中药拮新康抗白血病细胞与免疫机能的研究①
作者：谢兆霞 谭达人 谢俊明 秦群 谭桂山 徐平声
单位：谢兆霞 谭达人 谢俊明(附属湘雅医院血液科 长沙 410008)；秦 群 谭桂山 徐平声(附属湘雅医院药剂科 长沙 410008)
关键词：拮新康*；白血病；免疫；细胞；药物作用；疾病模型；动物；细胞毒性试验；免疫；小鼠
湖南医科大学学报990310 提要 采用中药制剂拮新康对34例白血病患者的白血病细胞进行体外细胞毒性试验，结果显示：长春新碱+拮新康组较长春新碱组细胞毒性明显增加(P<0.01)，其中20例为难治与复发白血病患者对长春新碱已耐药，但加拮新康后细胞毒性作用增强(P<0.01)；同时拮新康本身对白血病细胞也有一定的抗肿瘤作用。采用环磷酰胺抑制小鼠免疫机能作实验模型，探讨“拮新康”对小鼠细胞免疫机能的影响，发现其对免疫损伤动物模型及正常动物的IFNr与NK活性水平较对照组明显增高(P<0.01)。提示“拮新康”有抗白血病细胞和提高细胞免疫机能的作用。
, 百拇医药
中国图书分类号 R733.7
Study on cytotoxicity to leukemia cell and enhancement of
immunologic functions of jiexinkang
Xie Zhaoxia Tan Daren Xie Junming
(Department of Hematology, Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008)
Qin Qun Tan Guishan Xu Pingsheng
(Department of Pharmacy, Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008)
, 百拇医药
Cytotoxicity to leukemia cell and enhancement of immunologic functions of jiexinkang(JXK, traditional Chinese medicine) were observed in 34 cases of leukemia in vitro. The results showed that the leukemia cytotoxicity in the group of vincristine combined with JXK was significantly higher than that in vincristine alone. It was also found among all the observed cases that 20 refractory or recurred patients resistant to vincristine showed an obvious intension of the anti-toxicity efficiency when JXK was added. Jiexinkang alone had anti-leukemia cell effect, too. We explored JXK effects on immunologic functions in mice, and found that IFNr and NK activities of normal and experimenal model mice were significantly higher than those of control group(P<0.01). The results indicate that JXK has an effect of anti-leukemia cell and may improve the cell-immunologic functions.
, http://www.100md.com
Key words jiexinkang*; traditional Chinese medicine; leukemia; immunity,cell; drug effect; disease model,animal; cytotoxicity test,immunity; mice
