温阳药对实验性肝纤维化的作用及机理探讨
作者：王丽春1 李林2
单位：王丽春(华西医科大学附属第一医院，四川 成都 610041)；李林(北京中日友好医院)
关键词：温阳药；肝纤维化；血流动力学；肝组织病理形态；羟脯氨酸含量
成都中医药大学学报990223 摘 要： 目的：观察温阳药改善大鼠肝纤维化的作用并对其机理作初步探讨。方法：制备大鼠肝纤维化模型，予温阳药进行治疗，并观察其治疗前后血流动力学、肝组织病理形态及羟脯氨酸含量等的变化。结果：治疗组肝脏肠系膜血流量及肠系膜微血管血流速度均明显高于对照组(P<0.01或P<0.05)，肝组织纤维化程度及羟脯胺酸含量则明显低于对照组(P<0.01)。结论：温阳药能通过改善肝脏及胃肠道的微循环来改善肝细胞功能，从而改善肝纤维化程度。
中图分类号： R243；R259.752 文献标识码：A 文章编号：1004-0668(1999)02-0044-02
, http://www.100md.com
目前，肝硬化腹水在临床上尚缺乏理想的治疗手段，我们根据中医“水得温则行，得寒则凝”的理论，在临床上采用温阳行水的方法治疗肝硬化腹水患者，取得了良好疗效。为探明温阳药治疗肝脏病变的确切作用机理，我们进行了动物实验。现将动物实验结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
(1)动物 健康雄性Wister大鼠40只，体重180～250g，由中日友好医院临床研究所实验动物中心提供。
(2)主要试剂 四氯化碳(CCl4)购自北京市试剂公司，羟脯氨酸纯品购自华美生物制品公司，其余试剂均由中日友好医院临床研究所提供。
(3)主要仪器及软件 Nikon微循环生体显微镜(X2F-21)、HAMATSU显微电视摄像机(CC2400型)，NTSC制式监视器GVH-1400型)，激光血流仪，清华大学MCIM软件(微循环图像处理及多参数测量系统)。
, 百拇医药
1.2 模型制备及实验方法
1.2.1 动物分组及模型制备
将大鼠随机分为正常组(16只)及模型组(24只)。正常组进食普通颗粒饲料，自由饮水；模型组则予50%四氯化碳(使用前用等量橄榄油临时配制)皮下注射[1]，第1次剂量为0.5mL/100g，第2次以后必为0.3mL/100g，4天1次，共注射16次，并在自由饮食的同时，以10%乙醇代替饮用水。于实验第65天，随机抽取正常组及模型组动物各8只，检测各项指标后处死。病理检查方法证实模型组动物肝纤维化形成。
1.2.2 用药方法
正常组剩余动物继续同前饲养，模型组剩余动物撤除病因刺激，恢复正常饮水及膳食，并随机将其分为对照组及正常组各8只。治疗组予温阳药(选用传统温阳药附子、干姜、桂枝制成水煎剂)灌胃，每日1次，每次用量5mL(内含相当于成人50倍用药量[2])；对照组则予同体积生理盐水灌胃，连续给药30天(实验第95天)后，3组动物均检测指标后处死。
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1.2.3 观察指标及方法
(1)肝脏及肠系膜血流量的测定：动物麻醉后固定，开腹，暴露肝脏右小叶及回盲部肠系膜，将激光血流计探头置于其上，记录所测得多普勒值。
(2)肠系膜微循环的观察：选择回盲部肠系膜扇面，置于显微镜下，观察小静脉血流状态并录相，用MCIM软件分析算出肠系膜上不同管径小静脉的血流速度。操作过程中保持用温生理盐水浸润肠系膜。
(3)肝功能测定：静脉取血2mL，测肝功能相关生化指标(GPT、GO/GP、ALB、A/G、CHO、TG)。
(4)病理检测：取肝左叶组织，以10%福尔马林固定，常规包埋切片，分别用HE、弹力纤维+胶原纤维(Weiger+vG)和网织+结缔组织(Masson)染色。
(5)肝组织羟脯氨酸含量测定：参照郑绍雄氯胺T方法[3]进行。
, 百拇医药
2 结果
2.1 血流动力学变化
2.1.1 肝脏及肠系膜血流量变化
结果见表1。
表1 肝脏及肠系膜多普勒值(
±s，mL/min.100g)
组别
动物数量
肝脏多普勒
肠系膜多普勒
P值
第65天
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正常组
模型组
8
8
22.09±1.60
7.51±0.35
41.10±1.44
26.13±0.86
<0.01(与正常组比)
第95天
正常组
对照组
, 百拇医药 治疗组
8
8
8
21.94±1.33
11.65±0.65
