasis and prognosis.Methods：By means of ABC test, 105 breast cancer specimens in paraffin sections were examined for the expression of Cath-D.Results：Cath-D protein was detected in cancer cell cytoplasm;the expression rates in cancer cells and in stromal cells were 49.5% (52/105) and 56.2%(59/105) respectively.Expression of Cath-D in cancer cells was correlated to its invasiveness,bigger tumor size,higher axillary lymph node involvement and poorer prognosis(P<0.05)，but not with those pathologic typing,grading,age,ER and PR status,local recurrence and distant metastasis.Expression of Cath-D in stromal cells was associated with bigger tumor size,axillary lymph node metastasis,regional recurrence,distant metastasis and poorer prognosis(P<0.05).Conclusion：The neoplastic and stromal cathepsin D are neglected immunohistochemical prognostic parameters.They play a pivotal role in the invasion and breast cancer metastasis.It shows that cathepsin D,specially stromal catepsin D,induces breast cancer metastasis and influences the prognosis of patients.
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Key words Breast tumor Cathepsin D Invasion Neoplasm metastasis Prognosis
乳腺癌的远处转移是导致乳腺癌临床治疗失败的主要原因。乳腺癌的远处转移是一个复杂的多步骤的过程，涉及肿瘤细胞运动、基质膜降解、肿瘤细胞与宿主细胞的粘附、转移灶新生血管的形成等。组织蛋白酶D(Cath-D)作为一个基质膜降解酶在肿瘤的转移中起重要作用。晚近，许多研究表明Cath-D与肺癌、肠癌、肝癌的转移有关[2～5]。本研究应用免疫组织化学方法检测肿瘤细胞(实质)与间质细胞中Cath-D的表达，探讨实质与间质的Cath-D在乳腺癌侵袭、转移中的作用，了解其临床意义。
材料和方法
一、材料
上海医科大学肿瘤医院1988～1989年手术切除的乳腺癌标本105例，术前未曾接受放疗和化疗。随访时间在2～9年，中位随访期5.1年，均为女性病例，年龄为25～78岁，平均年龄52.84岁。
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每个病例均具有完整的临床病史资料，病理诊断和随访资料。参照《中国常见恶性肿瘤诊治规范第八分册乳腺癌》的标准，进行病理诊断，观察组织学分型、组织学分类、组织学分级和组织浸润等指标。组织学分级按Scarff-Bloom-Richardson法分为：1.组织分化程度(以腺管的形成为主要依据)，高分化为1分，中分化为2分，低分化为3分；2.核多形性：按轻、中、重分别定为1、2、3分；3.核分裂相：1～10个/10个高倍视野(HPF)为1分，11～20个/10个HPF为2分，>21个/10个HPF为3分。将以上三方面得分相加，确定病理分级：1级(3～5分)为分化好，Ⅱ级(6～7分)为分化中，及Ⅲ级(8～9分)为分化差。病理分类：特殊型和非特殊型。组织浸润分：肿瘤边界清楚为Ⅰ级，癌瘤周边界部分清楚为Ⅱ级，癌瘤周边与周围组织分界不清楚，呈浸润性生长为Ⅲ级。无腋淋巴结转移为(-)组，1～3个腋淋巴结转移为(+)组，大于3个为()组。随访结果分：健在、带癌和死亡。所有死亡病例均死于乳腺癌。
二、方法
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1、试剂
组织蛋白酶D CH18-0109多克隆抗体购于上海中达公司，ABC试剂盒Vector产品。
2、免疫组织化学染色
应用Hsu等[1]免疫组化方法染色，石蜡切片制成5 μm，依次二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，0.05%胰酶消化，37 ℃ 20 min，0.03% H2O2封闭内源性过氧化物酶，室温10 min，5% 小牛血清温育，室温20 min，加入一抗50 μl，4 ℃冰箱过夜，PBS洗3次，加入生物素化马抗鼠IgG 50 μl，4℃冰箱过夜，PBS洗3次，加入生物素化马抗鼠IgG 50 μl，37℃ 1 h，PBS洗3次，加入SABC试剂50 μl，37 ℃30 min，PBS洗3次，0.04% DAB-0.03% H2O2室温显微镜下控制显色5 min。由于组织蛋白酶D部分定位于细胞核，故未用苏木素复染，清水洗涤后常规脱水、透明，封片。