白血病患者免疫机能低下，特别是细胞免疫机能明显下降已为人们所共识。化学治疗(化疗)是白血病的主要治疗手段之一，但现有的化疗药物，绝大多数在抑制生长或杀伤肿瘤细胞的同时，对机体的正常细胞也有毒害作用，尤其 对骨髓造血细胞及机体免疫机能均有影响。因此，寻找一种既有抗肿瘤活性，又能提高免疫机能的药物甚有必要。本文采用中药“拮新康”复方制剂进行抗白血病细胞与免疫机能的研究。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 药物、试剂及检测对象
, 百拇医药
1.1.1 药物 拮新康：系一种以含钙拮抗活性成分为主的复方中药制剂，由湖南医科大学附属湘雅医院血液科及药剂科共同研制。长春新碱：杭州中国民生药厂生产，批号961029。环磷酰胺：上海华联制药厂生产，批号951080。
1.1.2 试剂 JSB-1单克隆抗体(单抗)为美国Signet公司产品。生物素-亲和素过氧化物酶复合物(ABC)试剂系美国Vector公司产品。MTT试剂购自北京华美公司。125I-UdR购自北京中国原子能研究所。
1.1.3 检测对象 ⑴病例：34例急性白血病患者均经临床、骨髓细胞形态及细胞化学染色确诊。其中急性非淋巴细胞白血病(急非淋)23例，急性淋巴细胞白血病(急淋)8例，慢性粒细胞急变(慢粒急变)3例。34例中初治14例，难治复发20例。⑵动物：纯系BALB/C小鼠6～8周，雌雄不限，由湖南医科大学实验动物学部供应。该品系为清洁及合格实验动物(合格证号码20-12)。
, 百拇医药
1.2 方法 取患者骨髓，以肝素50U.ml-1抗凝，加入淋巴细胞分离液，离心，2000r.min-1,20min。吸取单个核细胞层，并调整细胞数2×106.ml-1。
1.2.1 待检药对细胞毒性的检测 用MTT法[1]检测上述标本。用DG3022型酶联免疫检测仪测定药物对细胞的毒性。以570nm波长的光密度(OD)值，取3孔OD平均值计算抑制率(抑瘤率)。
抑瘤率=(无药对照孔OD值-用药组OD值)/无药对照孔OD值×100%
按临床用药剂量6g.d-1计算血浆药物浓度，作为药物体外试验浓度的依据。
1.2.2 多药耐药P-糖蛋白的表达 采用免疫组织化学生物素-亲和素过氧化物酶复合物(ABC)法[2]，检测上述标本的多药耐药P-糖蛋白的表达。以≥10%定为P-糖蛋白阳性。
, http://www.100md.com
1.2.3 免疫机能抑制物的动物实验模型及拮新康的作用 实验动物分为6组：①蒸馏水(自然对照)组；②蒸馏水+CTX(模型对照)组；③2倍拮新康+CTX组；④4倍拮新康+CTX组；⑤8倍拮新康+CTX组；⑥4倍拮新康组。各组动物连续灌胃7d，每天1次(1，2组灌等容积的蒸馏水)。作CTX实验模型的各组均于灌胃的第3d腹腔注射CTX一次，剂量为100mg.kg-1。末次灌胃后间隔1d处死小鼠，制备脾细胞悬液，检测免疫干扰素(IFNr)[3]及自然杀伤细胞(NK)[4]的活性水平(V/0.2ml)。用125-UdR标记靶细胞，效靶比例1∶100，以杀伤百分率表示结果。
1.2.4 统计学处理 结果用均数±标准差(
±s)表示；两组间比较用t检验；多组间比较用F检验。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 细胞毒性试验 34例患者白血病细胞体外毒性试验结果显示：长春新碱+拮新康组的细胞毒性较长春新碱组明显增强(P<0.01)(表1)。34例中有20例为难治与复发患者，采用抗多药耐药单抗JSB-1检测P-糖蛋白的表达均为阳性。提示患者此次治疗前对化疗药物已耐药。该20例白血病细胞对长春新碱的细胞毒性为(9.17±4.60)%，而长春新碱+拮新康组为(46.70±12.20)%，两组差异有高度显著性(P<0.01)。
表1 拮新康对白血病细胞的毒性(n=34) 分组
抑制率(±s)
1 长春新碱组
14.45±.71①
, 百拇医药
2 拮新康组
38.73±14.09②
3 长春新碱+拮新康组
50.03±14.63
①与2组及3组比较均为P<0.01；②与3组比较P<0.01
2.2 小鼠脾细胞IFNr活性 检测CTX模型对照组小鼠脾细胞IFNr活性较蒸馏水对照组明显降低，差异有高度显著性(P<0.01)。其余各CTX模型组加用不同剂量的拮新康后，小鼠脾细胞IFNr活性均明显高于CTX模型对照组，差异亦均有显著性(P<0.01)。正常小鼠单用拮新康后，脾细胞IFNr活性较蒸馏水对照组明显增高(P<0.01)(表2)。
表2 拮新康对CTX模型小鼠脾细胞IFNr活性的影响(±s) 分组