15.95±0.75
40.87±1.76
30.28±1.17
34.89±1.09
<0.01(与正常组比)
2.1.2 肠系膜微血管及静脉血流速度变化
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镜下可见对照组微血管迂曲、僵硬，管壁欠光滑，部分静脉内血流呈粒缓(见封3图1)；治疗组管径较对照组扩张，逐级分支清晰，微小动脉及毛细血管可见(见封3图2)。血流速度变化在小静脉15～45μm的各管径范围内对照组与治疗组之间差异均有统计学意义(P<0.05)，结果见表2。表2 肠系膜不同管径(μm)的小静脉血流速度(±s，mm/s)
组 别
动物数量
15～20
20～25
25～30
30～35
35～40
, http://www.100md.com
40～45
P值
第65天
正常组
模型组
8
8
0.406±0.142
0.297±0.113
0.453±0.130
0.296±0.101
0.546±0.113
, 百拇医药
0.336±0.127
0.548±0.165
0.370±0.127
0.640±0.196
±0.425±0.105
0.777±0.218
0.450±0.131
<0.01(与正常组比)
第95天
正常组
对照组
治疗组
, http://www.100md.com
8
8
8
0.406±0.068
0.310±0.110
0.396±0.075
0.445±0.136
0.332±0.089
0.415±0.110
0.554±0.157
0.335±0.129
0.451±0.132
, 百拇医药
0.597±0.155
0.391±0.100
0.49±0.136
0.623±0.200
0.398±0.102
0.519±0.163
0.708±0.200
0.447±0.135
0.584±0.184
<0.01(与对照组)
2.2 病理形态学比较
, 百拇医药
结果见表3，对照组及治疗组的结缔组织染色照片见封3图3～图4。表3 光镜下各组大鼠肝脏病理形态学观察结果 组 别
肝小叶结构
肝细胞索排列
肝细胞变性坏死
肝细胞再生
纤维组织
汇管区
正常组
完整
整齐
不明显
不明显
, 百拇医药
无增生
不大
对照组
多数正常小叶结构消失，有假小叶形成
紊乱
中～重
明显
增生明显，形成大量纤维隔
扩大，大量炎细胞浸润，轻度胆管增生
治疗组
部分小叶稍紊乱，未见假小叶
基本整齐
, 百拇医药
轻～中
轻度
轻度增生，可见少量细纤维隔
轻度扩大，少许炎细胞浸润
2.3 肝功能变化
在血清生化指标中，对照组ALb为30.0g/L±2.9g/L，治疗组为33.8g/L±1.7g/L，两者比较有显著性差异(P<0.05)，其余指标无统计学意义。
2.4 肝组织羟氨酸含量变化
对照组为97.734μg/g组织湿重，治疗组为62.399μg/g组织湿重，二者比较有极显著的差异(P<0.01)；正常组为32.077μg/g组织湿重，模型组为123.420μg/g组织湿重，二者比较亦有极显著差异(P<0.01)。
, 百拇医药
3 讨论
通过对肝纤维化大鼠模型治疗前后肝功能生化指标ALb的测定、光镜下大鼠肝脏病理形态学改变及肝组织羟脯氨酸含量变化的测定的实验结果，提示温阳药对肝脏的纤维化有明显的改善作用。
肝纤维化是由于肝细胞变性坏死，细胞结节性再生，纤维组织增生，从而发生结构上的改变，导致肝脏微循环障碍而形成的。而微循环障碍可进一步加速以上病理变化，两者相互作用与影响，造成恶性循环。根据本实验结果，正常组与模型组结果对比提示肝纤维化形成后，其血流动力学发生了改变，血流量与血流速度均明显下降，存在着明显的微循环障碍。因此，改善微循环是治疗肝纤维化的重要手段。而对照组与治疗组的血流动力学指标证实，温阳药从宏观上增加了肝脏及肠系膜的血流量，从微观上增加了肠系膜小静脉的血流速度，通过改善微循环从而发挥了改善肝纤维化的作用。但温阳药是否能通过其他途径改善肝纤维化，还有待于进一步研究。
作者简介：王丽春，女，1972年2月生；硕士，医师；传染病学专业；研究方向：中西医结合防治肝脏疾病的实验及临床研究。
参考文献
1 吴志勇.鼠肝硬变形成中肝脏病理变化和门静脉压力的关系.中华外科杂志，1990，28：147.
2 郑振辉主编.实验动物工作手册.北京实验动物学会科技工作者联合会资料，1990.21.
3 郑绍雄.血尿羟脯氨酸测定方法学及其应用.天津医学院学报，1981，(5)：31.
