胆囊癌组织中p21、p53及bcl-2癌基因蛋白的表达及意义
作者：陈劲松 熊寿芝 杨竹林
单位：陈劲松 海南省人民医院肝胆外科(海口 570311)；熊寿芝 杨竹林 湖南医科大学附二院肝胆外科
关键词：胆囊癌；胆囊息肉；免疫组化；癌基因蛋白
中国普外基础与临床杂志990208 摘要 为探讨胆囊良恶性病变组织中p21、p53及bcl-2癌基因蛋白的表达及其与胆囊癌预后的关系，以及在胆囊良恶性病变的鉴别诊断中的作用，采用免疫组织化学ABC法，分别测定了40例胆囊癌及8例胆囊腺瘤型息肉组织中p21、p53及bcl-2癌基因蛋白的表达情况。结果：胆囊癌组织中p21、p53及bcl-2癌基因蛋白表达阳性率分别为52.5%、52.5%和70.0%；在胆囊腺瘤型息肉中3者分别为0%、0%和100%；其中p53蛋白表达阳性率在低分化腺癌中明显高于高分化腺癌(P<0.01)，bcl-2蛋白表达阳性率在低分化腺癌中也明显低于高分化腺癌(P<0.01)。本实验结果提示：p21及p53蛋白表达可能是胆囊癌预后不良的重要指标，检测p21、p53及bcl-2蛋白表达情况在胆囊癌与胆囊息肉的鉴别诊断中有一定意义。
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THE EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF P21, P53, BCL-2 ONCOPROTEIN IN GALLBLADDER CARCINOMA
Chen Jingsong, Xiong Shouzhi, Yang Zhulin.
Department of Hepatobiliary Surgery, The People's Hospital of Hainan Province, Haikou 570311
Abstract The expression of p21, p53, bcl-2 oncoprotein was evaluated using immunohistochemistry in 40 patients with gallbladder carcinoma and 8 patients with gallbladder adenomous polyp. In the study, the positive rate of expression of p21, p53 and bcl-2 oncoprotein was 52.5%, 52.5% and 70.0% respectively in gallbladder carcinoma, while, in gallbladder polyp, they were 0%, 0% and 100% respectively. The positive rate of expression of p53 oncoprotein was significantly higher in poor-differentiated adenocarcinomas than in well-differentiated ones (P<0.05). The converse was true for bcl-2 oncoprotein. The positive rate of expression of p21 and p53 oncoprotein was significantly higher in metastatic group than in non-metastatic one. These results suggest that the patients with the expression of p21, p53 might be of poor-prognosis.
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Key words Gallbladder carcinoma Gallbladder adenomous polyp Immunohistochemistry Oncoprotein
近年来，关于p21、p53及bcl-2在各种恶性肿瘤组织中的表达情况的研究文献报道较多，但关于胆囊组织中的癌基因表达情况国内外文献少见报道。应用免疫组化ABC法对40例胆囊癌及8例胆囊腺瘤型息肉中p21、p53及bcl-2癌基因蛋白的表达进行了测定，旨在观察3者在临床中的意义。
1 对象与方法
1.1 研究对象
选择湖南医科大学附二院(1985～1993年)手术并经病理组织学诊断的胆囊癌40例，男7例，女33例，平均年龄50.8±8.9岁。术中发现或术后病理诊断淋巴结或邻近器官有转移者18例，无转移者22例。所有病例术前均未行放疗或化疗。胆囊腺瘤型息肉8例，男3例，女5例，平均年龄36±9.2岁，息肉直径0.7±0.3cm。
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1.2 方法