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3、阳性染色反应分级判断标准
以细胞浆或细胞核出现棕色颗粒为阳性细胞。根据细胞浆阳性综色颗粒的着色深浅，将染色强度分为(Ⅰ)无反应或微弱反应；(Ⅱ)棕色反应；(Ⅲ)深棕色反应三组，计算(Ⅱ)、(Ⅲ)两组每例切片5个高倍视野中阳性染色反应细胞的百分率，并将(Ⅰ)组病例数归入染色反应(-)组，最后确定组织蛋白酶D染色反应半定量分级：(-)为0～25%，(+)为26～74%，(++)为75～100%。实验中去一抗作为阴性对照，同时应用MCF-7人乳腺癌细胞爬片染色作为阳性对照。
三、统计学分析
采用上海医科大学流行病学教研室Epi Info(5.0板本)统计软件进行χ2检验，比较组织蛋白酶D表达水平与乳腺癌临床及病理指标的关系。应用Kaplan Meier寿命表法计算总生存率和无瘤生存率。P<0.05认为具有统计学意义。
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结 果
一、组织蛋白酶D的定位及表达水平
免疫组化染色的结果，105例乳腺癌实质与间质细胞组织蛋白酶D均定位于细胞浆、部分定位于细胞核，其染色强度和阳性细胞百分率明显不同，呈异质性分布。癌旁乳腺良性病变组织蛋白酶D的定位和乳腺癌细胞相似(见插页第3页图1)。
图1 实质与间质Cath-D在乳腺癌细胞浆上阳性表达(SABC法×400),中央区为阳性肿瘤细胞,肿瘤周边间质细胞阳性表达
表1 实质和间质Cath-D蛋白表达水平与病理指标的关系 临床病理指标
例数
实质Cath-D表达
, 百拇医药
阳性率
(%)
χ2值
P
间质Cath-D表达
阳性率
(%)
χ2值
P
-
+
++
-
, 百拇医药
+
++
组织学分类
髓样癌
12
7
1
4
41.7%
6
4
2
50%
腺癌
, http://www.100md.com
5
5
0
0
0%
3
1
1
40%
单纯癌
32
14
9
9
, http://www.100md.com
57.6%
12
12
8
62.5%
Pagets病
3
3
0
0
0%
18.08
0.2083
, 百拇医药
3
0
0
0%
16.80
0.5334
浸润性导管癌
42
20
8
14
52.4%
(v=14)
, 百拇医药
20
10
12
52.4%
(v=14)
小叶癌
4
2
2
0
50%
1
3
0
, 百拇医药
75%
浸润性小叶癌
2
0
1
1
100%
0
1
1
100%
其它类型
5
2
, 百拇医药
2
1
60%
2
3
0
60%
组织学分型
特殊型
92
45
20
27
51.1%
, http://www.100md.com
1.17
0.5562
38
31
23
58.7%
3.87
0.1441
非特殊型
13
8
3
2
, http://www.100md.com
38.5%
(v=2)
9
3
1
30.8%
(v=2)
组织学分级
Ⅰ级
62
33
15
14
, http://www.100md.com
46.8%
32
19
11
48.4%
Ⅱ级
34
19
4
11
44.1%
8.65
0.0703
, 百拇医药
12
11
11
64.7%
4.11
0.3915
Ⅲ级
9
1
4
4
88.9%
(v=4)
, 百拇医药
3
4
2
66.7%
(v=4)
组织浸润
Ⅰ级
43
28
9
6
34.9%
26
, 百拇医药 12
5
39.5%
Ⅱ级
40
20
8
12
50%
15.08
0.0196
15
13
12
, http://www.100md.com
62.5%
11.38
Ⅲ级
21
4
6
11
81.0%
(v=6)
5
9
7
76.2%
, 百拇医药 (v=6)
0.047
Ⅳ级
1
1
0
0
0%
1
0
0
0%
表2 实质和间质Cath-D蛋白的表达水平与临床指标的关系 临床病理指标
, 百拇医药
例数
实质Cath-D表达
阳性率
(%)
χ2值
P
间质Cath-D表达
阳性率
(%)
χ2值
P
-
+
, http://www.100md.com
++
-
+
++
年龄
≤40
20
10
3
7
50%
5
8
7
, 百拇医药
75%
40～60
53
26
12
15
50.9%
1.44
0.8371
28
15
10
47.2%
, http://www.100md.com
4.87
0.3013
>60
32
17
8
7
46.9%
(v=4)
14
11
7
56.3%
, http://www.100md.com
(v=4)
肿瘤大小
<3 cm
56
34
13
9
39.3%
8.38
0.0151
31
13
12
, http://www.100md.com
44.6%
6.85
0.0325
≥3 cm
49
19
10
20
61.2%
(v=2)
15
15
19
, 百拇医药
57.6%
(v=2)
腋淋巴结转移
-
48
36
8
4
25%
31
12
5
35.4%
, 百拇医药 +
28
11
9
8
60.7%
30.04
0.004
9
14
5
67.9%
23.42
0.0001
, http://www.100md.com
++
29
6
6
17
79.3%
(v=4)
7
8
14
75.9%
(v=4)
ER状态
, 百拇医药 -
54
28
11
15
48.2%
0.16
0.9221
23
19
12
57.4%
0.41
, 百拇医药 0.8160
+
51
