鼻咽癌中EB病毒感染研究进展
作者：李西融
单位：广西壮族自治区南溪山医院(桂林 541002)
关键词：
右江民族医学院学报/9903132 Epstein-Barr virus(EBV)感染与鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)之间发生发展的密切关系，近年来随分子生物学技术的提高而深入。目前认为，NPC的发生及恶性演进与EBV感染致使癌基因和抑癌基因等多基因突变相关联[1]。从EBV的感染方式、检测方法及它与诸肿瘤基因突变的关系等，国内外研究的进展较快，现将有关问题综述如下。
1 EBV的感染方式
许多研究表明EBV感染与NPC、非洲Burkitt淋巴瘤等的发生密切相关。Lung[2]认为呼吸道是EBV的重要储存场所，符合呼吸道传播的模式。正常个体原发感染EBV后会周期性向唾液中释放病毒，从健康者的口咽部[3]、腮腺[4]中均有检出EBV的报道。文献[5]更认为下呼吸道及肺脏亦可能是EBV潜伏的最大场所。
1.1 感染方式 EBV感染上皮细胞有两种不同方式：产病毒感染和潜伏感染[6]。在产病毒感染时，病毒进行完整的DNA复制、转录、翻译和病毒装配过程，并释放病毒，导致细胞裂解。潜伏感染时，不释放病毒，病毒DNA在细胞内存在有两种形式：一是以环状附加体(episomal)，随细胞分裂而在细胞中持续下去；一是以线状DNA整合到宿主细胞染色体DNA中。
1.2 EBV的存在形式 EBV基因组以何种形式存在?是以线状、环状附加体的潜伏感染形式，或以病毒DNA完整复制后整合到宿主上皮细胞染色体的产病毒感染形式，仍未明确。一般认为多数NPC中EBV是以潜伏感染形式存在[6,7]，依据是：在NPC组织中只检出EB病毒核抗原-1(EBNA-1)及其mRNA、潜伏膜蛋白1(LMP1)及其mRNA、潜伏膜蛋白2A和2B(LMP2A、2B)的mRNA，以及EBV编码的两个小RNA(EBERs)。
在潜伏感染中，EBV基因组为环状附加体形式。现已清楚，LMP2A编码基因位于线性DNA分子的两个末端，其Exon 1位于U5区的Bam HI末端片段内，外显子2～9位于U1区，其中外显子2～8位于U1区的Bam HI末端片段。有人用LMP2A的第1～5外显子作为探针研究了20例NPC标本[6]，19例有片段大小不等的单一阳性杂交带，证明其EBV DNA有融合的末端结构，EBV基因组为环状附加体形式，是潜伏感染。另外1例中显示有二条阳性杂交带，可能是病毒DNA整合到宿主细胞染色体上，提示该例是处于产病毒感染状态。在产病毒感染时，EBV DNA是以线性双链存在。该研究表明，NPC中EBV感染多数为潜伏感染形式存在，极少病例为产病毒感染，哪种感染形式为主，有待进一步探明。
2 EBV的检测方法
目前检测EBV感染的实验方法有许多，根据不同的应用目的大致分成三类。
2.1 筛查的检测方法 筛查是恶性肿瘤Ⅱ级预防的主要手段。对于大面积的人口普查，黄腾波等[8]提出一套在NPC高发区的筛查方案，主要进行血清EBV的多项抗原抗体反应检测，如EB病毒壳抗原抗体IgA(VCA/IgA)、早期抗原抗体IgA(EA/IgA)、DNA酶抗体中和率(EDAb)等。另外，检测血清中的EBV早期反式激活因子ZEBRA/IgG[9]，该抗体在鼻咽癌组中其阳性率为90.9%。平均在NPC病理确诊前3.5年已出现阳性，且全部NPC病例从首次检测ZEBRA/IgG到病理确诊时抗体水平逐渐升至最高。在鼻咽癌高发区不同血清特征的人群中，计算出ZEBRA/IgG阳性预测值，可为临床医生制定临床决策提供依据。其抗体值与抗体的动态变化相对合，可用作癌前阶段高危人群及预后判断的一项监测指标。
2.2 临床检测方法 病理上常规石蜡切片标本中常用免疫组化方法检测NPC中的EBV[10,11]。该方法操作简单易行、实用性强，试剂已商品化，能在基层医院推广使用。缺点是只能标记是否有EBV感染，而不能作EBV定量分析和感染方式的判断，停留在细胞水平。
2.3 实验研究方法 运用多聚酶链反应、核酸杂交、原位杂交等分子生物学技术进行实验性研究，常用方法有如下几种。
一是用多聚酶链反应(PCR)扩增EBV DNA片段如EB病毒基因组内部重复序列1(IR1)[8]，或扩增EBV核抗原1、核抗原2(EBNA1、EBNA2)[12]。在Bam HI序列中不但含有EBNA1的转录启动子序列Wp，而且还编码它的mRNA的部分拼接序列。因此Bam HI的表达间接反映了EBV DNA的复制状态，说明有EBV感染。
