内质网分子伴侣Grp94的表达与细胞周期的关系
作者：赵迎辉 宋今丹
单位：110001 沈阳，中国医科大学细胞生物学卫生部重点实验室
关键词：内质网；细胞周期蛋白类
中华物理医学与康复杂志990215
【摘 要】 目的 进一步分析正常组织来源的细胞系CV-1和人大肠癌细胞系CCL-229的Grp94的表达及其与细胞周期的关系。方法 对细胞中DNA和内质网分子伴侣Grp94进行同时染色，进行双参数流式细胞术分析。结果 两种细胞的Grp94的表达情况相似，在细胞周期各时相中内质网分子伴侣Grp94 均有表达，G0+G1期表达量较少，S期的表达量无明显增加，G2+M期的表达量最高。结论 Grp94在细胞周期各时相的表达呈渐增的趋势，但在S期增加不明显,表明Grp94的表达与细胞周期各时相的变化存在着密切的关系。
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【中图号】 R329.3
Expression of Grp94 in the cell cycle
ZHAO Yinghui,SONG Jindan.
Key Laboratory of Cell Biology of Public Health of China ,China Medical University ,Shenyang 110001
【Abstract】 Objective To analyse the relationship of the expression of molecular chaperone Grp94 ER with cell cycle.Methods The expression of Grp94 related to the different stages was reported with Dual-parameter flow cytometry methods.Results The expression of Grp94 was found during all stages of cell cycle.It was expressed at the lowest in G0-G1stage,a slightly higher level in S stage and the highest in G2-Mstage.Conclusion The expression of Grp94 is related to the stage of cell cycle.
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【Key words】 Endoplasmic reticulum Cyclins
内质网膜系统是蛋白质、脂类合成和物质运输的重要场所，同时也是细胞内其它膜性细胞器的重要来源，它在内膜系统中占有中心地位。内质网膜系统的重要功能之一是合成分泌蛋白、膜蛋白和驻留蛋白。在内质网的蛋白质合成过程中内质网分子伴侣发挥着重要作用,它们帮助新生多肽链进行正确的组装、蛋白质的跨膜转运及折叠[1]。目前已发现了多种定位于内质网的分子伴侣，分子伴侣为驻留蛋白,例如：Bip、Grp94、Calreticulin、Calnexin、PDI、ERp72及HSP47等[1-3]。
内质网分子伴侣Grp94在正常细胞的内质网腔中含量较高，其表达与多种因素有关，各种应激条件下可见其表达明显增高。细胞周期也是常见的影响细胞增殖的因素之一，因此研究细胞增殖过程中Grp94的表达情况具有重要意义。
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1 材 料 与 方 法
1.1 材料
非洲绿猴肾上皮细胞CV-1,人大肠癌细胞系CCL-229为美国哈佛大学医学院肿瘤所惠赠。牛血清白蛋白(BSA)、碘化丙啶(PI)均为Sigma产品，RNA酶A为Serva产品，Grp94单克隆抗体为ABR(Affinity Bio Reagents)公司产品，FITC羊抗大鼠IgG为华美公司产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
非洲绿猴肾上皮细胞CV-1和人大肠癌细胞CCL-229单层培养于培养瓶中，于含有体积分数为10%小牛血清的DMEM培养基、CO2培养箱中，100%湿度、37 ℃条件下培养。
1.2.2 流式细胞术标本制备
, 百拇医药
将上述处于对数生长期的细胞用胰酶消化成单细胞悬液并离心弃上清后用PBS洗涤。调整细胞的浓度为106个/ml，并固定于体积分数为70%的冷乙醇中，4 ℃冰箱中过夜。乙醇固定后的细胞用PBS洗涤之后，再于含有体积分数为1%的BSA的PBS中室温孵育30 min，然后加入1∶300稀释的Grp94单克隆抗体50 μl，振荡摇匀后在室温下孵育1 h。随后再用含有体积分数为1%的BSA的PBS洗两次，充分洗去游离的一抗之后，加入1∶10稀释的FITC羊抗大鼠IgG 50 μl，并在室温下避光孵育1 h。用PBS充分洗去游离的二抗之后，向反应体系中加入100 μl的RNA酶A和100 μl的碘化丙啶，避光孵育30 min，随后即可进行流式细胞术分析(空白对照管只加入二抗不加入一抗)。