25
12
14
51.0%
(v=2)
24
15
12
52.9%
(v=2)
, 百拇医药 PR状态
-
72
35
19
18
52.1%
2.83
0.2430
33
23
16
54.2%
, http://www.100md.com 0.11
0.9452
+
33
18
4
11
45.5%
(v=2)
14
11
8
49.4%
, 百拇医药 (v=2)
局部复发
无
94
50
20
24
46.8%
2.89
0.2360
42
32
20
, 百拇医药 55.3%
1.75
0.4174
有
11
3
3
5
72.7%
(v=2)
5
2
4
54.5%
, http://www.100md.com
(v=2)
远处转移
无
77
42
18
17
45.4%
4.44
0.1085
38
26
13
, http://www.100md.com
50.6%
6.04
0.0488
有
28
11
5
12
60.7%
(v=2)
9
8
11
, 百拇医药
67.9%
(v=2)
随访结果
健在
81
46
18
17
43.2%
42
26
13
48.1%
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带癌
14
5
2
7
64.3%
9.40
0.0518
2
4
8
85.7%
13.61
, 百拇医药 0.0086
死亡
10
2
3
5
80%
(v=4)
3
4
3
70%
(v=4)
二、组织蛋白酶D实质表达和病理指标的关系
, 百拇医药
乳腺癌实质组织蛋白酶D表达与乳腺癌组织浸润有关(P<0.05)；而与组织学分型、分类、分级无关(P>0.05 见表1)。表中其它病理类型包括硬癌、粘液腺癌、乳头状腺癌、大汗腺癌、鳞状细胞癌各1例。虽然实质组织蛋白酶D的表达与组织学分级无关，P=0.0703，若增加样本，可能会证实两者的相关性。
三、间质组织蛋白酶D表达和病理指标的关系
乳腺癌间质组织蛋白酶D的表达与组织学分型、分级、分类都无关，但与组织浸润有关(P=0.047 见表1)。
四、实质组织蛋白酶D表达水平与临床指标的关系
Cath-D蛋白实质表达水平与乳腺癌肿瘤大小、腋淋巴结转移、随访结果有关(P<0.05)，与病人的年龄、ER、PR、局部复发、远处转移无关(P>0.05 见表2)。
, 百拇医药
图1 105例乳腺癌组织实质Cath-D蛋白表达与预后
Kaplan-Meier生存曲线分析：实质Cath-D蛋白阴性表达者无瘤生存率明显高于阳性表达者(P<0.05)。
图2 105例乳腺癌组织实质Cath-D蛋白表达与预后
Kaplan-Meier生存曲线分析：实质Cath-D蛋白的表达阴性者的总生存率与阳性表达者无明显差别(P>0.05)。
五、间质组织蛋白酶D表达水平与临床指标的关系
间质Cath-D蛋白的表达水平与肿瘤大小、腋淋巴结转移、肿瘤远处转移、随访结果有关(P<0.05)，与病人的年龄、ER、PR、局部复发无关(P>0.05见表2)。
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六、实质与间质组织蛋白酶D表达的相关性
经相关性检验的结果发现实质与间质的组织蛋白酶D的表达密切相关。(P<0.01见表3)。
表3 实质Cath-D与间质Cath-D表达的相关性 实质
Cath-D
例数
间质Cath-D表达
χ2值
P值
-(%)
+(%)
++(%)
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-
53
33
14
6
+
23
9
11
3
25.62
0.0000
++
29
, 百拇医药
5
9
15
(v=4)
合计
105
47
34
24
图3 105例乳腺癌组织间质Cath-D蛋白表达与预后
Kaplan-Meier生存曲线分析：间质Cath-D蛋白阴性表达者无瘤生存率明显高于阳性表达者(P<0.05)。
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图4 105例乳腺癌组织间质Cath-D蛋白表达与预后
Kaplan-Meier生存曲线分析：间质Cath-D蛋白的表达阴性者的总生存率与阳性表达者差别具有统计学意义(P<0.05)。
七、组织蛋白酶D与预后的关系
应用Kaplan-Meier计算105例乳腺癌患者的无瘤生存率与总生存率，结果显示Cath-D实质和间质表达均与无瘤生存率有关(P<0.05)；实质表达与总生存率无关(P>0.05)，而间质表达与总生存率有关(P<0.05 见图1～4)。
讨 论
基质膜降解是肿瘤转移的一个重要过程，诸多基质蛋白酶在基质膜降解过程中起着重要作用。Cath-D是一种酸性溶酶体蛋白酶，它可以以多种状态存在，分泌53 kD的酶原，酶原无生物学活性，在一定的pH值(2.8-4.0)环境下，经降解为两条肽链48 kD的活性分子，并予加工修饰为34 kD、14 kD的肽链片段。组织蛋白酶D在动物和人体中呈异质性分布，不同的器官和组织中组织蛋白酶D的类型及含量各不相同。生理状态下组织蛋白酶D参与许多机体蛋白、活性多肽的降解过程，从而实现其功能[2]。
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近年来的研究发现组织蛋白酶D与卵巢癌、黑素瘤、尤其是乳腺癌的浸润、转移有关[3]。应用生化法检测乳腺癌中组织蛋白酶D，结果发现它的含量与乳腺癌的转移及预后有关[4，5]；经免疫组织化学法检测乳腺癌标本中组织蛋白酶D的表达，结果发现间质细胞组织蛋白酶D表达与乳腺癌的侵袭、转移有关[6，7]。Garcia[8]等采用DNA转染技术将组织蛋白酶D cDNA转至低表达组织蛋白酶D的乳腺癌细胞株中，结果经转染后的细胞与对照的细胞相比，其转移和浸润能力明显提高。因此推测实质或间质的组织蛋白酶D降解基质膜，从而促进肿瘤细胞的转移。晚近，Garcia[9]等发现组织蛋白酶D不仅与原发肿瘤细胞穿透基质膜有关，而且与远处转移灶肿瘤细胞的生长也有关系。
