湖南地区输血传播肝炎病毒感染者的初步观察
作者：郑煜煌 郑宣鹤 杨旭 黄力 曾耀星 何艳 陈军 王文龙
单位：第二附属医院肝病研究中心 长沙 410011
关键词：肝炎病毒；输血；肝炎；多聚酶链反应
湖南医科大学学报990314 提要 为观察湖南地区输血传播病毒(TTV)的感染情况，合成了特异性引物，采用巢式聚合酶链反应两次扩增血清TTV DNA。共检测70例肝炎病人血清和43例献血员血清。结果显示：在38例血清HBsAg阳性、HBeAg和HBV DNA阴性的病人中，10例TTV DNA阳性(26.3%)，ALT平均为(452±236)U.L-1；32例血清甲～戊型和庚型肝炎标志物阴性的病人中，12例TTV DNA阳性(37.5%)，ALT平均为(582±259)U.L-1；43例献血员中，4例TTV DNA阳性(9.3%)，ALT在正常范围。提示湖南地区首次发现TTV感染者。本资料与日本首次报道者相近；不能排除TTV感染与ALT升高的关系。
, 百拇医药
中国图书分类号 R373.21 R512.63
Primary study of transfusion transmitted virus(TTV)
infection in the hepatitis patients and blood donors in Hunan
Zheng Yuhuang, Zheng Xuanhe, Huang Li, et al
(The Liver Research Center, The Second Affiliated Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410011)
To investigate transfusion transmitted virus(TTV) infection in the hepatitis patients and blood donors in Hunan, we used nested polymerase chain reaction(nPCR) assay with primers from TTV genome to detect TTV DNA in seventy clinical hepatitis cases and forty-three blood donors. The results were as follows: TTV DNA was positive in ten of thirty eight patients with hepatitis B(26.3%), and twelve of thirty-two patients with non-A through non-E(37.5%). Elevated transaminase(ALT) was observed in those cases(452U.L-1 and 582U.L-1， respectively). On the other hand, TTV DNA was positive in four of forty-three normal blood donors. The data indicate that infectious rates of TTV in hepatitis patients and blood donors in Hunan are similar to those in Japan, and TTV's pathogenicity needs further study.
, 百拇医药
Key words hepatitis virus; blood transfusion; hepatitis; polymerase chain reaction
自1997～1998年国外连续报道一种新的经输血传播的肝炎病毒(transfusion transmitted virus, TTV)以来[1～3]，北京、深圳等地也有类似报道，但和国外的TTV基因序列有一定的差异[4，5]。为初步了解湖南地区TTV感染情况，作者等从肝炎病人和献血员中检获若干TTV感染者。现分析报告如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象 1998年6月～1999年3月住我院的肝炎病人70例，其中男55例，女15例，均符合1995年北京会议制订的“病毒性肝炎防治方案诊断标准”，排除甲、乙、丙、丁、戊和庚型肝炎病毒感染，或乙型肝炎(乙肝)表面抗原(HBsAg)阳性但复制指标(HBeAg和HBV DNA)阴性者。1999年3月来自岳阳中心血站43例正常献血员血清，献血前已检测HBsAg，HBeAg，抗HCV均阴性，且转氨酶(ALT)正常。以上人员均从静脉无菌采血分离血清，分装后贮存于-70℃冰箱中待测。
, 百拇医药
1.2 肝机能和各型肝炎病毒感染标志物的检测 检测肝机能采用日立7060全自动生化分析仪。抗HAV-IgM及抗HAV-IgG的EIA试剂盒由上海科华生物技术公司提供。HBsAg，抗HBs,HBeAg,抗HBe，抗HBC-IgM和抗HBC-IgG的EIA试剂盒由上海科华生物技术公司提供。抗HCV的EIA试剂盒由上海荣盛生物技术公司提供。HBV DNA和HCV RNA试剂盒由北京医科大学提供。抗HEV-IgG及抗HGV EIA试剂盒由华美生物工程公司提供。
1.3 聚合酶链反应(PCR)扩增的引物合成和PCR试剂盒 根据文献[2]报道的日本株TTV基因序列，在其ORF1保守区设计两对套式引物，由Promega生物产品有限公司合成。引物序列如下：外引物5′-ACAGACAGAGGAGGAGGCAAC-3′和5′-GGATACCATTTAGCTCT-
