抗-Thy1.1单克隆抗体诱发大鼠系膜增殖性肾炎模型
作者：达展云 钱桐荪
单位：南通医学院附属医院肾内科(南通，226001)
关键词：抗-Thy1.1单克隆抗体；系膜增殖性肾炎；发病机制
肾脏病与透析肾移植杂志990213
系膜增殖性肾炎(MsPGN)是人类原发性肾小球疾病的最常见病理类型。晚期可发展为肾功能衰竭，严重威胁了人类的健康。然而关于MsPGN的发病机制尚不完全清楚，为了进一步开展有关MsPGN发病机制及治疗方面的实验研究，我们用抗-Thy1.1单克隆抗体成功地诱发了大鼠系膜增殖性肾炎模型。
1 材料和方法
1.1 材料 雄性Wistar大鼠(180～220g)购自中科院上海实验动物中心，抗-Thy1.1单克隆抗体由日本Niigata大学医学部肾脏病研究中心惠赠，PCNA(C10)单克隆抗体及S-P(标记链霉菌亲合物蛋白-生物素)购自福州迈新生物技术开发公司。
, http://www.100md.com
1.2 动物分组及模型的制备 40只Wistar大鼠随机分为两组，每组20只。纯化的BALB/C小鼠IgG(0.5mg/200g.周-1)与完全福氏佐剂混和，在大鼠背、颈、四足掌皮下多点注射预免疫。一周后，模型组：从大鼠尾静脉注射抗-Thy1.1单克隆抗体，剂量为0.5mg/(200g.周)；再过一周后，再注射抗-Thy1.1单克隆抗体一次，方法、剂量同前，以作加强免疫。对照组：从尾静脉注射正常兔血清1ml/(200g.周)，方法同前。
1.3 观察指标 所有动物于实验前、第一次注射抗-Thy1.1单抗后第一、二、三、四周末进代谢笼，收集24h尿，作尿蛋白测定(采用磺硫酸比浊法)、尿红细胞检查，于实验前及第四周末采血作肾功能测定。于第一、二、三、四周末分批处死动物，作肾组织学检查，包括光镜及肾组织中增殖细胞核抗原(PCNA)检测。
1.4 免疫组化染色 将石蜡包埋的肾组织切成4μm切片，按S-P试剂盒说明书进行染色。高倍镜下细胞核内褐色颗粒状着色为PCNA阳性细胞。高倍镜下计数每例肾小球、肾小管间质(以每100个有核细胞为单位)中的PCNA阳性细胞。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 24h尿蛋白测定 实验前每组尿蛋白均小于10mg/24h，组间差异不显著。在第一、二、三、四周末，模型组尿蛋白明显高于对照组，两组差异显著(P<0.01)，见表1
表1 24h尿蛋白定量(
±s mg/24h)
实验前
第一周末
第二周末
第三周末
第四周末
模型组
, http://www.100md.com
6.23±3.15
131.64±38.53
169.88±45.73
141.62±54.32
98.06±24.70
对照组
6.35±2.24
7.02±3.28
6.68±2.16
9.25±3.12
6.76±2.88
, 百拇医药 2.2 肾功能测定 实验前，测定正常大鼠的肾功能，尿素氮为6.55±0.72mmol/L，血清肌酐为72.4±16.27μmol/L，两组在不同时期肾功能检查结果均在正常范围。
2.3 尿红细胞检查 尿红细胞>3个/HP为镜下血尿。实验前及第一周末，两组大鼠均无镜下血尿。第二、三、四周末，模型组有80%的大鼠出现镜下血尿(+～4+)，而对照组均为阴性。
2.4 肾组织学检查 ①光镜：模型组见肾小球毛细血管及基底膜基本正常，肾小球系膜细胞弥漫性增多伴基质增加，肾小管间质水肿，各期间均未见肾小球纤维化及硬化，而对照组则无上述变化。②肾组织中PCNA表达：各时期两组肾小球内PCNA阳性细胞数相近，差异不显著，而模型组肾小管间质中PCNA阳性细胞数明显高于对照组(P均<0.01)，见表2。
表2 肾小管间质中PCNA阳性细胞数(±s)
, 百拇医药
第一周末
第二周末
第三周末
第四周末
模型组
68.54±16.19
71.9±17.82
67.6±18.05
89.0±20.84
对照组
4.1±1.66
3.9±1.68
, http://www.100md.com
3.8±1.39
3.4±2.07
3 讨 论
抗-Thy1.1肾炎模型临床上多表现为蛋白尿和血尿，病理上多表现为系膜细胞增生，细胞外基质增加，后期发生肾小球硬化，这与人类系膜增殖性肾炎相似。Thy1.1抗原为鼠类胸腺细胞表面的糖蛋白，同样存在于大鼠系膜细胞表面。抗-Thy1.1抗体诱发的系膜增殖性肾炎模型以系膜细胞表面Thy1.1为抗原，选择性引起系膜病变[1]。