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动物数
(只)
IFNr活性
(U/0.2ml)
1 蒸馏水(自然对照)
10
177.1±64.9①
2 蒸馏水+CTX(模型对照)
11
69.7±29.9
3 2倍拮新康+CTX
11
, 百拇医药
146.1±25.1②③
4 4倍拮新康+CTX
11
240.3±97.7②③
5 8倍拮新康+CTX
9
203.6±38.8②③
6 4倍拮新康
11
368.1±73.8②
①与6组比较P<0.01；②与2组比较P<0.01；③3，4，5组比较P>0.05
, http://www.100md.com
2.3 NK活性 CTX模型对照组脾细胞NK活性较蒸馏水对照组明显降低(P<0.01)。CTX各模型观察组分别加用不同剂量的拮新康后，NK活性明显增高，与CTX模型组及蒸馏水对照组比较差异均有高度显著性(P<0.01)。单用拮新康组NK活性均明显高于CTX模型组及蒸馏水对照组(P<0.01)(表3)。
表3 拮新康对小鼠NK活性的影响(±s) 分组
动物数
(只)
NK活性
(%)
1 蒸馏水(自然对照)
10
, 百拇医药
17.86±11.25①
2 蒸馏水+CTX(模型对照)
11
6.40±2.98
3 2倍拮新康+CTX
11
41.79±14.32②③
4 4倍拮新康+CTX
11
28.03±4.46②③
5 8倍拮新康+CTX
, http://www.100md.com
9
34.29±14.76②③
6 4倍拮新康
11
53.34±17.47②
①与6组比较P<0.01；②与2组比较P<0.01；③3，4，5组比较P>0.05
3 讨 论
IFNr是由T细胞亚群TH1分泌的具有主要免疫调节机能的淋巴因子；NK细胞是机体抗肿瘤的重要免疫细胞。本文采用Tx抑制小鼠免疫机能作实验模型，以IFNr与NK活性水平为指标，观察拮新康对小鼠细胞免疫机能的影响。结果显示，不同剂量的拮新康明显增强免疫损 伤的小鼠动物模型及正常小鼠的IFNr与NK活性，与对照组比较有明显统计学差 异(P<0.01)。提示拮新康具有增强小鼠细胞免疫机能的作用。
, 百拇医药
拮新康对白血病细胞的体外试验表明，长春新碱+拮新康组的细胞毒性作用较长春新碱组明显增强(P<0.01)，且其中20例难治与复发白血病者尽管其白血病细胞对长春新碱已获耐药(抑制率为9.17±4.60；采用抗多药耐药单抗JSB-1已证实有P-糖蛋白高表达)，但加拮新康后细胞毒性作用明显增强达46.70±12.2(P<0.01)。上述资料说明，拮新康在一定程度上能逆转长春新碱的耐药性，加强长春新碱的抗肿瘤作用。从拮新康用于正常小鼠的结果来看，也显示拮新康本身也有一定的抗白血病细胞作用(表1)。
1995年7月～1996年11月作者用拮新康治疗白血病患者36例[5]，其中25例为难治与复发患者，化疗加拮新康治疗后有效率为60%；而同期观察了14例难治与复发急性白血病患者，单用化疗未加用拮新康，有效率仅为21.4%；前者疗效明显优于后者(P<0.05)。上述资料表明拮新康治疗白血病有一定效果，且无毒副反应[5]，值得临床推广应用。有关拮新康治疗白血病的作用机制尚待进一步研究。
, http://www.100md.com
本课题承免疫研究室郭实士教授、燕美玉、李立新、孙科柱老师及中西医结合研究所陈国林教授的热情支持及帮助，在此深表谢意
①湖南省科委重点科研资助课题(94-156-91)
作者：谢兆霞 女 62岁 教授
参考文献
1 张绍林，席雨人.急性白血病化疗药物体外敏感性MTT法的研究.中华血液学杂志，1990，11(3)：116～118
2 谢兆霞.抗MDR抗体检白血病细胞P-糖蛋白.湖南医科大学学报，1992，17(1)：63～65
3 朱卫岗，郭实士，易有年.人参多糖对小鼠免疫功能的影响.湖南医科大学学报，1991，16(2)：107～110
4 张崇良，杨晓慧，徐琳本，等.绞股兰总皂甙免疫调节作用的研究.中西医结合杂志，1990，10(2)：96～98
5 谢兆霞，谭达人，贺艳娟，等.拮新康治疗白血病36例临床初步观察.中国现代医学杂志，1997，7(2)：17～18
1998-07-12 收稿, http://www.100md.com
单位：谢兆霞 谭达人 谢俊明(附属湘雅医院血液科 长沙 410008)；秦 群 谭桂山 徐平声(附属湘雅医院药剂科 长沙 410008)