CAT-3′，内引物5′-GGCAACATGTTATGGATAGAC-3′和5′-CCTGGCATTTTACCATTTCCA-3′。扩增后产物约270bp。PCR试剂盒亦购自Promega公司。
, 百拇医药
1.4 TTV DNA检测 每份待测血清50μl，采用蛋白酶K法提取DNA。95℃煮10min后离心取上清4μl进行PCR扩增。第一次反应取T1和T2引物各20pmol，反应条件为94℃ 35s,58℃ 35s，72℃ 45s共35个循环，最后72℃延伸5min。取上述产物4μl进行第二次反应，T3和T4引物各20pmol，反应条件同前，共30个循环，最后72℃延伸7min。扩增产物经1.5%低分子量琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色后紫外线观察，出现270bp扩增带示扩增产物阳性。同一血清标本检测两次阳性则认为TTV DNA阳性。
2 结 果
2.1 肝炎病人和献血员血清TTV DNA检测 结果见附表。
附表 湖南地区肝炎病人和献血员血清TTV DNA检测 分组
, 百拇医药
肝炎病毒标志物
例数
TTV DNA阳性数
阳性率(%)
ALT(U.L-1)
A(HBV感染)
HBsAg(+)HBeAg(-)
38
10
26.3
452
B(非甲～戊及非
, 百拇医药
HAV-HEV和HGV(-)
32
12
37.5
582
庚病毒感染)
C (献血员)
抗HCV(-)HBsAg(-)
43
4
9.3
(-)
2.2 各组病例的病原标志物 附表示，A组HBsAg均为阳性，HBeAg和HBV DNA阴性；其中5例兼有抗HBe和抗HBc-IgG阳性，15例兼有抗HBc-IgG阳性。B组甲、乙、丙、丁、戊、庚型肝炎标志物均为阴性；其中5例删除巨细胞病毒(CMV)，EB病毒(EBV)感染和免疫性、中毒性肝病。全部病例经护肝治疗后好转。C组献血员HBsAg,HBeAg和抗HCV均阴性，肝机能检测属正常范围。
, 百拇医药
3 讨 论
在急性、慢性和暴发型肝炎、输血后肝炎和肝炎肝硬化等肝病病例中，用现已建立的实验室诊断方法检测甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒标志物以后，仍有10%以上的病例阴性。己型肝炎病毒(HFV)可能在急性输血和散发性肝炎中起一定作用，但HFV迄今未分离成功，亦无特异的诊断方法。1995年发现的庚型肝炎病毒(HGV/GBV-C)致病性不明确，研究表明其并非系非甲-非戊型肝炎的主要病因。
1997年12月日本首次报道从1例输血后肝炎病人血清中获得新的DNA病毒克隆(N22)，命名为TTV[1]。1998年以来国内、外亦有类似发现[2，5]。初步研究表明，TTV是单股DNA病毒，无包膜，基因序列长约3.7kb。有两个开放读码框即770个氨基酸的ORF1，和202个氨基酸的ORF2。不同地区的TTV分离株ORF1部分核苷酸序列变异较大[3，4，7]；深圳分离株和北京分离株的ORF1与日本报道的TTV序列相比，变异分别达到33%和12%。初步调查显示TTV分布广泛，日本献血员、各型非甲-非戊及非庚型肝炎、肝硬变、肝细胞癌、静脉吸毒者、血液病和血液透析病人中感染率分别高达12%，46%，48%，39%，40%，68%和46%。 因此很有必要对本地区的TTV感染情况作一观察。
, 百拇医药
TTV感染者血清TTV DNA滴度较其它血源传播的病毒如HCV或HIV等为低，且目前尚未建立较成熟的TTV感染血清学的诊断方法。采用PCR检测血清TTV DNA是目前诊断TTV感染的主要手段[2]，一般须经两次巢式或半巢式PCR方能检出。本文作者从住院肝炎病例中收集血清和部分献血员血清，以日本报告的TTV基因序列设计引物作巢式PCR，并以扩增产物电泳后出现特异的270bp带判断TTV DNA阳性。初步检获乙型肝炎病毒感染者，非甲-非戊和非庚型肝炎患者和献血员中TTV DNA阳性率分别为26.3%，37.5%和9.3%，后者与日本的资料相近。
TTV的致病性目前无定论[8，9]，因其在正常人群中亦有8%～10%的感染率，故有学者认为TTV感染不一定致病[4，5]。亦有人观察到：受血感染TTV后出现病毒血症，且与ALT异常有关；当血清TTV DNA消失后ALT也降为正常[1]。有报告谓肝硬化和肝癌病人中，血清TTV DNA的阳性率(35/65，54%)，明显高于慢性肝炎病人(20/62，32%)，认为TTV感染可能是慢性肝病发展的原因之一[9]。本文观察的38例乙肝病毒感染者，其复制指标(HBsAg和HBV DNA)阴性。在此TTV DNA阳性的10例肝炎患者中，2例急性肝炎，2例慢性中度，1例肝硬化，5例慢性重型或亚急性重型，ALT平均(452±236)U.L-1。32例非甲-非戊和非庚型肝炎病例中，TTV DNA阳性者12例，其中5例排除CMV及EBV感染、免疫性和中毒性肝病，其ALT平均为(582±259)U.L-1。作者认为：TTV感染的致病性仍应进行深入研究，因二者的关系尚不能完全确定。
, 百拇医药
本文首次对湖南地区TTV感染情况作了初步报道。有关TTV湖南株的基因序列和基因分型，尚待深入研究，并扩大观察例数和病种，了解其在各类肝病病人和高危人群中的感染率和致病性，为制定有效的防治方案提供理论依据。
①第二附属医院输血科
作者：郑煜煜 男 49岁 副教授
参考文献
1 Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K, et al. A novel DNA virus(TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Biochem Biophys Res Commun, 1997,241(1):92～97