1.2.3 利用双参数流式细胞术分析内质网分子伴侣Grp94的表达。本实验采用的流式细胞仪为Bryte-HS flowcytometer(Bio-Rad)公司，激发波长为488 nm，发射光滤片分别为525 nm(FITC的绿色荧光)和620 nm(碘化丙啶的红色荧光)。测量前首先去除空白对照的本底并用标准荧光微球样品(Bio-Rad公司)调节荧光补偿、将PMT参数固定后，对上述流式细胞术样品进行流式细胞术分析，每次分析的细胞数为10 000个，FITC和碘化丙啶的信号均采用线形参数方式记录，并将该数据以“List Mode”形式储存，然后由计算机综合处理数据。
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2 结 果
2.1 CV-1和CCL-229细胞的细胞周期分布及Grp94的表达
利用双参数流式细胞术分析所得的CV-1和CCL-229细胞系的细胞周期分布如表1所示，结果发现CCL-229细胞的S期和G2+M期细胞的百分比均高于CV-1细胞。用Grp94单克隆抗体对CV-1和CCL-229细胞进行间接免疫荧光染色，通过流式细胞仪定量测量每个细胞表面的荧光强度，计算机处理后计算阳性细胞的百分比均为100%。
表1 CV-1和CCL-229细胞的细胞周期分布(%) 细胞系
G0+G1
S
G2+M
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CV-1
71.2
16.6
12.2
CCL-229
57.4
24.5
18.1
2.2 Grp94的表达与细胞周期的关系
对CV-1细胞和CCL-229细胞中内质网分子伴侣Grp94的表达和DNA的相对荧光含量进行双参数分析。结果显示在CV-1和CCL-229细胞中内质网分子伴侣Grp94均有较高的表达(阳性率均为100%)，而且Grp94的表达与细胞周期的关系大致相同：在细胞周期各时相中均有表达，G0+G1期表达量较少，S期的表达量无明显增加，G2+M期的表达量最高。内质网分子伴侣Grp94在细胞周期各时相的表达呈渐增的趋势，但在S期增加不明显。
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3 讨 论
内质网分子伴侣Grp94属于HSP90家族，是正常细胞内质网腔中含量较丰富的驻留蛋白质。Grp94的表达与多种因素有关，各种应激如蛋白质的错误折叠，不完全装配或非糖基化蛋白质的积聚，细胞储存Ca2+的排空与病毒感染、葡萄糖饥饿等条件下Grp94的表达水平可明显升高[1-5]。细胞周期是常见的影响细胞增殖的因素，因此本实验对细胞周期中Grp94的表达进行了流式细胞光度术分析。
研究结果表明：在细胞周期各时相中内质网分子伴侣Grp94均有表达，G0+G1期表达量较少，S期的表达量无明显增加，G2+M期的表达量最高。内质网分子伴侣Grp94在细胞周期各时相的表达呈渐增的趋势，但在S期增加不明显。表明Grp94的表达与细胞周期各时相的变化存在密切的关系。该实验结果也与我们前面的实验有很大的相关性[6,7]，它提示随着细胞周期的推进和细胞内质网膜系统面密度的增大，Grp94表达的量也逐渐增高。但在S期，Grp94的表达处于一个平台期，并没有明显的增加，这可能是因为在S期中，细胞的生物学行为主要是进行DNA的复制，而其它与DNA 复制无关的蛋白合成过程受到抑制。
, 百拇医药
本课题为国家自然科学基金重大项目(No.3904005)
参 考 文 献
1 Gething MJ,Sambrook J.Protein folding in the cell.Nature,1992,355:33-45.
2 Pelham HRB.Heat shock and the sorting of luminal ER proteins.EMBO,1989,8:3171-3176.
3 Chang SC，Scott KW，Takafumi N，et al.Rat gene encoding the 78 KDa glucose-regulated protein GRP78.Its regulatory sequences and the effect of protein glycosylation.Proc Natl Acad Sci USA,1987,84:680-684.
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4 Kozutsumi Y,Mark S,Normington K,et al.The presence of the malfoided proteins in the endoplasmic reticulum signals the induction of glucose-regulated proteins.Nature,1988,332:462-464.
5 Li WW,Alexandre S,Cao Xianjun,et al.Transactiation of the grp78 promoter by Ca2+ depletion.J Biol Chem,1993,268:12003-12009.
6 赵迎辉,宋今丹.扫描电镜下观察细胞周期各时相中内质网膜系统的超微结构变化.中华物理医学杂志,1995,17:165-167.
7 赵迎辉,宋今丹.细胞增殖过程中整装培养细胞的内质网膜系统的组建特点.解剖科学进展,1998,4:80-84.