1.2.1 主要试剂 ①鼠抗人单克隆抗体：p21(1/30)、p53(1/100)及bcl-2(1/100)均为Dako公司产品；②生物素标记羊抗鼠IgG(1/100)及ABC试剂盒(1/500)均为Sigma公司产品。
1.2.2 免疫组化方法 所有标本均经10%甲醛固定，常规石蜡包埋切片，切片厚4μm，参照文献〔1〕的方法行ABC免疫组化染色，于光镜下观察。同时用PBS液代替第一抗体作替代对照，用已知的p21及p53蛋白阳性乳腺癌组织作阳性对照，以及选用正常胰腺导管上皮作bcl-2蛋白阳性对照。
1.2.3 免疫组化染色阳性结果判断标准 阳性细胞为在细胞浆或/和细胞核内呈黄色。参照文献〔1～3〕行细胞分级。①p21阳性分级：阳性细胞数<20%为(-)，20%～50%为(+)，>50%为(++)；②p53阳性分级：阳性细胞数<5%为(-)，5%～40%为(+)，>40%为(++)；③bcl-2阳性分级：阳性细胞数<10%为(-)，10%～40%为(+)，>40%为(++)。
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1.3 统计学处理
阳性率之间比较应用卡方检验或确切概率计算法；3种癌基因蛋白表达水平与临床病理因素的关系应用秩和检验；相关分析应用等级相关分析。
2 结果
2.1 胆囊不同病变组织中3种癌基因蛋白的表达
结果见表1。从表1可见，胆囊癌组织中p21及p53蛋白表达阳性率均为52.5%，而在胆囊腺瘤型息肉中均为阴性；低分化腺癌与高分化腺癌比较，p53蛋白表达阳性率明显升高(P<0.01)，而bcl-2表达阳性率明显降低(P<0.01)。
表1 胆囊不同病变组织中3种癌基因蛋白的表达 病变
n
p21表达阳性
, 百拇医药
p53表达阳性
bcl-2表达阳性
n
百分率(%)
n
百分率(%)
n
百分率(%)
胆囊癌
40
21
52.5*
21
, 百拇医药
52.5*
28
70.0
低分化腺癌
13
8
61.5
11
84.6△
6
46.2△
高分化腺癌
, 百拇医药
23
12
52.5
7
30.4
19
82.6
鳞癌
4
1
25.0
3
75.0
, http://www.100md.com 3
75.0
胆囊腺瘤型息肉
8
0
0.0
0
0.0
8
100.0
与胆囊腺瘤型息肉比较，*P<0.01；与高分化腺癌比较，△P<0.01
2.2 3种癌基因蛋白的表达与肿瘤转移的关系
, 百拇医药
结果见表2。由表2可见，p21及p53蛋白的表达在有转移者中明显高于无转移者(P<0.05)。
表2 3种癌基因蛋白表达与肿瘤转移的关系 肿瘤转移
n
p21表达阳性
p53表达阳性
bcl-2表达阳性
n
百分率(%)
n
百分率(%)
n
, 百拇医药
百分率(%)
有转移
18
13
72.2*
13
72.2*
10
55.6
无转移
22
8
36.4
, 百拇医药
8
36.4
18
81.8
与无转移者比较，*P<0.05
2.3 3种癌基因蛋白共同表达与胆囊癌分化程度及转移的关系
结果见表3。由表3可见，p21及p53表达均为阳性者，其阳性率在低分化腺癌和肿瘤有转移者中明显高于高分化腺癌及无转移者(P<0.05)，而p21及bcl-2表达和p53及bcl-2表达均为阳性者，其阳性率在低、高分化腺癌间或肿瘤有无转移间无显著差异(P>0.05)。
表3 3种癌基因共同表达与肿瘤分化程度及转移的关系
, 百拇医药 n
p21+p53表达阳性
p21+bcl-2表达阳性
p53+bcl-2表达阳性
n
百分率(%)
n
百分率(%)
n
百分率(%)
低分化腺癌
13
7
, http://www.100md.com
53.8*
3
23.1
4
30.8
高分化腺癌
23
4
17.4
10
43.5
4
17.4
, 百拇医药
有转移
18
9
50.0△
7
38.9
5
27.8
无转移
22
3
13.6
6
, 百拇医药
27.3
5
22.7
与高分化腺癌比较，*P<0.05；与无转移者比较，△P<0.05
3 讨论
细胞恶变被认为是一个基因调控的多步骤过程，癌基因的激活与扩增，以及抑癌基因的丢失与失活是这一过程的关键因素。它们单独或协同作用改变了细胞正常的生长和分化过程，从而逐步导致了细胞的恶性转化。
p21蛋白是ras基因族共同表达的产物。ras基因的致瘤作用表现为正常p21蛋白的出现。有文献报道，在肺癌、甲状腺癌、结肠癌和胰腺癌组织中均有p21蛋白的表达，并认为其与肿瘤分化程度及预后有关。Masakiko等〔4〕研究结果表明，在胆囊炎、早期胆囊癌及晚期胆囊癌组织中，p21表达阳性率分别为33%(3/9)、92%(12/13)和67%(6/9)，认为p21蛋白主要是在胆囊癌早期表达。本研究结果显示，p21蛋白表达阳性率在胆囊腺瘤型息肉、无转移胆囊癌及有转移胆囊癌组织中分别为0%(0/8)、36%(8/22)和72%(13/18)，认为p21蛋白主要在胆囊癌晚期表达。因此，p21蛋白可作为判断胆囊癌的恶性程度以及预后的重要指标之一。
