纤溶酶原激活物抑制剂-1与肾脏疾病
作者：陈高翔 屈燧林
单位：华西医科大学附属第一医院肾内科(成都，610041)
关键词：纤溶酶原激活物抑制剂；肾脏疾病；细胞外基质
肾小球硬化与肾间质纤维化归根到底是细胞外基质
肾小球硬化与肾间质纤维化归根到底是细胞外基质(ECM)合成与降解失衡导致ECM过度积聚的结果。目前已经知道参与ECM降解的酶主要有三类：①基质金属蛋白酶(MMP)；②丝氨酸蛋白酶；③半胱氨酸蛋白酶。其中主要的是前二类。ECM的蛋白质成分降解均需要ECM降解蛋白酶的参与[1]。而纤溶酶原激活剂(PA)/纤溶酶系统在丝氨酸蛋白酶中占重要地位，它包括纤溶酶原、纤溶酶、PA、纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)。有四种丝氨酸蛋白酶抑制剂与PA/纤溶酶系统相关，即PAI-1、PAI-2、α2-抗纤溶酶(α2-AP)、蛋白酶连接素(PN-I)。在血浆中PAI-1是主要的PAI[2]。
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1 结构与功能
PAI-1属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族，是一种单链糖蛋白，分子量为50000。成熟的蛋白由379个氨基酸残基组成，其活性中心是346位的Arg与347位的Met残基处。它是以活性形式分泌出来的一种抗蛋白酶，半衰期短，很快被转化为无活性的形式，但它可通过外连接蛋白(Vn)的粘附，增加其活性形式的稳定性[3]。
纤溶酶是由纤溶酶原经PA裂解产生的，这一过程受PA及PAI(其中主要是PAI-1)间相互作用平衡的调控。纤溶酶可直接参与ECM蛋白质成分如层粘连蛋白(LN)、纤维连接蛋白(FN)等的降解[1]，而且它还是MMP激活剂之一，被激活的MMP可降解ECM的胶原成分[4]。PAI-1是PA快速、专一有效的生理抑制因子，它通过活性中心与PA形成1∶1复合物，使PA失活，从而抑制其后的激活反应。PA与PAI-1是ECM降解过程中保持蛋白质溶解与抗蛋白溶解间平衡的主要参与者[1]。在组织内PAI-1水平升高和(或)活性增强，可抑制PA对ECM降解，引起ECM聚集，导致组织纤维化。
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2 合成与调控
许多激素和化学因子可以影响体外培养细胞PAI-1的合成，这些调控大多在转录水平上进行。胰岛素加入培养的肝细胞中可刺激产生PAI-1[5]。重组人类红细胞生成素(r-HuEpo)可刺激培养的静脉内皮细胞合成PAI-1mRNA及蛋白质，使PAI-1水平升高，且这一升高呈时间、剂量依赖性[6]。用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)处理鼠系膜细胞可显著提高PAI-1基因转录和PAI-1mRNA水平，但不改变PAI-1mRNA半衰期，且PAI-1升高同时伴PA活性降低。该研究还发现，AngⅡ该作用一方面通过直接迅速上调PAI-1基因转录，引起PAI-1短暂上升，另一方面通过转化生长因子β(TGF-β)引起PAI-1/PA持久改变，后一作用因抑制降解，更利于ECM的堆积[7]。国内邓义斌等[8]报道，糖基化终末产物(AGEs)可抑制肾小球系膜细胞增殖，促进FN分泌，同时上调PAI-1活性。一些化学因子在刺激ECM合成的同时，也通过抑制蛋白酶参与ECM的降解，在培养的人肾系膜细胞中加入IL-1β发现PAI-1下降，其下降程度与IL-1β呈时间、浓度依赖性；Nothern杂交也表现IL-1β刺激后有t-PAmRNA上升和PAI-1mRNA水平下降[9]。但IL-1β[10]与肿瘤坏死因子(TNF)α均可诱导血管内皮细胞表达PAI-1[11]。TGF-β加入培养的正常肾小球 可明显降低PA活性，提高PAI-1合成；病变肾小球PA活性也降低，PAI-1合成增加及PAI-1沉积增多[12]。脂多糖(LPS)、TNFα、TGF-β在转录水平上刺激内皮细胞PAI-1基因，提高PAI-1水平[13]。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、TGF-β均可诱导PAI-1和金属蛋白酶抑制剂(TIMP)的表达[14]。