关键词：拮新康*；白血病；免疫；细胞；药物作用；疾病模型；动物；细胞毒性试验；免疫；小鼠
湖南医科大学学报990310 提要 采用中药制剂拮新康对34例白血病患者的白血病细胞进行体外细胞毒性试验，结果显示：长春新碱+拮新康组较长春新碱组细胞毒性明显增加(P<0.01)，其中20例为难治与复发白血病患者对长春新碱已耐药，但加拮新康后细胞毒性作用增强(P<0.01)；同时拮新康本身对白血病细胞也有一定的抗肿瘤作用。采用环磷酰胺抑制小鼠免疫机能作实验模型，探讨“拮新康”对小鼠细胞免疫机能的影响，发现其对免疫损伤动物模型及正常动物的IFNr与NK活性水平较对照组明显增高(P<0.01)。提示“拮新康”有抗白血病细胞和提高细胞免疫机能的作用。
, 百拇医药
中国图书分类号 R733.7
Study on cytotoxicity to leukemia cell and enhancement of
immunologic functions of jiexinkang
Xie Zhaoxia Tan Daren Xie Junming
(Department of Hematology, Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008)
Qin Qun Tan Guishan Xu Pingsheng
(Department of Pharmacy, Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008)
, 百拇医药
Cytotoxicity to leukemia cell and enhancement of immunologic functions of jiexinkang(JXK, traditional Chinese medicine) were observed in 34 cases of leukemia in vitro. The results showed that the leukemia cytotoxicity in the group of vincristine combined with JXK was significantly higher than that in vincristine alone. It was also found among all the observed cases that 20 refractory or recurred patients resistant to vincristine showed an obvious intension of the anti-toxicity efficiency when JXK was added. Jiexinkang alone had anti-leukemia cell effect, too. We explored JXK effects on immunologic functions in mice, and found that IFNr and NK activities of normal and experimenal model mice were significantly higher than those of control group(P<0.01). The results indicate that JXK has an effect of anti-leukemia cell and may improve the cell-immunologic functions.
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Key words jiexinkang*; traditional Chinese medicine; leukemia; immunity,cell; drug effect; disease model,animal; cytotoxicity test,immunity; mice
白血病患者免疫机能低下，特别是细胞免疫机能明显下降已为人们所共识。化学治疗(化疗)是白血病的主要治疗手段之一，但现有的化疗药物，绝大多数在抑制生长或杀伤肿瘤细胞的同时，对机体的正常细胞也有毒害作用，尤其 对骨髓造血细胞及机体免疫机能均有影响。因此，寻找一种既有抗肿瘤活性，又能提高免疫机能的药物甚有必要。本文采用中药“拮新康”复方制剂进行抗白血病细胞与免疫机能的研究。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 药物、试剂及检测对象