本研究结果提示实质细胞组织蛋白酶D与间质细胞组织蛋白酶D都和乳腺癌的侵袭、转移和预后有关。实质细胞组织蛋白酶D反映肿瘤细胞的侵袭能力，影响病人的预后；而间质细胞组织蛋白酶D与乳腺癌患者的远处转移和预后有关。间质组织蛋白酶D与实质组织蛋白酶D两者密切相关，具有统计学显著差别(P<0.01)。相对而言，间质组织蛋白酶D更能代表乳腺癌细胞的侵袭和转移的能力。临床上应用简便的免疫组织化学方法检测间质与实质组织蛋白酶D将有助于临床预后的判断，从而指导临床治疗。因此组织蛋白酶D可作为一个与乳腺癌预后密切相关的预后指标。
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第一作者简介 袁建达，男，博士，主治医生。
参 考 文 献
1 Hsu SM,Raine and Fanger H.The use of antiavidin antibody and avidin-biotin-peroxidase complex in immunoperoxidase technics.Am J Clin Pathol,1981,75:816～821
2 Gaetano L,Jicola G,Luciano R, et al.Cathepsin D in the malignant progression of neoplastic diseases (review)Anticancer Res,1992,12:235～240
3 Rochefort H,Capony F,Garcia M.Cathepsin D:A protease involved in breast cancer metastasis.Cancer Met Rev:1990,9:321～331
, http://www.100md.com
4 Henri R.Cathepsin D in breast cancer.Breast Cancer Res and Treat,1990,16:3～13
5 邵志敏，沈镇宙.应用生化法检测乳腺癌组织中组织蛋白酶D的研究.中国癌症杂志，1995，5(2)：77～88
6 Donoghue AEMA,Poller DN,Bell JA, et al. Cathepsin D in primary breast carcinoma:Adverse prognosis is associated with expression of cathepsin D in stromal cell.Breast Cancer Res and Treat,1995,33:137～145
7 Lazaris AC,Theodoropoulos GE,Diamantopoulos AK.Immunohistochemical detection of cathepsin D in low grade breast invasive cancer.Anticancer Res,1997,17(4A):2651～2655
, http://www.100md.com
8 Garcia M,Derocq D,Sheikh MS, et al. Overexpression of transfected cathepsin D in transformed cells increases their malignant phenotype and metastatic potency.Oncogene,1990,5:1809～1814
9 Garcia M,Platet N,Liaudet E, et al.Biological and clinical significance of cathepsin D in breast cancer metastasis.Stem Cells,1996,14(6):642～650
(收稿：1998-03-02), http://www.100md.com
单位：上海医科大学肿瘤医院外科分子生物学实验室(上海 200032)
关键词：乳腺肿瘤；组织蛋白酶D；侵袭；肿瘤转移；预后
肿瘤990202 目的 研究组织蛋白酶D(Cath-D)对乳腺癌侵袭、转移和预后的作用。 方法 采用免疫组织化学亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)法，检测105例乳腺癌石蜡切片中肿瘤细胞(实质)和间质细胞组织蛋白酶D的表达，结合临床和病理资料分析其作用。 结果 组织蛋白酶D主要定位于细胞浆，部分增生的细胞可见定位于细胞核，间质细胞与实质细胞的Cath-D的定位基本相似。间质细胞以肿瘤周围的间质细胞组织蛋白酶D的表达量为高。Cath-D在乳腺癌实质和间质中总的表达率分别为49.5%(52/105)，56.2%(59/105)。实质Cath-D的表达与肿瘤细胞组织浸润、肿瘤大小、腋淋巴结转移、随访结果有关(P<0.05)；与乳腺癌组织学分类、组织学分型、分级、年龄、ER、PR状态、局部复发、远处转移无关。间质Cath-D的表达与乳腺癌肿瘤大小、腋淋巴结转移、局部复发、远处转移、年龄、ER、PR状态、局部复发无关。实质与间质Cath-D的表达和乳腺癌患者的无瘤生存率有关(P<0.05)；实质Cath-D表达与总生存率无关(P>0.05)，而间质的Cath-D与总生存率有关(P<0.05)。 结论 实质和间质乳腺癌组织蛋白酶D的表达都和侵袭、转移和预后有关。实质Cath-D反映肿瘤细胞的侵袭能力，而间质的Cath-D与远处转移和预后有关。间质Cath-D与实质Cath-D密切相关，相对而言，间质的Cath-D更能代表乳腺癌细胞的侵袭和转移的能力。组织蛋白酶D可作为一个与乳腺癌预后密切相关的预后指标。