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3 分 布
一般情况下，PAI-1mRNA在鼠的动脉、肺、心、脂肪组织中较多，而在肾、肝及其它组织中较少。LPS处理鼠后，用原位杂交方法可以发现在肾小球、小管周围细胞中PAI-1mRNA表达，这些细胞也表达内皮细胞特异的标志物vW因子，而且在髓质小管内皮细胞、肾脏所有动、静脉内皮细胞可发现有PAI-1mRNA表达；而对照组PAI-1mRNA仅在肾乳头、肾动脉肌层呈低水平表达。免疫组化显示，PAI-1位于表达PAI-1mRNA细胞的胞浆中[15]。在鼠的狼疮性肾炎模型中，PAI-1表达见于肾小球、小管与血管，分布于内皮细胞、壁层上皮细胞、小管上皮细胞、间质中浸润的单个核细胞，上述细胞在正常肾组织中不能检出PAI-1；而在对照组仅在血管平滑肌细胞、肾乳头有低水平PAI-1mRNA表达；且组织中PAI-1水平与疾病严重程度相关[16]。
4 PAI-1研究现状
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越来越多的研究表明，血中PAI-1水平受基因调控。目前已发现有8个不同的PAI-1多态性基因：①两个(CA)。重复多态性(一个在启动区，一个位于第4内含子)[17，18]；②HindⅢ限制片断长度多态性(RFLP)[19]；③启动区-675位点上4G/5G多态性[20]。新近又发现四个：①-844、+9785两个位点G、A互换；②1，1053位点T、G互换；③11320～11345间缺失9个核苷的三次重复序列[21]。研究发现，某些PAI-1多态性基因与疾病如NIDDM[22]、心肌梗塞(MI)[23]中PAI-1水平明显相关。无动脉粥样硬化临床证据的普通人群中4G/5G多态性与循环中PAI-1浓度相关，而且一级亲属有冠心病史的健康人群中PAI-1 4G/5G高于亲属中无阳性病史的健康人群，且4G等位基因频率也高，提示PAI-1 4G/5G多态性一定程度上是有家族史的冠心病的危险因素，也支持了4G变异是可遗传的冠脉危险因素的推测[24]。许多因素参与了PAI-1基因调控，几乎认为是通过影响PAI-1基因转录进行，这些调节因子通过PAI-1基因内与之有直接或间接相关的DNA序列发挥作用。通过转染的人脐静脉内皮细胞发现，VLDL反应位于PAI-1基因启动区-672～-657间，其活性受邻近4G/5G多态性及上游VLDL诱导的转录因子结合位点的影响，为VLDL与PAI-1活性间及PAI-1与甘油三酯间关系提供分子理论基础[25]。Smad蛋白在TGF-β胞内信号传递中起关键作用。Smad2、Smad3磷酸化后与Smad4形成复合体进入核内作用于靶基因，研究发现Smad3/Smad4结合序列即位于PAI-1基因启动内的CAGA盒，且CAGA盒突变将使PAI-1基因失去对TGF-β的反应，而且TGF-β诱导了Smad3/Smad4复合体与CAGA盒结合[26]。用虫荧光素构建一段含PAI-1 5′侧的序列转染到鼠主动脉平滑肌细胞中，糖作用于转染的细胞，通过5′侧-85～-42bp间两个相连的Sp1(一种调节转录的反式作用因子家族)，从Sp1释放出转录抑制物从而激活基因[27]。体外转染细胞介导细胞因子作用的DNA序列位于上游第一个1.3kb，Emert等[28]建立的转基因鼠表达的杂合基因含人PAI-1基因-1 272～+75序列，该序列与乳糖操纵子(LacZ)结合，转染基因从胚胎13天起主要由位于外髓的近端小管细胞表达。现在，不同因子在PAI-1基因上作用位点正陆续被发现。
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5 PAI-1与肾脏疾病