另一种是用杂交技术(包括核酸杂交和原位杂交)检测EBV DNA基因序列如潜伏膜蛋白1(LMP1)、潜伏膜蛋白2(LMP2)、小RNA(EBERs)等[13,14]。它们在分子水平检测病毒DNA的基因状态、位点突变等情况，准确性高，但技术有待进一步成熟，期待将来能在临床上推广使用。
3 EBV与肿瘤基因的关系
EBV感染如何导致NPC的发生?具体环节仍不清楚。而某些肿瘤基因如癌基因C-myc、C-erbB-2，抑癌基因P53等的活化(或失活)，其表达与EBV感染有一定关系。
3.1 癌基因 研究表明，C-myc原癌基因表达增高在某种程度上反映了该组织细胞增殖活性的增加。有人[15]在诱发人胚鼻咽上皮细胞感染EBV后，能检测到癌基因C-myc的表达，并且抑癌基因P53包括总抗原和突变型(mt)的表达也明显增加。受EBV感染后这些鼻咽上皮细胞发生趋向于恶性转化的形态学改变，可能为EBV引起C-myc高表达和P53失活所致。
3.2 抑癌基因 肿瘤抑制基因P53是与人类肿瘤关系密切的基因之一，它定位于人类第17号染色体(17、P13)，编码53KD的磷酸化蛋白，对细胞的生长和分化起重要调节作用。而野生型(Wt)P53的生物化学作用和抑癌功能比较复杂，其失活或突变与肿瘤发生密切相关。在多种肿瘤中，如结肠癌、肺癌、食管癌、乳腺癌等都发现P53基因突变。突变点集中在5、6、7和8外显子上的四个“突变热点”，正对于P53基因进化上的四个最保守区段。鼻咽癌中P53基因突变的研究国外已有报道，一般认为P53基因突变在NPC中突变率很低[16]。李满枝[17]研究20例NPC及4个细胞株、1个移植瘤株中P53的5、6、7、8外显子，未发现突变，认为P53基因突变热点在NPC癌变过程中并不起重要作用。但是否存在P53的其他失活方式?或者突变点发生在其他外显子?由于EBV与NPC的密切关系，可能存在EBV编码蛋白与P53结合，或者蛋白表达被EBV抑制等其他途径使P53失活而失去正常功能，这些有待进一步探讨。
3.3 潜伏期蛋白(LMP) LMP属于EBV癌基因，在NPC、体外培养细胞系和裸鼠移植瘤中均可检测到LMP基因片段[7,18,19]。在NPC活检组织中LMP表达阳性率在40%～60%之间[20]。由于LMP已被证明具有抑制上皮细胞终末分化的能力，这种作用类似于突变的ras癌基因产物，因此在癌变之前、上皮基底侧细胞中的LMP过度表达，可能具有启动鼻咽上皮细胞异型增生的作用，参与NPC多阶段癌变的早期致癌阶段，并且对维持细胞的恶性状态也是必要的[21]。
4 EBV的研究热点
尽管EBV与NPC密切相关，但其病因学至今仍未得到确定。许多学者研究结果并不一致，期待进一步的深入。目前研究热点集中在以下方面。
4.1 EBV的感染时间 EBV是否感染正常人鼻咽上皮?或是正常上皮癌变后再感染?或是仅感染NPC细胞?目前不十分清楚。NPC有一个相当长的癌前阶段，包括癌前状态和癌前病变。在正常鼻咽上皮细胞逐步发展到NPC的过程中，EBV是在什么阶段、以何状态进入鼻咽上皮?文献报告[22]EBV在正常鼻咽组织中出现频率十分低，可能并不感染正常鼻咽上皮。EBV可能在鼻咽上皮癌变后才进入鼻咽上皮。认为EBV可能不是NPC的病因，这是一种新的观点。Yeung[23]观察在有浸润的原位癌中大多数有EBV，而无浸润的原位癌肿瘤细胞仅部分含有此病毒，也提示EBV感染大多发生在癌变之后。
但是也有作者[9]检测血清中ZEBRA/IgG在NPC确诊前3.5年就已阳性，而且潜伏基因BULF1的转录产物即LMPmRNA，在非典型增生的鼻咽上皮中也有表达[20]，说明EBV游离体的大量复制发生于NPC演进过程，可能由于病毒启动子的激活，LMP的表达，具有启动鼻咽上皮细胞异型增生的作用。这支持EBV作为NPC的病因。两种观点不尽一致，EBV究竟是否为致癌病因，仍需探讨。
4.2 EBV的感染方式 EBV是一类致瘤病毒，其感染细胞有两种不同方式：产病毒感染和潜伏感染[6]。但在NPC中，是一种感染方式为主，或是二种感染方式同时存在?尚未能肯定。曾毅认为[24]，完整的EBV能诱发上皮细胞癌变，个体原发感染EBV后会同期性向唾液中释放病毒[5]，部分文献检测表明在NPC中EBNA-1的转录或复制呈相对活跃状态[25]，并不断释放病毒，导致上皮细胞裂解。提示这类上皮细胞早期感染EBV是一种产病毒感染，继而长时间的这一个过程上皮细胞从增生发展到不典型增生，最后发生恶变，继而肿瘤细胞克隆性增殖。