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CATHEPSIN D AND PROGNOSIS IN BREAST CANCER
Yuan Jianda,Shao Zhiming,Han Qixia,et al.Department of Surgery,Cancer Hospital,Shanghai Medical University,Shanghai 200032
Objective：To study the effect of Cathepsin D(Cath-D) on breast cancer invasion, metastasis and prognosis.Methods：By means of ABC test, 105 breast cancer specimens in paraffin sections were examined for the expression of Cath-D.Results：Cath-D protein was detected in cancer cell cytoplasm;the expression rates in cancer cells and in stromal cells were 49.5% (52/105) and 56.2%(59/105) respectively.Expression of Cath-D in cancer cells was correlated to its invasiveness,bigger tumor size,higher axillary lymph node involvement and poorer prognosis(P<0.05)，but not with those pathologic typing,grading,age,ER and PR status,local recurrence and distant metastasis.Expression of Cath-D in stromal cells was associated with bigger tumor size,axillary lymph node metastasis,regional recurrence,distant metastasis and poorer prognosis(P<0.05).Conclusion：The neoplastic and stromal cathepsin D are neglected immunohistochemical prognostic parameters.They play a pivotal role in the invasion and breast cancer metastasis.It shows that cathepsin D,specially stromal catepsin D,induces breast cancer metastasis and influences the prognosis of patients.
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Key words Breast tumor Cathepsin D Invasion Neoplasm metastasis Prognosis
乳腺癌的远处转移是导致乳腺癌临床治疗失败的主要原因。乳腺癌的远处转移是一个复杂的多步骤的过程，涉及肿瘤细胞运动、基质膜降解、肿瘤细胞与宿主细胞的粘附、转移灶新生血管的形成等。组织蛋白酶D(Cath-D)作为一个基质膜降解酶在肿瘤的转移中起重要作用。晚近，许多研究表明Cath-D与肺癌、肠癌、肝癌的转移有关[2～5]。本研究应用免疫组织化学方法检测肿瘤细胞(实质)与间质细胞中Cath-D的表达，探讨实质与间质的Cath-D在乳腺癌侵袭、转移中的作用，了解其临床意义。
材料和方法
一、材料
上海医科大学肿瘤医院1988～1989年手术切除的乳腺癌标本105例，术前未曾接受放疗和化疗。随访时间在2～9年，中位随访期5.1年，均为女性病例，年龄为25～78岁，平均年龄52.84岁。
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每个病例均具有完整的临床病史资料，病理诊断和随访资料。参照《中国常见恶性肿瘤诊治规范第八分册乳腺癌》的标准，进行病理诊断，观察组织学分型、组织学分类、组织学分级和组织浸润等指标。组织学分级按Scarff-Bloom-Richardson法分为：1.组织分化程度(以腺管的形成为主要依据)，高分化为1分，中分化为2分，低分化为3分；2.核多形性：按轻、中、重分别定为1、2、3分；3.核分裂相：1～10个/10个高倍视野(HPF)为1分，11～20个/10个HPF为2分，>21个/10个HPF为3分。将以上三方面得分相加，确定病理分级：1级(3～5分)为分化好，Ⅱ级(6～7分)为分化中，及Ⅲ级(8～9分)为分化差。病理分类：特殊型和非特殊型。组织浸润分：肿瘤边界清楚为Ⅰ级，癌瘤周边界部分清楚为Ⅱ级，癌瘤周边与周围组织分界不清楚，呈浸润性生长为Ⅲ级。无腋淋巴结转移为(-)组，1～3个腋淋巴结转移为(+)组，大于3个为()组。随访结果分：健在、带癌和死亡。所有死亡病例均死于乳腺癌。