, 百拇医药
1.1.1 药物 拮新康：系一种以含钙拮抗活性成分为主的复方中药制剂，由湖南医科大学附属湘雅医院血液科及药剂科共同研制。长春新碱：杭州中国民生药厂生产，批号961029。环磷酰胺：上海华联制药厂生产，批号951080。
1.1.2 试剂 JSB-1单克隆抗体(单抗)为美国Signet公司产品。生物素-亲和素过氧化物酶复合物(ABC)试剂系美国Vector公司产品。MTT试剂购自北京华美公司。125I-UdR购自北京中国原子能研究所。
1.1.3 检测对象 ⑴病例：34例急性白血病患者均经临床、骨髓细胞形态及细胞化学染色确诊。其中急性非淋巴细胞白血病(急非淋)23例，急性淋巴细胞白血病(急淋)8例，慢性粒细胞急变(慢粒急变)3例。34例中初治14例，难治复发20例。⑵动物：纯系BALB/C小鼠6～8周，雌雄不限，由湖南医科大学实验动物学部供应。该品系为清洁及合格实验动物(合格证号码20-12)。
, 百拇医药
1.2 方法 取患者骨髓，以肝素50U.ml-1抗凝，加入淋巴细胞分离液，离心，2000r.min-1,20min。吸取单个核细胞层，并调整细胞数2×106.ml-1。
1.2.1 待检药对细胞毒性的检测 用MTT法[1]检测上述标本。用DG3022型酶联免疫检测仪测定药物对细胞的毒性。以570nm波长的光密度(OD)值，取3孔OD平均值计算抑制率(抑瘤率)。
抑瘤率=(无药对照孔OD值-用药组OD值)/无药对照孔OD值×100%
按临床用药剂量6g.d-1计算血浆药物浓度，作为药物体外试验浓度的依据。
1.2.2 多药耐药P-糖蛋白的表达 采用免疫组织化学生物素-亲和素过氧化物酶复合物(ABC)法[2]，检测上述标本的多药耐药P-糖蛋白的表达。以≥10%定为P-糖蛋白阳性。
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1.2.3 免疫机能抑制物的动物实验模型及拮新康的作用 实验动物分为6组：①蒸馏水(自然对照)组；②蒸馏水+CTX(模型对照)组；③2倍拮新康+CTX组；④4倍拮新康+CTX组；⑤8倍拮新康+CTX组；⑥4倍拮新康组。各组动物连续灌胃7d，每天1次(1，2组灌等容积的蒸馏水)。作CTX实验模型的各组均于灌胃的第3d腹腔注射CTX一次，剂量为100mg.kg-1。末次灌胃后间隔1d处死小鼠，制备脾细胞悬液，检测免疫干扰素(IFNr)[3]及自然杀伤细胞(NK)[4]的活性水平(V/0.2ml)。用125-UdR标记靶细胞，效靶比例1∶100，以杀伤百分率表示结果。
1.2.4 统计学处理 结果用均数±标准差(
±s)表示；两组间比较用t检验；多组间比较用F检验。, 百拇医药
2 结 果
2.1 细胞毒性试验 34例患者白血病细胞体外毒性试验结果显示：长春新碱+拮新康组的细胞毒性较长春新碱组明显增强(P<0.01)(表1)。34例中有20例为难治与复发患者，采用抗多药耐药单抗JSB-1检测P-糖蛋白的表达均为阳性。提示患者此次治疗前对化疗药物已耐药。该20例白血病细胞对长春新碱的细胞毒性为(9.17±4.60)%，而长春新碱+拮新康组为(46.70±12.20)%，两组差异有高度显著性(P<0.01)。
表1 拮新康对白血病细胞的毒性(n=34) 分组
抑制率(
±s)1 长春新碱组
14.45±.71①
, 百拇医药
2 拮新康组
38.73±14.09②
3 长春新碱+拮新康组
50.03±14.63
①与2组及3组比较均为P<0.01；②与3组比较P<0.01
2.2 小鼠脾细胞IFNr活性 检测CTX模型对照组小鼠脾细胞IFNr活性较蒸馏水对照组明显降低，差异有高度显著性(P<0.01)。其余各CTX模型组加用不同剂量的拮新康后，小鼠脾细胞IFNr活性均明显高于CTX模型对照组，差异亦均有显著性(P<0.01)。正常小鼠单用拮新康后，脾细胞IFNr活性较蒸馏水对照组明显增高(P<0.01)(表2)。
表2 拮新康对CTX模型小鼠脾细胞IFNr活性的影响(
±s) 分组, http://www.100md.com
动物数
(只)
IFNr活性
(U/0.2ml)
1 蒸馏水(自然对照)
10
177.1±64.9①
2 蒸馏水+CTX(模型对照)