另一些学者认为NPC中多数为潜伏感染[6,7]，而且在NPC颈部淋巴结转移灶中，同样检测出EBV DNA的存在，说明EBV在鼻咽癌转移过程中并不掉失。EBV可能以潜伏感染形式随癌细胞转移到颈部淋巴结中，跟随癌细胞分裂而在细胞中持续下去[26]。
Shao[27]更提出了直接感染的概念和EBV受体(EB receptor, EBVR)的存在，认为EBV是直接感染和人胚上皮细胞的转化是通过EBVR逐步发展成癌的。
4.3 EBV与癌细胞凋亡 在未经治疗NPC中癌细胞凋亡现象仅出现于单个分散的癌细胞。它发生凋亡的原因仍不清楚。癌细胞凋亡对肿瘤生长起到抑制阻缓作用，推测为免疫细胞诱导的结果[28,29]。EBV是否抑制了NPC癌细胞的凋亡?EBV基因BHRF1的表达可抑制增殖细胞核抗原的表达[25]，促使癌细胞的细胞周期重新分布，癌细胞对辐射的敏感性下降，生存能力增强。认为在EBV感染的鼻咽粘膜细胞中，可增强感染细胞的存活能力，而有利于细胞的恶变，可增强肿瘤细胞抵抗放射线诱发细胞凋亡的能力。
4.4 EBV与癌基因 在NPC的肿瘤细胞中EBV基因普遍存在，而几种病毒蛋白的表达与已知的致癌基因活性及血清学改变的表现有关[1]。几种原始致癌基因也与病毒基因的表达有关，在某些抗癌基因的位点上有明显缺失，将来的研究主要是探讨在NPC发生发展中EBV可能发生的因素和作用。
参考文献
[1] Ooka T. Nasopharyngeal carcinoma: present and future. Nippon Rinsho，1997；55(2)：334
[2] Lung ML, Lam WX, So SY, et al. Evidence that respiratory tract is major reservoir for Epstein-Barr virus. Lancet，1985；(1)：889
[3] Van Rensburg EJ, Engelbrecht S, Van Heerden W, et al. Detection of EBV DNA in oral squamous gland cell carcinoma in a Black African population sample. In Vivo，1995；9(2)：199
[4] Hamilton SJ, Therkilden MH, Neilsen NH, et al. Undifferentiated carcinoma of the salivary gland in Greenlandic Eskimos. Hum Pathol，1991；22：811
[5] 张雷，刘鸿瑞，王志永，等.EB病毒感染及感染拷贝数与肺癌的关系.中华病理学杂志，1995；24(3)：132
[6] 汪慧民，陈晕，曾木圣，等.鼻咽癌中EB病毒基因组状态研究.癌症，1997；16(2)：85
[7] Imal S, Nishikawa J, Takada K. Cell-to-cell contact as an efficient mode of Epstein-Barr Virus infection of diverse human epithelial cell. J Virol，1998；72(5)：4371
[8] 黄腾波，汪慧民，李景廉，等.鼻咽癌高危人群、癌前病变的确立.癌症，1997；16(2)：81
[9] 曹素梅，黄腾波，简少文.检测EB病毒ZEBRA/IgG抗体在鼻咽癌早期诊断和预后判断上的意义.癌症，1998；17(4)：241
[10] 刘克拉，宗永生.EB病毒基因在喉鳞状细胞癌中的表达.癌症，1998；17(1)：10
[11] 高子芬，吕怀盛，廖松林，等.鼻咽部原发性Burkitt's淋巴瘤与EB病毒的关系.中华病理学杂志，1997；26(2)：106
[12] Feinmesser R, Miyazaki I, Cheung R, et al. Diagnosis of nasopharyngeal carcinoma hy DNA amplification of tissue obtained by Fineneedle aspiration. N Engl J Med，1992；326(1)：17