二、方法
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1、试剂
组织蛋白酶D CH18-0109多克隆抗体购于上海中达公司，ABC试剂盒Vector产品。
2、免疫组织化学染色
应用Hsu等[1]免疫组化方法染色，石蜡切片制成5 μm，依次二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，0.05%胰酶消化，37 ℃ 20 min，0.03% H2O2封闭内源性过氧化物酶，室温10 min，5% 小牛血清温育，室温20 min，加入一抗50 μl，4 ℃冰箱过夜，PBS洗3次，加入生物素化马抗鼠IgG 50 μl，4℃冰箱过夜，PBS洗3次，加入生物素化马抗鼠IgG 50 μl，37℃ 1 h，PBS洗3次，加入SABC试剂50 μl，37 ℃30 min，PBS洗3次，0.04% DAB-0.03% H2O2室温显微镜下控制显色5 min。由于组织蛋白酶D部分定位于细胞核，故未用苏木素复染，清水洗涤后常规脱水、透明，封片。
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3、阳性染色反应分级判断标准
以细胞浆或细胞核出现棕色颗粒为阳性细胞。根据细胞浆阳性综色颗粒的着色深浅，将染色强度分为(Ⅰ)无反应或微弱反应；(Ⅱ)棕色反应；(Ⅲ)深棕色反应三组，计算(Ⅱ)、(Ⅲ)两组每例切片5个高倍视野中阳性染色反应细胞的百分率，并将(Ⅰ)组病例数归入染色反应(-)组，最后确定组织蛋白酶D染色反应半定量分级：(-)为0～25%，(+)为26～74%，(++)为75～100%。实验中去一抗作为阴性对照，同时应用MCF-7人乳腺癌细胞爬片染色作为阳性对照。
三、统计学分析
采用上海医科大学流行病学教研室Epi Info(5.0板本)统计软件进行χ2检验，比较组织蛋白酶D表达水平与乳腺癌临床及病理指标的关系。应用Kaplan Meier寿命表法计算总生存率和无瘤生存率。P<0.05认为具有统计学意义。
, 百拇医药
结 果
一、组织蛋白酶D的定位及表达水平
免疫组化染色的结果，105例乳腺癌实质与间质细胞组织蛋白酶D均定位于细胞浆、部分定位于细胞核，其染色强度和阳性细胞百分率明显不同，呈异质性分布。癌旁乳腺良性病变组织蛋白酶D的定位和乳腺癌细胞相似(见插页第3页图1)。
图1 实质与间质Cath-D在乳腺癌细胞浆上阳性表达(SABC法×400),中央区为阳性肿瘤细胞,肿瘤周边间质细胞阳性表达
表1 实质和间质Cath-D蛋白表达水平与病理指标的关系 临床病理指标
例数
实质Cath-D表达
, 百拇医药
阳性率
(%)
χ2值
P
间质Cath-D表达
阳性率
(%)
χ2值
P
-
+
++
-
, 百拇医药
+
++
组织学分类
髓样癌
12
7
1
4
41.7%
6
4
2
50%
腺癌
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5
5
0
0
0%
3
1
1
40%
单纯癌
32
14
9
9
, http://www.100md.com
57.6%
12
12
8
62.5%
Pagets病
3
3
0
0
0%
18.08
0.2083
, 百拇医药
3
0
0
0%
16.80
0.5334
浸润性导管癌
42
20
8
14
52.4%
(v=14)
, 百拇医药
20
10
12
52.4%
(v=14)
小叶癌
4
2
2
0
50%
1
3
0
, 百拇医药
75%
浸润性小叶癌
2
0
1
1
100%
0
1
1
100%
其它类型
5
2
, 百拇医药
2
1
60%
2
3
0
60%
组织学分型
特殊型
92
45
20
27
51.1%
, http://www.100md.com
1.17
0.5562
38
31
23
58.7%
3.87
0.1441
非特殊型
13
8
3
2
, http://www.100md.com
38.5%
(v=2)
9
3
1
30.8%
(v=2)
组织学分级
Ⅰ级
62
33
15
14
, http://www.100md.com
46.8%
32
19
11
48.4%
Ⅱ级
34
19
4
11
44.1%
8.65
0.0703
, 百拇医药
12
11
11
64.7%
4.11
0.3915
Ⅲ级
9
1
4
4
88.9%
(v=4)
, 百拇医药
3
4
2
66.7%
(v=4)
组织浸润
Ⅰ级
43
28
9
6
34.9%
26
, 百拇医药 12
5
39.5%
Ⅱ级
40
20
8
12
50%
15.08
0.0196
15
13
12
, http://www.100md.com
62.5%
11.38
Ⅲ级
21
4
6
11
81.0%
(v=6)
5
9
7
76.2%
, 百拇医药 (v=6)
0.047
Ⅳ级
1
1
0
0
0%
1
0
0
0%
表2 实质和间质Cath-D蛋白的表达水平与临床指标的关系 临床病理指标
, 百拇医药
例数
实质Cath-D表达
阳性率
(%)
χ2值
P
间质Cath-D表达
阳性率
(%)
χ2值
P
-
+
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++
-
+
++
年龄
≤40
20
10
3
7
50%
5
8
7
, 百拇医药
75%
40～60
53
26
12
15
50.9%
1.44
0.8371
28
15
10
47.2%
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4.87