在抗体介导的抗肾小管基底膜间质性肾炎的动物模型中，发现ECM堆积很少伴有或无蛋白酶增加，相反与蛋白酶抑制剂TIMP与PAI-1增加相关，且PAI-1mRNA水平与其活性相关[14]。在抗肾小球基底膜肾小球肾炎的动物模型中，观察到病变肾小球的PA活性降低，PAI-1合成增加及PAI-1基质沉积增加，且PA活性降低与PAI-1合成增加先于ECM聚集，应用抗TGF-β后可阻断PAI-1在肾小球的沉积[12]。放射性肾病动物模型中PAI-1mRNA在肾小球表达明显升高，且PAI-1表达与肾小球损害明显相关，应用ACEI与血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(AⅡRA)后可明显减轻肾小球损伤，而且还显著降低受照射肾增高的PAI-1mRNA水平[29]。在同种肾移植慢性排斥的动物实验观察到：t-PA仅在急性排斥阶段上调，而PAI-1在慢性排斥进展阶段被诱导且持续表达，同时伴有移植物中持续性纤维蛋白沉积，免疫组化显示，PAI-1主要位于受损或增生的血管腔内膜，提示PA/PAI-1表达的不平衡与移植物中持续性纤维蛋白沉积物有关，而后者是肾移植失败的原因[30]。研究环孢 霉素A(CsA)引起的慢性肾病发现，CsA由TGF-β介导通过刺激ECM合成和提高PAI-1的合成阻止ECM降解，引起间质性肾炎和动脉病变，ACEI与AⅡRA可减轻CsA引起的肾损害，AngⅡ被阻断后导致TGF-β、PAI-1表达下降同时有ECM成分减少[31]。在人类以ECM堆积为特征的疾病如：IgA肾病、局灶节段性肾小球硬化、新月体肾炎、狼疮性肾炎、糖尿病肾病中，病变肾小球及小管间质有TGF-β同形体表达明显增强，所有有ECM聚集的病例中由TGF-β诱导的PAI-1、FN、EDA+(extra domain A)的沉积明显增多[32]。
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肾间质纤维化是各种终末期肾脏疾病常见的病理改变，引起肾间质纤维化的主要原因是ECM在间质过度的沉积所致。PA与PAI-1间平衡影响ECM合成与降解的过程，PAI-1异常表达将抑制ECM降低，导致ECM堆积。因此维持PA/PAI-1间平衡，预防阻止PAI-1异常表达为延缓肾功能不全保护肾脏将会起到一定作用，也为临床防治肾间质纤维化提供一个新思路。
参考文献
1 Mignatti P. Extracellular matrix remodeling by metalloproteinases and plasminogen activators.Kidney Int，1995，47(suppl 49)：S12
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(1998-11-20收稿，1998-12-22修回), http://www.100md.com
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关键词：纤溶酶原激活物抑制剂；肾脏疾病；细胞外基质
肾小球硬化与肾间质纤维化归根到底是细胞外基质
肾小球硬化与肾间质纤维化归根到底是细胞外基质(ECM)合成与降解失衡导致ECM过度积聚的结果。目前已经知道参与ECM降解的酶主要有三类：①基质金属蛋白酶(MMP)；②丝氨酸蛋白酶；③半胱氨酸蛋白酶。其中主要的是前二类。ECM的蛋白质成分降解均需要ECM降解蛋白酶的参与[1]。而纤溶酶原激活剂(PA)/纤溶酶系统在丝氨酸蛋白酶中占重要地位，它包括纤溶酶原、纤溶酶、PA、纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)。有四种丝氨酸蛋白酶抑制剂与PA/纤溶酶系统相关，即PAI-1、PAI-2、α2-抗纤溶酶(α2-AP)、蛋白酶连接素(PN-I)。在血浆中PAI-1是主要的PAI[2]。
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1 结构与功能
PAI-1属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族，是一种单链糖蛋白，分子量为50000。成熟的蛋白由379个氨基酸残基组成，其活性中心是346位的Arg与347位的Met残基处。它是以活性形式分泌出来的一种抗蛋白酶，半衰期短，很快被转化为无活性的形式，但它可通过外连接蛋白(Vn)的粘附，增加其活性形式的稳定性[3]。
纤溶酶是由纤溶酶原经PA裂解产生的，这一过程受PA及PAI(其中主要是PAI-1)间相互作用平衡的调控。纤溶酶可直接参与ECM蛋白质成分如层粘连蛋白(LN)、纤维连接蛋白(FN)等的降解[1]，而且它还是MMP激活剂之一，被激活的MMP可降解ECM的胶原成分[4]。PAI-1是PA快速、专一有效的生理抑制因子，它通过活性中心与PA形成1∶1复合物，使PA失活，从而抑制其后的激活反应。PA与PAI-1是ECM降解过程中保持蛋白质溶解与抗蛋白溶解间平衡的主要参与者[1]。在组织内PAI-1水平升高和(或)活性增强，可抑制PA对ECM降解，引起ECM聚集，导致组织纤维化。