[13] Miller WE, Cheshire JL, Baldwin AS, et al. The NPC derived C15 LMP1 protein confers enhanced activation of NF-Kappa B and induction of the EGFR in epithelial cells. Oncogene，1998 Apr 9；16(4)：1896
[14] Hui AB, Cheung ST, Fong Y, et al. Characterization of a new EBV-associated nasopharyngeal carcinoma cell line. Cancer-Genet-Cytogenet，1998；101(2)：83
[15] 孙宁，陈小毅，吴枫，等.EB病毒诱发人胚鼻咽上皮细胞C-myc活化和P53的改变.癌症，1997；16(5)：385
[16] Chartes HS, Yvone CT, Dolly PH, et al. Absence of P53 gene mutations in primany nasopharyngeal carcinoma. Cancer Res，1992；52：4787
[17] 李满枝，陈军，汪慧民.鼻咽癌中P53基因突变的研究.癌症，1998；17(4)：246
[18] Cheung ST, Leung SF, Lo KW, et al. Spicific latent membrane protein 1 gene sequences in type 1 and type 2 Epstein-Barr virus from nasopharyngeal carcinoma in Hong Kong. Int J Cancer，1998；76(3)：399
[19] Haynshi Y, Chen WG, Chen YY, et al. Deletion of Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 gene in Japanese and Branilian gastric carcinoma, metastatic lesions, and reactive lymphocytes. Am J Pathol，1998；152(1)：191
[20] 游绍进，姚开泰，曹亚，等.Epstein-Barr病毒潜伏状态与鼻咽癌的关系.中华肿瘤杂志，1996；18(1)：23
[21] 韩立群，方芳，高进，等.鼻咽癌亚系细胞中EB病毒LMP-1基因的检测.中华病理学杂志，1998；27(3)：230
[22] 黄必军，黄迪，吴秋良，等.鼻咽癌癌前及其高危人群鼻咽上皮组织EB病毒DNA酶基因检测.中华肿瘤杂志，1998；20(7)：251
[23] Yeung WM, Zong YS, Chiu CT, et al. Epstein-Barr virus carriage by nasopharyngeal carcinoma in situ. Int J Cancer，1993；53：746
[24] 曾毅.鼻咽癌病因研究.中国肿瘤，1996；5(5)：8
[25] 黄海，潘星华，孙喜元，等.EB病毒BHRF1基因表达对鼻咽癌细胞增殖能力的影响.中华耳鼻咽科杂志，1997；32(5)：290
[26] 曾木圣，汪慧民，陈军，等.鼻咽癌癌变过程中EBERs表达状况的研究.癌症，1996；15(1)：4
[27] Shao X, He Z, Chen Z, et al. Expression of an Epstein-Barr virus receptor and Epstein-Barr virus dependent transformation of human nasopharyngeal epithelial cells. Int J Cancer，1997 ；71(5)：750
[28] 黄海，潘星华，余龙，等.BHRF1表达对鼻咽癌细胞抗凋亡之能力的影响.中华肿瘤杂志，1998；20(4)：245
[29] 罗天锡，郑树深.鼻咽癌细胞程序性死亡的电镜观察.癌症，1996；15(2)：94
(1998-10-30收稿)