(收稿 1998-08-03 修回 1998-11-30), 百拇医药
单位：110001 沈阳，中国医科大学细胞生物学卫生部重点实验室
关键词：内质网；细胞周期蛋白类
中华物理医学与康复杂志990215
【摘 要】 目的 进一步分析正常组织来源的细胞系CV-1和人大肠癌细胞系CCL-229的Grp94的表达及其与细胞周期的关系。方法 对细胞中DNA和内质网分子伴侣Grp94进行同时染色，进行双参数流式细胞术分析。结果 两种细胞的Grp94的表达情况相似，在细胞周期各时相中内质网分子伴侣Grp94 均有表达，G0+G1期表达量较少，S期的表达量无明显增加，G2+M期的表达量最高。结论 Grp94在细胞周期各时相的表达呈渐增的趋势，但在S期增加不明显,表明Grp94的表达与细胞周期各时相的变化存在着密切的关系。
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【中图号】 R329.3
Expression of Grp94 in the cell cycle
ZHAO Yinghui,SONG Jindan.
Key Laboratory of Cell Biology of Public Health of China ,China Medical University ,Shenyang 110001
【Abstract】 Objective To analyse the relationship of the expression of molecular chaperone Grp94 ER with cell cycle.Methods The expression of Grp94 related to the different stages was reported with Dual-parameter flow cytometry methods.Results The expression of Grp94 was found during all stages of cell cycle.It was expressed at the lowest in G0-G1stage,a slightly higher level in S stage and the highest in G2-Mstage.Conclusion The expression of Grp94 is related to the stage of cell cycle.
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【Key words】 Endoplasmic reticulum Cyclins
内质网膜系统是蛋白质、脂类合成和物质运输的重要场所，同时也是细胞内其它膜性细胞器的重要来源，它在内膜系统中占有中心地位。内质网膜系统的重要功能之一是合成分泌蛋白、膜蛋白和驻留蛋白。在内质网的蛋白质合成过程中内质网分子伴侣发挥着重要作用,它们帮助新生多肽链进行正确的组装、蛋白质的跨膜转运及折叠[1]。目前已发现了多种定位于内质网的分子伴侣，分子伴侣为驻留蛋白,例如：Bip、Grp94、Calreticulin、Calnexin、PDI、ERp72及HSP47等[1-3]。
内质网分子伴侣Grp94在正常细胞的内质网腔中含量较高，其表达与多种因素有关，各种应激条件下可见其表达明显增高。细胞周期也是常见的影响细胞增殖的因素之一，因此研究细胞增殖过程中Grp94的表达情况具有重要意义。
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1 材 料 与 方 法
1.1 材料
非洲绿猴肾上皮细胞CV-1,人大肠癌细胞系CCL-229为美国哈佛大学医学院肿瘤所惠赠。牛血清白蛋白(BSA)、碘化丙啶(PI)均为Sigma产品，RNA酶A为Serva产品，Grp94单克隆抗体为ABR(Affinity Bio Reagents)公司产品，FITC羊抗大鼠IgG为华美公司产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
非洲绿猴肾上皮细胞CV-1和人大肠癌细胞CCL-229单层培养于培养瓶中，于含有体积分数为10%小牛血清的DMEM培养基、CO2培养箱中，100%湿度、37 ℃条件下培养。
1.2.2 流式细胞术标本制备
, 百拇医药
将上述处于对数生长期的细胞用胰酶消化成单细胞悬液并离心弃上清后用PBS洗涤。调整细胞的浓度为106个/ml，并固定于体积分数为70%的冷乙醇中，4 ℃冰箱中过夜。乙醇固定后的细胞用PBS洗涤之后，再于含有体积分数为1%的BSA的PBS中室温孵育30 min，然后加入1∶300稀释的Grp94单克隆抗体50 μl，振荡摇匀后在室温下孵育1 h。随后再用含有体积分数为1%的BSA的PBS洗两次，充分洗去游离的一抗之后，加入1∶10稀释的FITC羊抗大鼠IgG 50 μl，并在室温下避光孵育1 h。用PBS充分洗去游离的二抗之后，向反应体系中加入100 μl的RNA酶A和100 μl的碘化丙啶，避光孵育30 min，随后即可进行流式细胞术分析(空白对照管只加入二抗不加入一抗)。