我们利用抗-Thy1.1单克隆抗体，经加强免疫后成功地诱发了大鼠系膜增殖性肾炎模型，大鼠出现了大量持续性蛋白尿及血尿，病理方面出现了系膜细胞弥漫性增生并基质增多，免疫组化显示肾小管间质中PCNA表达明显增加，但未出现肾小球纤维化及硬化，这可能与实验时间较短有关，文献报道该模型于第8周后可出现肾小球硬化[2]。既往国外文献报道的抗-Thy1.1抗体免疫一次所诱发的模型，虽然能高度选择性地造成系膜细胞损伤，但增殖并不明显，而且是一个“自限性的增殖性肾炎”[3]。我们所诱发的模型能明显造成系膜细胞增殖，细胞外基质增加，而且在不影响肾功能的情况下病变能持续存在。该实验模型在组织形态学上也较接近临床上所见到的系膜增殖性肾炎，可能更适合于系膜增殖性肾炎的实验观察及治疗试验。
, 百拇医药
我们的研究还发现，模型组尿蛋白量的增加与肾小管间质中PCNA阳性细胞的增加是同步的。至于二者的内在联系，我们将作进一步研究。
南通市科委科技基金资助课题(S9828)
参考文献
1 Floege J，Eng E，Young BA et al.Heparine suppersses mesangial cell proliferation and maxtric expansion in experiment mesangioproliferation glomerulonephritis.Kidney Int，1993，43：369
2 Floege J，Brums Mw，Alpers CE et al.Glomerular cell proliferation and PDGF expression precede glomerulos derosis in the remnant kidney model.Kindey Int，1992，41：297
3 Johnson RJ，Raines E，Floege J et al.Inhibition of mesangial cell proliferation and maxtrix expansion in glomerulnephritis in the rat by antibody to platelet derived growth factor.J Exp Med，1992，175：1413
(1999-01-18收稿), http://www.100md.com
单位：南通医学院附属医院肾内科(南通，226001)
关键词：抗-Thy1.1单克隆抗体；系膜增殖性肾炎；发病机制
肾脏病与透析肾移植杂志990213
系膜增殖性肾炎(MsPGN)是人类原发性肾小球疾病的最常见病理类型。晚期可发展为肾功能衰竭，严重威胁了人类的健康。然而关于MsPGN的发病机制尚不完全清楚，为了进一步开展有关MsPGN发病机制及治疗方面的实验研究，我们用抗-Thy1.1单克隆抗体成功地诱发了大鼠系膜增殖性肾炎模型。
1 材料和方法
1.1 材料 雄性Wistar大鼠(180～220g)购自中科院上海实验动物中心，抗-Thy1.1单克隆抗体由日本Niigata大学医学部肾脏病研究中心惠赠，PCNA(C10)单克隆抗体及S-P(标记链霉菌亲合物蛋白-生物素)购自福州迈新生物技术开发公司。
, http://www.100md.com
1.2 动物分组及模型的制备 40只Wistar大鼠随机分为两组，每组20只。纯化的BALB/C小鼠IgG(0.5mg/200g.周-1)与完全福氏佐剂混和，在大鼠背、颈、四足掌皮下多点注射预免疫。一周后，模型组：从大鼠尾静脉注射抗-Thy1.1单克隆抗体，剂量为0.5mg/(200g.周)；再过一周后，再注射抗-Thy1.1单克隆抗体一次，方法、剂量同前，以作加强免疫。对照组：从尾静脉注射正常兔血清1ml/(200g.周)，方法同前。
1.3 观察指标 所有动物于实验前、第一次注射抗-Thy1.1单抗后第一、二、三、四周末进代谢笼，收集24h尿，作尿蛋白测定(采用磺硫酸比浊法)、尿红细胞检查，于实验前及第四周末采血作肾功能测定。于第一、二、三、四周末分批处死动物，作肾组织学检查，包括光镜及肾组织中增殖细胞核抗原(PCNA)检测。
1.4 免疫组化染色 将石蜡包埋的肾组织切成4μm切片，按S-P试剂盒说明书进行染色。高倍镜下细胞核内褐色颗粒状着色为PCNA阳性细胞。高倍镜下计数每例肾小球、肾小管间质(以每100个有核细胞为单位)中的PCNA阳性细胞。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 24h尿蛋白测定 实验前每组尿蛋白均小于10mg/24h，组间差异不显著。在第一、二、三、四周末，模型组尿蛋白明显高于对照组，两组差异显著(P<0.01)，见表1