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Wee等〔5〕和Dia〔6〕测定胆囊癌组织中p53蛋白表达阳性率分别为89%及47%，Wee认为，p53蛋白主要是在胆囊癌晚期表达，而Dia则认为p53蛋白主要是在胆囊癌早期表达。本研究发现，胆囊癌组织中p53蛋白的表达阳性率为52.5%，低分化腺癌和伴转移病例之表达阳性率高于高分化腺癌和未转移病例。提示p53蛋白表达阳性的胆囊癌预后不良，与Wee等的观察较一致。
bcl-2蛋白具有抑制细胞凋亡的活性，其表达增强使细胞的生存期延长，并通过基因突变的积累导致细胞的恶性转化。有学者近年来发现多种恶性肿瘤组织中的bcl-2蛋白表达，同时观察到恶性程度高的肿瘤bcl-2蛋白表达率低于恶性程度低的肿瘤〔7〕，认为bcl-2蛋白表达的恶性肿瘤预后较好。本研究发现，bcl-2蛋白表达率在胆囊癌与胆囊腺瘤型息肉组织中分别为70%和100%，高分化腺癌表达率明显高于低分化腺癌(P<0.05)。胆囊腺瘤被认为是癌前病变，bcl-2蛋白在其中的高表达率提示bcl-2蛋白可能在胆囊癌发生、发展的早期发挥作用。
, 百拇医药
癌基因理论认为至少有两个或两个以上不同功能异常激活的癌基因各自发挥不同作用，才能使细胞恶性转化〔8〕。本研究发现40例胆囊癌中两个或两个以上癌基因表达阳性率为70%，而胆囊腺瘤型息肉为0%。在鉴别诊断胆囊癌与胆囊息肉时，癌基因蛋白共同表达的特异度+敏感度＝1+0.7＝1.7，有临床应用价值。p21/p53蛋白共同表达阳性率在伴转移癌及低分化腺癌组织中明显高于无转移癌及高分化腺癌(P<0.05)。提示p21和p53蛋白共同表达的胆囊癌恶性程度高和预后不良。
参 考 文 献
1 Kamel D, Puakkd P, Nuorva K, et al. p53 and Cerb-B protein expression in adenocarcinomas and ipithelial dysplasias of the gallbladder. J Pathol, 1993; 107(1)∶67
, 百拇医药
2 Jansson DS, Radosevich JA, Carney WE, et al. An immunohistochemical analysis of ras oncogene expression in epithelial neoplasms of colon. Cancer, 1990; 65(2)∶1329
3 Pilotl S, Collinni P, Rillke F, et al. Bcl-2 protein expression in carcinomas originating from the follicular epitheliun of the tyroid gland. J Pathol, 1994; 72(1)∶337
4 Masakiko Y, Takahiro F, Baisuke A, et al.Expression of oncogene pr-oducts and growth factors in early gallbladder cancer, advanced gallbladder cancer and chronic cholecystitis. Hum Pathol, 1993; 24(4)∶37
, 百拇医药
5 Wee A, The M, Raju GC, et al. Clinical importance of p53 protein in gallbladder carcinoma and its precursor lesions. J Clin Pathol, 1994; 47(2)∶453
6 Dia K, Doglioni C, Lourinol, et al. P53 and c-erb B-2 protein expression in adenocarcinomas and epithelial dysplasia of the gallbladder. J Pathol, 1993; 170(4)∶67
7 Rasbridge SA, Gillett CE, Symour AM, et al. The effect of che-motherapy on morpholohy, cellular proliferation aptosis and oncoprotein expression in primary breast carcinoma. Cancer, 1994; 70(1)∶335
8 江希明，郑 树，丁仁瑞. 肿瘤生物学. 第1版. 杭州：浙江科学技术出版社， 1990∶92～135
(1998-01-29收稿，1999-01-08修回), http://www.100md.com