0.3013
>60
32
17
8
7
46.9%
(v=4)
14
11
7
56.3%
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(v=4)
肿瘤大小
<3 cm
56
34
13
9
39.3%
8.38
0.0151
31
13
12
, http://www.100md.com
44.6%
6.85
0.0325
≥3 cm
49
19
10
20
61.2%
(v=2)
15
15
19
, 百拇医药
57.6%
(v=2)
腋淋巴结转移
-
48
36
8
4
25%
31
12
5
35.4%
, 百拇医药 +
28
11
9
8
60.7%
30.04
0.004
9
14
5
67.9%
23.42
0.0001
, http://www.100md.com
++
29
6
6
17
79.3%
(v=4)
7
8
14
75.9%
(v=4)
ER状态
, 百拇医药 -
54
28
11
15
48.2%
0.16
0.9221
23
19
12
57.4%
0.41
, 百拇医药 0.8160
+
51
25
12
14
51.0%
(v=2)
24
15
12
52.9%
(v=2)
, 百拇医药 PR状态
-
72
35
19
18
52.1%
2.83
0.2430
33
23
16
54.2%
, http://www.100md.com 0.11
0.9452
+
33
18
4
11
45.5%
(v=2)
14
11
8
49.4%
, 百拇医药 (v=2)
局部复发
无
94
50
20
24
46.8%
2.89
0.2360
42
32
20
, 百拇医药 55.3%
1.75
0.4174
有
11
3
3
5
72.7%
(v=2)
5
2
4
54.5%
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(v=2)
远处转移
无
77
42
18
17
45.4%
4.44
0.1085
38
26
13
, http://www.100md.com
50.6%
6.04
0.0488
有
28
11
5
12
60.7%
(v=2)
9
8
11
, 百拇医药
67.9%
(v=2)
随访结果
健在
81
46
18
17
43.2%
42
26
13
48.1%
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带癌
14
5
2
7
64.3%
9.40
0.0518
2
4
8
85.7%
13.61
, 百拇医药 0.0086
死亡
10
2
3
5
80%
(v=4)
3
4
3
70%
(v=4)
二、组织蛋白酶D实质表达和病理指标的关系
, 百拇医药
乳腺癌实质组织蛋白酶D表达与乳腺癌组织浸润有关(P<0.05)；而与组织学分型、分类、分级无关(P>0.05 见表1)。表中其它病理类型包括硬癌、粘液腺癌、乳头状腺癌、大汗腺癌、鳞状细胞癌各1例。虽然实质组织蛋白酶D的表达与组织学分级无关，P=0.0703，若增加样本，可能会证实两者的相关性。
三、间质组织蛋白酶D表达和病理指标的关系
乳腺癌间质组织蛋白酶D的表达与组织学分型、分级、分类都无关，但与组织浸润有关(P=0.047 见表1)。
四、实质组织蛋白酶D表达水平与临床指标的关系
Cath-D蛋白实质表达水平与乳腺癌肿瘤大小、腋淋巴结转移、随访结果有关(P<0.05)，与病人的年龄、ER、PR、局部复发、远处转移无关(P>0.05 见表2)。
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图1 105例乳腺癌组织实质Cath-D蛋白表达与预后
Kaplan-Meier生存曲线分析：实质Cath-D蛋白阴性表达者无瘤生存率明显高于阳性表达者(P<0.05)。
图2 105例乳腺癌组织实质Cath-D蛋白表达与预后
Kaplan-Meier生存曲线分析：实质Cath-D蛋白的表达阴性者的总生存率与阳性表达者无明显差别(P>0.05)。
五、间质组织蛋白酶D表达水平与临床指标的关系
间质Cath-D蛋白的表达水平与肿瘤大小、腋淋巴结转移、肿瘤远处转移、随访结果有关(P<0.05)，与病人的年龄、ER、PR、局部复发无关(P>0.05见表2)。
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六、实质与间质组织蛋白酶D表达的相关性
经相关性检验的结果发现实质与间质的组织蛋白酶D的表达密切相关。(P<0.01见表3)。
表3 实质Cath-D与间质Cath-D表达的相关性 实质
Cath-D
例数
间质Cath-D表达
χ2值
P值
-(%)
+(%)
++(%)
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-
53
33
14
6
+
23
9
11
3
25.62
0.0000
++
29
, 百拇医药
5
9
15
(v=4)
合计
105
47
34
24
图3 105例乳腺癌组织间质Cath-D蛋白表达与预后
Kaplan-Meier生存曲线分析：间质Cath-D蛋白阴性表达者无瘤生存率明显高于阳性表达者(P<0.05)。
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图4 105例乳腺癌组织间质Cath-D蛋白表达与预后
Kaplan-Meier生存曲线分析：间质Cath-D蛋白的表达阴性者的总生存率与阳性表达者差别具有统计学意义(P<0.05)。