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2 合成与调控
许多激素和化学因子可以影响体外培养细胞PAI-1的合成，这些调控大多在转录水平上进行。胰岛素加入培养的肝细胞中可刺激产生PAI-1[5]。重组人类红细胞生成素(r-HuEpo)可刺激培养的静脉内皮细胞合成PAI-1mRNA及蛋白质，使PAI-1水平升高，且这一升高呈时间、剂量依赖性[6]。用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)处理鼠系膜细胞可显著提高PAI-1基因转录和PAI-1mRNA水平，但不改变PAI-1mRNA半衰期，且PAI-1升高同时伴PA活性降低。该研究还发现，AngⅡ该作用一方面通过直接迅速上调PAI-1基因转录，引起PAI-1短暂上升，另一方面通过转化生长因子β(TGF-β)引起PAI-1/PA持久改变，后一作用因抑制降解，更利于ECM的堆积[7]。国内邓义斌等[8]报道，糖基化终末产物(AGEs)可抑制肾小球系膜细胞增殖，促进FN分泌，同时上调PAI-1活性。一些化学因子在刺激ECM合成的同时，也通过抑制蛋白酶参与ECM的降解，在培养的人肾系膜细胞中加入IL-1β发现PAI-1下降，其下降程度与IL-1β呈时间、浓度依赖性；Nothern杂交也表现IL-1β刺激后有t-PAmRNA上升和PAI-1mRNA水平下降[9]。但IL-1β[10]与肿瘤坏死因子(TNF)α均可诱导血管内皮细胞表达PAI-1[11]。TGF-β加入培养的正常肾小球 可明显降低PA活性，提高PAI-1合成；病变肾小球PA活性也降低，PAI-1合成增加及PAI-1沉积增多[12]。脂多糖(LPS)、TNFα、TGF-β在转录水平上刺激内皮细胞PAI-1基因，提高PAI-1水平[13]。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、TGF-β均可诱导PAI-1和金属蛋白酶抑制剂(TIMP)的表达[14]。
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3 分 布
一般情况下，PAI-1mRNA在鼠的动脉、肺、心、脂肪组织中较多，而在肾、肝及其它组织中较少。LPS处理鼠后，用原位杂交方法可以发现在肾小球、小管周围细胞中PAI-1mRNA表达，这些细胞也表达内皮细胞特异的标志物vW因子，而且在髓质小管内皮细胞、肾脏所有动、静脉内皮细胞可发现有PAI-1mRNA表达；而对照组PAI-1mRNA仅在肾乳头、肾动脉肌层呈低水平表达。免疫组化显示，PAI-1位于表达PAI-1mRNA细胞的胞浆中[15]。在鼠的狼疮性肾炎模型中，PAI-1表达见于肾小球、小管与血管，分布于内皮细胞、壁层上皮细胞、小管上皮细胞、间质中浸润的单个核细胞，上述细胞在正常肾组织中不能检出PAI-1；而在对照组仅在血管平滑肌细胞、肾乳头有低水平PAI-1mRNA表达；且组织中PAI-1水平与疾病严重程度相关[16]。
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越来越多的研究表明，血中PAI-1水平受基因调控。目前已发现有8个不同的PAI-1多态性基因：①两个(CA)。重复多态性(一个在启动区，一个位于第4内含子)[17，18]；②HindⅢ限制片断长度多态性(RFLP)[19]；③启动区-675位点上4G/5G多态性[20]。新近又发现四个：①-844、+9785两个位点G、A互换；②1，1053位点T、G互换；③11320～11345间缺失9个核苷的三次重复序列[21]。研究发现，某些PAI-1多态性基因与疾病如NIDDM[22]、心肌梗塞(MI)[23]中PAI-1水平明显相关。无动脉粥样硬化临床证据的普通人群中4G/5G多态性与循环中PAI-1浓度相关，而且一级亲属有冠心病史的健康人群中PAI-1 4G/5G高于亲属中无阳性病史的健康人群，且4G等位基因频率也高，提示PAI-1 4G/5G多态性一定程度上是有家族史的冠心病的危险因素，也支持了4G变异是可遗传的冠脉危险因素的推测[24]。