11
69.7±29.9
3 2倍拮新康+CTX
11
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146.1±25.1②③
4 4倍拮新康+CTX
11
240.3±97.7②③
5 8倍拮新康+CTX
9
203.6±38.8②③
6 4倍拮新康
11
368.1±73.8②
①与6组比较P<0.01；②与2组比较P<0.01；③3，4，5组比较P>0.05
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2.3 NK活性 CTX模型对照组脾细胞NK活性较蒸馏水对照组明显降低(P<0.01)。CTX各模型观察组分别加用不同剂量的拮新康后，NK活性明显增高，与CTX模型组及蒸馏水对照组比较差异均有高度显著性(P<0.01)。单用拮新康组NK活性均明显高于CTX模型组及蒸馏水对照组(P<0.01)(表3)。
表3 拮新康对小鼠NK活性的影响(
±s) 分组动物数
(只)
NK活性
(%)
1 蒸馏水(自然对照)
10
, 百拇医药
17.86±11.25①
2 蒸馏水+CTX(模型对照)
11
6.40±2.98
3 2倍拮新康+CTX
11
41.79±14.32②③
4 4倍拮新康+CTX
11
28.03±4.46②③
5 8倍拮新康+CTX
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9
34.29±14.76②③
6 4倍拮新康
11
53.34±17.47②
①与6组比较P<0.01；②与2组比较P<0.01；③3，4，5组比较P>0.05
3 讨 论
IFNr是由T细胞亚群TH1分泌的具有主要免疫调节机能的淋巴因子；NK细胞是机体抗肿瘤的重要免疫细胞。本文采用Tx抑制小鼠免疫机能作实验模型，以IFNr与NK活性水平为指标，观察拮新康对小鼠细胞免疫机能的影响。结果显示，不同剂量的拮新康明显增强免疫损 伤的小鼠动物模型及正常小鼠的IFNr与NK活性，与对照组比较有明显统计学差 异(P<0.01)。提示拮新康具有增强小鼠细胞免疫机能的作用。
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拮新康对白血病细胞的体外试验表明，长春新碱+拮新康组的细胞毒性作用较长春新碱组明显增强(P<0.01)，且其中20例难治与复发白血病者尽管其白血病细胞对长春新碱已获耐药(抑制率为9.17±4.60；采用抗多药耐药单抗JSB-1已证实有P-糖蛋白高表达)，但加拮新康后细胞毒性作用明显增强达46.70±12.2(P<0.01)。上述资料说明，拮新康在一定程度上能逆转长春新碱的耐药性，加强长春新碱的抗肿瘤作用。从拮新康用于正常小鼠的结果来看，也显示拮新康本身也有一定的抗白血病细胞作用(表1)。
1995年7月～1996年11月作者用拮新康治疗白血病患者36例[5]，其中25例为难治与复发患者，化疗加拮新康治疗后有效率为60%；而同期观察了14例难治与复发急性白血病患者，单用化疗未加用拮新康，有效率仅为21.4%；前者疗效明显优于后者(P<0.05)。上述资料表明拮新康治疗白血病有一定效果，且无毒副反应[5]，值得临床推广应用。有关拮新康治疗白血病的作用机制尚待进一步研究。
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本课题承免疫研究室郭实士教授、燕美玉、李立新、孙科柱老师及中西医结合研究所陈国林教授的热情支持及帮助，在此深表谢意
①湖南省科委重点科研资助课题(94-156-91)
作者：谢兆霞 女 62岁 教授
参考文献
1 张绍林，席雨人.急性白血病化疗药物体外敏感性MTT法的研究.中华血液学杂志，1990，11(3)：116～118
2 谢兆霞.抗MDR抗体检白血病细胞P-糖蛋白.湖南医科大学学报，1992，17(1)：63～65
3 朱卫岗，郭实士，易有年.人参多糖对小鼠免疫功能的影响.湖南医科大学学报，1991，16(2)：107～110
4 张崇良，杨晓慧，徐琳本，等.绞股兰总皂甙免疫调节作用的研究.中西医结合杂志，1990，10(2)：96～98
5 谢兆霞，谭达人，贺艳娟，等.拮新康治疗白血病36例临床初步观察.中国现代医学杂志，1997，7(2)：17～18
1998-07-12 收稿, http://www.100md.com