单位：陈劲松 海南省人民医院肝胆外科(海口 570311)；熊寿芝 杨竹林 湖南医科大学附二院肝胆外科
关键词：胆囊癌；胆囊息肉；免疫组化；癌基因蛋白
中国普外基础与临床杂志990208 摘要 为探讨胆囊良恶性病变组织中p21、p53及bcl-2癌基因蛋白的表达及其与胆囊癌预后的关系，以及在胆囊良恶性病变的鉴别诊断中的作用，采用免疫组织化学ABC法，分别测定了40例胆囊癌及8例胆囊腺瘤型息肉组织中p21、p53及bcl-2癌基因蛋白的表达情况。结果：胆囊癌组织中p21、p53及bcl-2癌基因蛋白表达阳性率分别为52.5%、52.5%和70.0%；在胆囊腺瘤型息肉中3者分别为0%、0%和100%；其中p53蛋白表达阳性率在低分化腺癌中明显高于高分化腺癌(P<0.01)，bcl-2蛋白表达阳性率在低分化腺癌中也明显低于高分化腺癌(P<0.01)。本实验结果提示：p21及p53蛋白表达可能是胆囊癌预后不良的重要指标，检测p21、p53及bcl-2蛋白表达情况在胆囊癌与胆囊息肉的鉴别诊断中有一定意义。
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THE EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF P21, P53, BCL-2 ONCOPROTEIN IN GALLBLADDER CARCINOMA
Chen Jingsong, Xiong Shouzhi, Yang Zhulin.
Department of Hepatobiliary Surgery, The People's Hospital of Hainan Province, Haikou 570311
Abstract The expression of p21, p53, bcl-2 oncoprotein was evaluated using immunohistochemistry in 40 patients with gallbladder carcinoma and 8 patients with gallbladder adenomous polyp. In the study, the positive rate of expression of p21, p53 and bcl-2 oncoprotein was 52.5%, 52.5% and 70.0% respectively in gallbladder carcinoma, while, in gallbladder polyp, they were 0%, 0% and 100% respectively. The positive rate of expression of p53 oncoprotein was significantly higher in poor-differentiated adenocarcinomas than in well-differentiated ones (P<0.05). The converse was true for bcl-2 oncoprotein. The positive rate of expression of p21 and p53 oncoprotein was significantly higher in metastatic group than in non-metastatic one. These results suggest that the patients with the expression of p21, p53 might be of poor-prognosis.
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Key words Gallbladder carcinoma Gallbladder adenomous polyp Immunohistochemistry Oncoprotein
近年来，关于p21、p53及bcl-2在各种恶性肿瘤组织中的表达情况的研究文献报道较多，但关于胆囊组织中的癌基因表达情况国内外文献少见报道。应用免疫组化ABC法对40例胆囊癌及8例胆囊腺瘤型息肉中p21、p53及bcl-2癌基因蛋白的表达进行了测定，旨在观察3者在临床中的意义。
1 对象与方法
1.1 研究对象
选择湖南医科大学附二院(1985～1993年)手术并经病理组织学诊断的胆囊癌40例，男7例，女33例，平均年龄50.8±8.9岁。术中发现或术后病理诊断淋巴结或邻近器官有转移者18例，无转移者22例。所有病例术前均未行放疗或化疗。胆囊腺瘤型息肉8例，男3例，女5例，平均年龄36±9.2岁，息肉直径0.7±0.3cm。
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1.2 方法