七、组织蛋白酶D与预后的关系
应用Kaplan-Meier计算105例乳腺癌患者的无瘤生存率与总生存率，结果显示Cath-D实质和间质表达均与无瘤生存率有关(P<0.05)；实质表达与总生存率无关(P>0.05)，而间质表达与总生存率有关(P<0.05 见图1～4)。
讨 论
基质膜降解是肿瘤转移的一个重要过程，诸多基质蛋白酶在基质膜降解过程中起着重要作用。Cath-D是一种酸性溶酶体蛋白酶，它可以以多种状态存在，分泌53 kD的酶原，酶原无生物学活性，在一定的pH值(2.8-4.0)环境下，经降解为两条肽链48 kD的活性分子，并予加工修饰为34 kD、14 kD的肽链片段。组织蛋白酶D在动物和人体中呈异质性分布，不同的器官和组织中组织蛋白酶D的类型及含量各不相同。生理状态下组织蛋白酶D参与许多机体蛋白、活性多肽的降解过程，从而实现其功能[2]。
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近年来的研究发现组织蛋白酶D与卵巢癌、黑素瘤、尤其是乳腺癌的浸润、转移有关[3]。应用生化法检测乳腺癌中组织蛋白酶D，结果发现它的含量与乳腺癌的转移及预后有关[4，5]；经免疫组织化学法检测乳腺癌标本中组织蛋白酶D的表达，结果发现间质细胞组织蛋白酶D表达与乳腺癌的侵袭、转移有关[6，7]。Garcia[8]等采用DNA转染技术将组织蛋白酶D cDNA转至低表达组织蛋白酶D的乳腺癌细胞株中，结果经转染后的细胞与对照的细胞相比，其转移和浸润能力明显提高。因此推测实质或间质的组织蛋白酶D降解基质膜，从而促进肿瘤细胞的转移。晚近，Garcia[9]等发现组织蛋白酶D不仅与原发肿瘤细胞穿透基质膜有关，而且与远处转移灶肿瘤细胞的生长也有关系。
本研究结果提示实质细胞组织蛋白酶D与间质细胞组织蛋白酶D都和乳腺癌的侵袭、转移和预后有关。实质细胞组织蛋白酶D反映肿瘤细胞的侵袭能力，影响病人的预后；而间质细胞组织蛋白酶D与乳腺癌患者的远处转移和预后有关。间质组织蛋白酶D与实质组织蛋白酶D两者密切相关，具有统计学显著差别(P<0.01)。相对而言，间质组织蛋白酶D更能代表乳腺癌细胞的侵袭和转移的能力。临床上应用简便的免疫组织化学方法检测间质与实质组织蛋白酶D将有助于临床预后的判断，从而指导临床治疗。因此组织蛋白酶D可作为一个与乳腺癌预后密切相关的预后指标。
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第一作者简介 袁建达，男，博士，主治医生。
参 考 文 献
1 Hsu SM,Raine and Fanger H.The use of antiavidin antibody and avidin-biotin-peroxidase complex in immunoperoxidase technics.Am J Clin Pathol,1981,75:816～821
2 Gaetano L,Jicola G,Luciano R, et al.Cathepsin D in the malignant progression of neoplastic diseases (review)Anticancer Res,1992,12:235～240
3 Rochefort H,Capony F,Garcia M.Cathepsin D:A protease involved in breast cancer metastasis.Cancer Met Rev:1990,9:321～331
, http://www.100md.com
4 Henri R.Cathepsin D in breast cancer.Breast Cancer Res and Treat,1990,16:3～13
5 邵志敏，沈镇宙.应用生化法检测乳腺癌组织中组织蛋白酶D的研究.中国癌症杂志，1995，5(2)：77～88
6 Donoghue AEMA,Poller DN,Bell JA, et al. Cathepsin D in primary breast carcinoma:Adverse prognosis is associated with expression of cathepsin D in stromal cell.Breast Cancer Res and Treat,1995,33:137～145
7 Lazaris AC,Theodoropoulos GE,Diamantopoulos AK.Immunohistochemical detection of cathepsin D in low grade breast invasive cancer.Anticancer Res,1997,17(4A):2651～2655
, http://www.100md.com
8 Garcia M,Derocq D,Sheikh MS, et al. Overexpression of transfected cathepsin D in transformed cells increases their malignant phenotype and metastatic potency.Oncogene,1990,5:1809～1814
9 Garcia M,Platet N,Liaudet E, et al.Biological and clinical significance of cathepsin D in breast cancer metastasis.Stem Cells,1996,14(6):642～650
(收稿：1998-03-02), http://www.100md.com