许多因素参与了PAI-1基因调控，几乎认为是通过影响PAI-1基因转录进行，这些调节因子通过PAI-1基因内与之有直接或间接相关的DNA序列发挥作用。通过转染的人脐静脉内皮细胞发现，VLDL反应位于PAI-1基因启动区-672～-657间，其活性受邻近4G/5G多态性及上游VLDL诱导的转录因子结合位点的影响，为VLDL与PAI-1活性间及PAI-1与甘油三酯间关系提供分子理论基础[25]。Smad蛋白在TGF-β胞内信号传递中起关键作用。Smad2、Smad3磷酸化后与Smad4形成复合体进入核内作用于靶基因，研究发现Smad3/Smad4结合序列即位于PAI-1基因启动内的CAGA盒，且CAGA盒突变将使PAI-1基因失去对TGF-β的反应，而且TGF-β诱导了Smad3/Smad4复合体与CAGA盒结合[26]。用虫荧光素构建一段含PAI-1 5′侧的序列转染到鼠主动脉平滑肌细胞中，糖作用于转染的细胞，通过5′侧-85～-42bp间两个相连的Sp1(一种调节转录的反式作用因子家族)，从Sp1释放出转录抑制物从而激活基因[27]。体外转染细胞介导细胞因子作用的DNA序列位于上游第一个1.3kb，Emert等[28]建立的转基因鼠表达的杂合基因含人PAI-1基因-1 272～+75序列，该序列与乳糖操纵子(LacZ)结合，转染基因从胚胎13天起主要由位于外髓的近端小管细胞表达。现在，不同因子在PAI-1基因上作用位点正陆续被发现。
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5 PAI-1与肾脏疾病
在抗体介导的抗肾小管基底膜间质性肾炎的动物模型中，发现ECM堆积很少伴有或无蛋白酶增加，相反与蛋白酶抑制剂TIMP与PAI-1增加相关，且PAI-1mRNA水平与其活性相关[14]。在抗肾小球基底膜肾小球肾炎的动物模型中，观察到病变肾小球的PA活性降低，PAI-1合成增加及PAI-1基质沉积增加，且PA活性降低与PAI-1合成增加先于ECM聚集，应用抗TGF-β后可阻断PAI-1在肾小球的沉积[12]。放射性肾病动物模型中PAI-1mRNA在肾小球表达明显升高，且PAI-1表达与肾小球损害明显相关，应用ACEI与血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(AⅡRA)后可明显减轻肾小球损伤，而且还显著降低受照射肾增高的PAI-1mRNA水平[29]。在同种肾移植慢性排斥的动物实验观察到：t-PA仅在急性排斥阶段上调，而PAI-1在慢性排斥进展阶段被诱导且持续表达，同时伴有移植物中持续性纤维蛋白沉积，免疫组化显示，PAI-1主要位于受损或增生的血管腔内膜，提示PA/PAI-1表达的不平衡与移植物中持续性纤维蛋白沉积物有关，而后者是肾移植失败的原因[30]。研究环孢 霉素A(CsA)引起的慢性肾病发现，CsA由TGF-β介导通过刺激ECM合成和提高PAI-1的合成阻止ECM降解，引起间质性肾炎和动脉病变，ACEI与AⅡRA可减轻CsA引起的肾损害，AngⅡ被阻断后导致TGF-β、PAI-1表达下降同时有ECM成分减少[31]。在人类以ECM堆积为特征的疾病如：IgA肾病、局灶节段性肾小球硬化、新月体肾炎、狼疮性肾炎、糖尿病肾病中，病变肾小球及小管间质有TGF-β同形体表达明显增强，所有有ECM聚集的病例中由TGF-β诱导的PAI-1、FN、EDA+(extra domain A)的沉积明显增多[32]。
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肾间质纤维化是各种终末期肾脏疾病常见的病理改变，引起肾间质纤维化的主要原因是ECM在间质过度的沉积所致。PA与PAI-1间平衡影响ECM合成与降解的过程，PAI-1异常表达将抑制ECM降低，导致ECM堆积。因此维持PA/PAI-1间平衡，预防阻止PAI-1异常表达为延缓肾功能不全保护肾脏将会起到一定作用，也为临床防治肾间质纤维化提供一个新思路。
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(1998-11-20收稿，1998-12-22修回), http://www.100md.com