1.2.1 主要试剂 ①鼠抗人单克隆抗体：p21(1/30)、p53(1/100)及bcl-2(1/100)均为Dako公司产品；②生物素标记羊抗鼠IgG(1/100)及ABC试剂盒(1/500)均为Sigma公司产品。
1.2.2 免疫组化方法 所有标本均经10%甲醛固定，常规石蜡包埋切片，切片厚4μm，参照文献〔1〕的方法行ABC免疫组化染色，于光镜下观察。同时用PBS液代替第一抗体作替代对照，用已知的p21及p53蛋白阳性乳腺癌组织作阳性对照，以及选用正常胰腺导管上皮作bcl-2蛋白阳性对照。
1.2.3 免疫组化染色阳性结果判断标准 阳性细胞为在细胞浆或/和细胞核内呈黄色。参照文献〔1～3〕行细胞分级。①p21阳性分级：阳性细胞数<20%为(-)，20%～50%为(+)，>50%为(++)；②p53阳性分级：阳性细胞数<5%为(-)，5%～40%为(+)，>40%为(++)；③bcl-2阳性分级：阳性细胞数<10%为(-)，10%～40%为(+)，>40%为(++)。
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1.3 统计学处理
阳性率之间比较应用卡方检验或确切概率计算法；3种癌基因蛋白表达水平与临床病理因素的关系应用秩和检验；相关分析应用等级相关分析。
2 结果
2.1 胆囊不同病变组织中3种癌基因蛋白的表达
结果见表1。从表1可见，胆囊癌组织中p21及p53蛋白表达阳性率均为52.5%，而在胆囊腺瘤型息肉中均为阴性；低分化腺癌与高分化腺癌比较，p53蛋白表达阳性率明显升高(P<0.01)，而bcl-2表达阳性率明显降低(P<0.01)。
表1 胆囊不同病变组织中3种癌基因蛋白的表达 病变
n
p21表达阳性
, 百拇医药
p53表达阳性
bcl-2表达阳性
n
百分率(%)
n
百分率(%)
n
百分率(%)
胆囊癌
40
21
52.5*
21
, 百拇医药
52.5*
28
70.0
低分化腺癌
13
8
61.5
11
84.6△
6
46.2△
高分化腺癌
, 百拇医药
23
12
52.5
7
30.4
19
82.6
鳞癌
4
1
25.0
3
75.0
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75.0
胆囊腺瘤型息肉
8
0
0.0
0
0.0
8
100.0
与胆囊腺瘤型息肉比较，*P<0.01；与高分化腺癌比较，△P<0.01
2.2 3种癌基因蛋白的表达与肿瘤转移的关系
, 百拇医药
结果见表2。由表2可见，p21及p53蛋白的表达在有转移者中明显高于无转移者(P<0.05)。
表2 3种癌基因蛋白表达与肿瘤转移的关系 肿瘤转移
n
p21表达阳性
p53表达阳性
bcl-2表达阳性
n
百分率(%)
n
百分率(%)
n
, 百拇医药
百分率(%)
有转移
18
13
72.2*
13
72.2*
10
55.6
无转移
22
8
36.4
, 百拇医药
8
36.4
18
81.8
与无转移者比较，*P<0.05
2.3 3种癌基因蛋白共同表达与胆囊癌分化程度及转移的关系
结果见表3。由表3可见，p21及p53表达均为阳性者，其阳性率在低分化腺癌和肿瘤有转移者中明显高于高分化腺癌及无转移者(P<0.05)，而p21及bcl-2表达和p53及bcl-2表达均为阳性者，其阳性率在低、高分化腺癌间或肿瘤有无转移间无显著差异(P>0.05)。
表3 3种癌基因共同表达与肿瘤分化程度及转移的关系
, 百拇医药 n
p21+p53表达阳性
p21+bcl-2表达阳性
p53+bcl-2表达阳性
n
百分率(%)
n
百分率(%)
n
百分率(%)
低分化腺癌
13
7
, http://www.100md.com
53.8*
3
23.1
4
30.8
高分化腺癌
23
4
17.4
10
43.5
4
17.4
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有转移
18
9
50.0△
7
38.9
5
27.8
无转移
22
3
13.6
6
, 百拇医药
27.3
5
22.7
与高分化腺癌比较，*P<0.05；与无转移者比较，△P<0.05
3 讨论
细胞恶变被认为是一个基因调控的多步骤过程，癌基因的激活与扩增，以及抑癌基因的丢失与失活是这一过程的关键因素。它们单独或协同作用改变了细胞正常的生长和分化过程，从而逐步导致了细胞的恶性转化。
p21蛋白是ras基因族共同表达的产物。ras基因的致瘤作用表现为正常p21蛋白的出现。有文献报道，在肺癌、甲状腺癌、结肠癌和胰腺癌组织中均有p21蛋白的表达，并认为其与肿瘤分化程度及预后有关。Masakiko等〔4〕研究结果表明，在胆囊炎、早期胆囊癌及晚期胆囊癌组织中，p21表达阳性率分别为33%(3/9)、92%(12/13)和67%(6/9)，认为p21蛋白主要是在胆囊癌早期表达。本研究结果显示，p21蛋白表达阳性率在胆囊腺瘤型息肉、无转移胆囊癌及有转移胆囊癌组织中分别为0%(0/8)、36%(8/22)和72%(13/18)，认为p21蛋白主要在胆囊癌晚期表达。因此，p21蛋白可作为判断胆囊癌的恶性程度以及预后的重要指标之一。