(收稿日期：1999-03-01), http://www.100md.com(王丽春1 李林2)
单位：王丽春(华西医科大学附属第一医院，四川 成都 610041)；李林(北京中日友好医院)
关键词：温阳药；肝纤维化；血流动力学；肝组织病理形态；羟脯氨酸含量
成都中医药大学学报990223 摘 要： 目的：观察温阳药改善大鼠肝纤维化的作用并对其机理作初步探讨。方法：制备大鼠肝纤维化模型，予温阳药进行治疗，并观察其治疗前后血流动力学、肝组织病理形态及羟脯氨酸含量等的变化。结果：治疗组肝脏肠系膜血流量及肠系膜微血管血流速度均明显高于对照组(P<0.01或P<0.05)，肝组织纤维化程度及羟脯胺酸含量则明显低于对照组(P<0.01)。结论：温阳药能通过改善肝脏及胃肠道的微循环来改善肝细胞功能，从而改善肝纤维化程度。
中图分类号： R243；R259.752 文献标识码：A 文章编号：1004-0668(1999)02-0044-02
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目前，肝硬化腹水在临床上尚缺乏理想的治疗手段，我们根据中医“水得温则行，得寒则凝”的理论，在临床上采用温阳行水的方法治疗肝硬化腹水患者，取得了良好疗效。为探明温阳药治疗肝脏病变的确切作用机理，我们进行了动物实验。现将动物实验结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
(1)动物 健康雄性Wister大鼠40只，体重180～250g，由中日友好医院临床研究所实验动物中心提供。
(2)主要试剂 四氯化碳(CCl4)购自北京市试剂公司，羟脯氨酸纯品购自华美生物制品公司，其余试剂均由中日友好医院临床研究所提供。
(3)主要仪器及软件 Nikon微循环生体显微镜(X2F-21)、HAMATSU显微电视摄像机(CC2400型)，NTSC制式监视器GVH-1400型)，激光血流仪，清华大学MCIM软件(微循环图像处理及多参数测量系统)。
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1.2 模型制备及实验方法
1.2.1 动物分组及模型制备
将大鼠随机分为正常组(16只)及模型组(24只)。正常组进食普通颗粒饲料，自由饮水；模型组则予50%四氯化碳(使用前用等量橄榄油临时配制)皮下注射[1]，第1次剂量为0.5mL/100g，第2次以后必为0.3mL/100g，4天1次，共注射16次，并在自由饮食的同时，以10%乙醇代替饮用水。于实验第65天，随机抽取正常组及模型组动物各8只，检测各项指标后处死。病理检查方法证实模型组动物肝纤维化形成。
1.2.2 用药方法
正常组剩余动物继续同前饲养，模型组剩余动物撤除病因刺激，恢复正常饮水及膳食，并随机将其分为对照组及正常组各8只。治疗组予温阳药(选用传统温阳药附子、干姜、桂枝制成水煎剂)灌胃，每日1次，每次用量5mL(内含相当于成人50倍用药量[2])；对照组则予同体积生理盐水灌胃，连续给药30天(实验第95天)后，3组动物均检测指标后处死。
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1.2.3 观察指标及方法
(1)肝脏及肠系膜血流量的测定：动物麻醉后固定，开腹，暴露肝脏右小叶及回盲部肠系膜，将激光血流计探头置于其上，记录所测得多普勒值。
(2)肠系膜微循环的观察：选择回盲部肠系膜扇面，置于显微镜下，观察小静脉血流状态并录相，用MCIM软件分析算出肠系膜上不同管径小静脉的血流速度。操作过程中保持用温生理盐水浸润肠系膜。
(3)肝功能测定：静脉取血2mL，测肝功能相关生化指标(GPT、GO/GP、ALB、A/G、CHO、TG)。
(4)病理检测：取肝左叶组织，以10%福尔马林固定，常规包埋切片，分别用HE、弹力纤维+胶原纤维(Weiger+vG)和网织+结缔组织(Masson)染色。
(5)肝组织羟脯氨酸含量测定：参照郑绍雄氯胺T方法[3]进行。
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2 结果
2.1 血流动力学变化
2.1.1 肝脏及肠系膜血流量变化
结果见表1。
表1 肝脏及肠系膜多普勒值(
±s，mL/min.100g)组别
动物数量
肝脏多普勒
肠系膜多普勒
P值
第65天
, http://www.100md.com
正常组
模型组
8
8
22.09±1.60
7.51±0.35
41.10±1.44
26.13±0.86
<0.01(与正常组比)
第95天
正常组
对照组
, 百拇医药 治疗组
8
8
8
21.94±1.33
11.65±0.65
15.95±0.75
40.87±1.76