1.2.3 利用双参数流式细胞术分析内质网分子伴侣Grp94的表达。本实验采用的流式细胞仪为Bryte-HS flowcytometer(Bio-Rad)公司，激发波长为488 nm，发射光滤片分别为525 nm(FITC的绿色荧光)和620 nm(碘化丙啶的红色荧光)。测量前首先去除空白对照的本底并用标准荧光微球样品(Bio-Rad公司)调节荧光补偿、将PMT参数固定后，对上述流式细胞术样品进行流式细胞术分析，每次分析的细胞数为10 000个，FITC和碘化丙啶的信号均采用线形参数方式记录，并将该数据以“List Mode”形式储存，然后由计算机综合处理数据。
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2 结 果
2.1 CV-1和CCL-229细胞的细胞周期分布及Grp94的表达
利用双参数流式细胞术分析所得的CV-1和CCL-229细胞系的细胞周期分布如表1所示，结果发现CCL-229细胞的S期和G2+M期细胞的百分比均高于CV-1细胞。用Grp94单克隆抗体对CV-1和CCL-229细胞进行间接免疫荧光染色，通过流式细胞仪定量测量每个细胞表面的荧光强度，计算机处理后计算阳性细胞的百分比均为100%。
表1 CV-1和CCL-229细胞的细胞周期分布(%) 细胞系
G0+G1
S
G2+M
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CV-1
71.2
16.6
12.2
CCL-229
57.4
24.5
18.1
2.2 Grp94的表达与细胞周期的关系
对CV-1细胞和CCL-229细胞中内质网分子伴侣Grp94的表达和DNA的相对荧光含量进行双参数分析。结果显示在CV-1和CCL-229细胞中内质网分子伴侣Grp94均有较高的表达(阳性率均为100%)，而且Grp94的表达与细胞周期的关系大致相同：在细胞周期各时相中均有表达，G0+G1期表达量较少，S期的表达量无明显增加，G2+M期的表达量最高。内质网分子伴侣Grp94在细胞周期各时相的表达呈渐增的趋势，但在S期增加不明显。
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3 讨 论
内质网分子伴侣Grp94属于HSP90家族，是正常细胞内质网腔中含量较丰富的驻留蛋白质。Grp94的表达与多种因素有关，各种应激如蛋白质的错误折叠，不完全装配或非糖基化蛋白质的积聚，细胞储存Ca2+的排空与病毒感染、葡萄糖饥饿等条件下Grp94的表达水平可明显升高[1-5]。细胞周期是常见的影响细胞增殖的因素，因此本实验对细胞周期中Grp94的表达进行了流式细胞光度术分析。
研究结果表明：在细胞周期各时相中内质网分子伴侣Grp94均有表达，G0+G1期表达量较少，S期的表达量无明显增加，G2+M期的表达量最高。内质网分子伴侣Grp94在细胞周期各时相的表达呈渐增的趋势，但在S期增加不明显。表明Grp94的表达与细胞周期各时相的变化存在密切的关系。该实验结果也与我们前面的实验有很大的相关性[6,7]，它提示随着细胞周期的推进和细胞内质网膜系统面密度的增大，Grp94表达的量也逐渐增高。但在S期，Grp94的表达处于一个平台期，并没有明显的增加，这可能是因为在S期中，细胞的生物学行为主要是进行DNA的复制，而其它与DNA 复制无关的蛋白合成过程受到抑制。
, 百拇医药
本课题为国家自然科学基金重大项目(No.3904005)
参 考 文 献
1 Gething MJ,Sambrook J.Protein folding in the cell.Nature,1992,355:33-45.
2 Pelham HRB.Heat shock and the sorting of luminal ER proteins.EMBO,1989,8:3171-3176.
3 Chang SC，Scott KW，Takafumi N，et al.Rat gene encoding the 78 KDa glucose-regulated protein GRP78.Its regulatory sequences and the effect of protein glycosylation.Proc Natl Acad Sci USA,1987,84:680-684.
, http://www.100md.com
4 Kozutsumi Y,Mark S,Normington K,et al.The presence of the malfoided proteins in the endoplasmic reticulum signals the induction of glucose-regulated proteins.Nature,1988,332:462-464.
5 Li WW,Alexandre S,Cao Xianjun,et al.Transactiation of the grp78 promoter by Ca2+ depletion.J Biol Chem,1993,268:12003-12009.
6 赵迎辉,宋今丹.扫描电镜下观察细胞周期各时相中内质网膜系统的超微结构变化.中华物理医学杂志,1995,17:165-167.
7 赵迎辉,宋今丹.细胞增殖过程中整装培养细胞的内质网膜系统的组建特点.解剖科学进展,1998,4:80-84.
(收稿 1998-08-03 修回 1998-11-30), 百拇医药