表1 24h尿蛋白定量(
±s mg/24h)实验前
第一周末
第二周末
第三周末
第四周末
模型组
, http://www.100md.com
6.23±3.15
131.64±38.53
169.88±45.73
141.62±54.32
98.06±24.70
对照组
6.35±2.24
7.02±3.28
6.68±2.16
9.25±3.12
6.76±2.88
, 百拇医药 2.2 肾功能测定 实验前，测定正常大鼠的肾功能，尿素氮为6.55±0.72mmol/L，血清肌酐为72.4±16.27μmol/L，两组在不同时期肾功能检查结果均在正常范围。
2.3 尿红细胞检查 尿红细胞>3个/HP为镜下血尿。实验前及第一周末，两组大鼠均无镜下血尿。第二、三、四周末，模型组有80%的大鼠出现镜下血尿(+～4+)，而对照组均为阴性。
2.4 肾组织学检查 ①光镜：模型组见肾小球毛细血管及基底膜基本正常，肾小球系膜细胞弥漫性增多伴基质增加，肾小管间质水肿，各期间均未见肾小球纤维化及硬化，而对照组则无上述变化。②肾组织中PCNA表达：各时期两组肾小球内PCNA阳性细胞数相近，差异不显著，而模型组肾小管间质中PCNA阳性细胞数明显高于对照组(P均<0.01)，见表2。
表2 肾小管间质中PCNA阳性细胞数(
±s), 百拇医药
第一周末
第二周末
第三周末
第四周末
模型组
68.54±16.19
71.9±17.82
67.6±18.05
89.0±20.84
对照组
4.1±1.66
3.9±1.68
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3.8±1.39
3.4±2.07
3 讨 论
抗-Thy1.1肾炎模型临床上多表现为蛋白尿和血尿，病理上多表现为系膜细胞增生，细胞外基质增加，后期发生肾小球硬化，这与人类系膜增殖性肾炎相似。Thy1.1抗原为鼠类胸腺细胞表面的糖蛋白，同样存在于大鼠系膜细胞表面。抗-Thy1.1抗体诱发的系膜增殖性肾炎模型以系膜细胞表面Thy1.1为抗原，选择性引起系膜病变[1]。
我们利用抗-Thy1.1单克隆抗体，经加强免疫后成功地诱发了大鼠系膜增殖性肾炎模型，大鼠出现了大量持续性蛋白尿及血尿，病理方面出现了系膜细胞弥漫性增生并基质增多，免疫组化显示肾小管间质中PCNA表达明显增加，但未出现肾小球纤维化及硬化，这可能与实验时间较短有关，文献报道该模型于第8周后可出现肾小球硬化[2]。既往国外文献报道的抗-Thy1.1抗体免疫一次所诱发的模型，虽然能高度选择性地造成系膜细胞损伤，但增殖并不明显，而且是一个“自限性的增殖性肾炎”[3]。我们所诱发的模型能明显造成系膜细胞增殖，细胞外基质增加，而且在不影响肾功能的情况下病变能持续存在。该实验模型在组织形态学上也较接近临床上所见到的系膜增殖性肾炎，可能更适合于系膜增殖性肾炎的实验观察及治疗试验。
, 百拇医药
我们的研究还发现，模型组尿蛋白量的增加与肾小管间质中PCNA阳性细胞的增加是同步的。至于二者的内在联系，我们将作进一步研究。
南通市科委科技基金资助课题(S9828)
参考文献
1 Floege J，Eng E，Young BA et al.Heparine suppersses mesangial cell proliferation and maxtric expansion in experiment mesangioproliferation glomerulonephritis.Kidney Int，1993，43：369
2 Floege J，Brums Mw，Alpers CE et al.Glomerular cell proliferation and PDGF expression precede glomerulos derosis in the remnant kidney model.Kindey Int，1992，41：297
3 Johnson RJ，Raines E，Floege J et al.Inhibition of mesangial cell proliferation and maxtrix expansion in glomerulnephritis in the rat by antibody to platelet derived growth factor.J Exp Med，1992，175：1413
(1999-01-18收稿), http://www.100md.com