30.28±1.17
34.89±1.09
<0.01(与正常组比)
2.1.2 肠系膜微血管及静脉血流速度变化
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镜下可见对照组微血管迂曲、僵硬，管壁欠光滑，部分静脉内血流呈粒缓(见封3图1)；治疗组管径较对照组扩张，逐级分支清晰，微小动脉及毛细血管可见(见封3图2)。血流速度变化在小静脉15～45μm的各管径范围内对照组与治疗组之间差异均有统计学意义(P<0.05)，结果见表2。表2 肠系膜不同管径(μm)的小静脉血流速度(
±s，mm/s)组 别
动物数量
15～20
20～25
25～30
30～35
35～40
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40～45
P值
第65天
正常组
模型组
8
8
0.406±0.142
0.297±0.113
0.453±0.130
0.296±0.101
0.546±0.113
, 百拇医药
0.336±0.127
0.548±0.165
0.370±0.127
0.640±0.196
±0.425±0.105
0.777±0.218
0.450±0.131
<0.01(与正常组比)
第95天
正常组
对照组
治疗组
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8
8
8
0.406±0.068
0.310±0.110
0.396±0.075
0.445±0.136
0.332±0.089
0.415±0.110
0.554±0.157
0.335±0.129
0.451±0.132
, 百拇医药
0.597±0.155
0.391±0.100
0.49±0.136
0.623±0.200
0.398±0.102
0.519±0.163
0.708±0.200
0.447±0.135
0.584±0.184
<0.01(与对照组)
2.2 病理形态学比较
, 百拇医药
结果见表3，对照组及治疗组的结缔组织染色照片见封3图3～图4。表3 光镜下各组大鼠肝脏病理形态学观察结果 组 别
肝小叶结构
肝细胞索排列
肝细胞变性坏死
肝细胞再生
纤维组织
汇管区
正常组
完整
整齐
不明显
不明显
, 百拇医药
无增生
不大
对照组
多数正常小叶结构消失，有假小叶形成
紊乱
中～重
明显
增生明显，形成大量纤维隔
扩大，大量炎细胞浸润，轻度胆管增生
治疗组
部分小叶稍紊乱，未见假小叶
基本整齐
, 百拇医药
轻～中
轻度
轻度增生，可见少量细纤维隔
轻度扩大，少许炎细胞浸润
2.3 肝功能变化
在血清生化指标中，对照组ALb为30.0g/L±2.9g/L，治疗组为33.8g/L±1.7g/L，两者比较有显著性差异(P<0.05)，其余指标无统计学意义。
2.4 肝组织羟氨酸含量变化
对照组为97.734μg/g组织湿重，治疗组为62.399μg/g组织湿重，二者比较有极显著的差异(P<0.01)；正常组为32.077μg/g组织湿重，模型组为123.420μg/g组织湿重，二者比较亦有极显著差异(P<0.01)。
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3 讨论
通过对肝纤维化大鼠模型治疗前后肝功能生化指标ALb的测定、光镜下大鼠肝脏病理形态学改变及肝组织羟脯氨酸含量变化的测定的实验结果，提示温阳药对肝脏的纤维化有明显的改善作用。
肝纤维化是由于肝细胞变性坏死，细胞结节性再生，纤维组织增生，从而发生结构上的改变，导致肝脏微循环障碍而形成的。而微循环障碍可进一步加速以上病理变化，两者相互作用与影响，造成恶性循环。根据本实验结果，正常组与模型组结果对比提示肝纤维化形成后，其血流动力学发生了改变，血流量与血流速度均明显下降，存在着明显的微循环障碍。因此，改善微循环是治疗肝纤维化的重要手段。而对照组与治疗组的血流动力学指标证实，温阳药从宏观上增加了肝脏及肠系膜的血流量，从微观上增加了肠系膜小静脉的血流速度，通过改善微循环从而发挥了改善肝纤维化的作用。但温阳药是否能通过其他途径改善肝纤维化，还有待于进一步研究。
作者简介：王丽春，女，1972年2月生；硕士，医师；传染病学专业；研究方向：中西医结合防治肝脏疾病的实验及临床研究。
参考文献
1 吴志勇.鼠肝硬变形成中肝脏病理变化和门静脉压力的关系.中华外科杂志，1990，28：147.
2 郑振辉主编.实验动物工作手册.北京实验动物学会科技工作者联合会资料，1990.21.
3 郑绍雄.血尿羟脯氨酸测定方法学及其应用.天津医学院学报，1981，(5)：31.
(收稿日期：1999-03-01), http://www.100md.com(王丽春1 李林2)