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Wee等〔5〕和Dia〔6〕测定胆囊癌组织中p53蛋白表达阳性率分别为89%及47%，Wee认为，p53蛋白主要是在胆囊癌晚期表达，而Dia则认为p53蛋白主要是在胆囊癌早期表达。本研究发现，胆囊癌组织中p53蛋白的表达阳性率为52.5%，低分化腺癌和伴转移病例之表达阳性率高于高分化腺癌和未转移病例。提示p53蛋白表达阳性的胆囊癌预后不良，与Wee等的观察较一致。
bcl-2蛋白具有抑制细胞凋亡的活性，其表达增强使细胞的生存期延长，并通过基因突变的积累导致细胞的恶性转化。有学者近年来发现多种恶性肿瘤组织中的bcl-2蛋白表达，同时观察到恶性程度高的肿瘤bcl-2蛋白表达率低于恶性程度低的肿瘤〔7〕，认为bcl-2蛋白表达的恶性肿瘤预后较好。本研究发现，bcl-2蛋白表达率在胆囊癌与胆囊腺瘤型息肉组织中分别为70%和100%，高分化腺癌表达率明显高于低分化腺癌(P<0.05)。胆囊腺瘤被认为是癌前病变，bcl-2蛋白在其中的高表达率提示bcl-2蛋白可能在胆囊癌发生、发展的早期发挥作用。
, 百拇医药
癌基因理论认为至少有两个或两个以上不同功能异常激活的癌基因各自发挥不同作用，才能使细胞恶性转化〔8〕。本研究发现40例胆囊癌中两个或两个以上癌基因表达阳性率为70%，而胆囊腺瘤型息肉为0%。在鉴别诊断胆囊癌与胆囊息肉时，癌基因蛋白共同表达的特异度+敏感度＝1+0.7＝1.7，有临床应用价值。p21/p53蛋白共同表达阳性率在伴转移癌及低分化腺癌组织中明显高于无转移癌及高分化腺癌(P<0.05)。提示p21和p53蛋白共同表达的胆囊癌恶性程度高和预后不良。
参 考 文 献
1 Kamel D, Puakkd P, Nuorva K, et al. p53 and Cerb-B protein expression in adenocarcinomas and ipithelial dysplasias of the gallbladder. J Pathol, 1993; 107(1)∶67
, 百拇医药
2 Jansson DS, Radosevich JA, Carney WE, et al. An immunohistochemical analysis of ras oncogene expression in epithelial neoplasms of colon. Cancer, 1990; 65(2)∶1329
3 Pilotl S, Collinni P, Rillke F, et al. Bcl-2 protein expression in carcinomas originating from the follicular epitheliun of the tyroid gland. J Pathol, 1994; 72(1)∶337
4 Masakiko Y, Takahiro F, Baisuke A, et al.Expression of oncogene pr-oducts and growth factors in early gallbladder cancer, advanced gallbladder cancer and chronic cholecystitis. Hum Pathol, 1993; 24(4)∶37
, 百拇医药
5 Wee A, The M, Raju GC, et al. Clinical importance of p53 protein in gallbladder carcinoma and its precursor lesions. J Clin Pathol, 1994; 47(2)∶453
6 Dia K, Doglioni C, Lourinol, et al. P53 and c-erb B-2 protein expression in adenocarcinomas and epithelial dysplasia of the gallbladder. J Pathol, 1993; 170(4)∶67
7 Rasbridge SA, Gillett CE, Symour AM, et al. The effect of che-motherapy on morpholohy, cellular proliferation aptosis and oncoprotein expression in primary breast carcinoma. Cancer, 1994; 70(1)∶335
8 江希明，郑 树，丁仁瑞. 肿瘤生物学. 第1版. 杭州：浙江科学技术出版社， 1990∶92～135
(1998-01-29收稿，1999-01-08修回), http://www.100md.com