, 百拇医药
2 Okamoto H, Nishizawa T, Kata N, et al. Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus(TTV) associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Hepatol Res, 1998,10:1～6
3 Simmonds P, Davidson F, Lycett C, et al. Detection of a novel DNA virus(TTV) in blood donors and blood products. Lancet, 1998,352(9123):191～195
4 马为民，周伯平，王炎生，等.一种新的可经输血传播病毒(TTV)的分子流行病学研究.中华肝脏病杂志，1998，6(3)：167～169
, http://www.100md.com
5 陈红松，丛旭，王宇.经输血传播病毒(TTV)在血液透析患者中感染状况及基因分析.中华肝脏病杂志，1998，6(3)：164～166
6 Yashina TL, Favorov MO, Khundyakov YE, et al. Detection of hepatitis G virus(HGV) RNA: Clinical characteristics of acute HGV infection. J Inf Dis, 1997,175(6):1302～1307
7 Hohne M, Berg T, Muller AR, et al. Detection of sequences of TT virus, a novel DNA virus, in German patients. J Gen Virol, 1998,79(11):2761～2764
8 Tanaka H, Okamoto H, Luengrojanakal P, et al. Infection with an unenveloped DNA virus(TTV) associated with posttransfusion non-A to G hepatitis in hepatitis patients and healthy blood dononrs in Thailand. J Med Virol, 1998,56(3):234～238
9 Okamoto H, Akahane Y, Ukita M, et al. Fecal excretion of a non-eveloped DNA virus(TTV) associated with posttransfnsion non-A-G hepatitis. J Med Virol, 1998,56(2):128～132
1999-03-31 收稿, http://www.100md.com
单位：第二附属医院肝病研究中心 长沙 410011
关键词：肝炎病毒；输血；肝炎；多聚酶链反应
湖南医科大学学报990314 提要 为观察湖南地区输血传播病毒(TTV)的感染情况，合成了特异性引物，采用巢式聚合酶链反应两次扩增血清TTV DNA。共检测70例肝炎病人血清和43例献血员血清。结果显示：在38例血清HBsAg阳性、HBeAg和HBV DNA阴性的病人中，10例TTV DNA阳性(26.3%)，ALT平均为(452±236)U.L-1；32例血清甲～戊型和庚型肝炎标志物阴性的病人中，12例TTV DNA阳性(37.5%)，ALT平均为(582±259)U.L-1；43例献血员中，4例TTV DNA阳性(9.3%)，ALT在正常范围。提示湖南地区首次发现TTV感染者。本资料与日本首次报道者相近；不能排除TTV感染与ALT升高的关系。
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中国图书分类号 R373.21 R512.63
Primary study of transfusion transmitted virus(TTV)
infection in the hepatitis patients and blood donors in Hunan
Zheng Yuhuang, Zheng Xuanhe, Huang Li, et al
(The Liver Research Center, The Second Affiliated Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410011)
To investigate transfusion transmitted virus(TTV) infection in the hepatitis patients and blood donors in Hunan, we used nested polymerase chain reaction(nPCR) assay with primers from TTV genome to detect TTV DNA in seventy clinical hepatitis cases and forty-three blood donors. The results were as follows: TTV DNA was positive in ten of thirty eight patients with hepatitis B(26.3%), and twelve of thirty-two patients with non-A through non-E(37.5%). Elevated transaminase(ALT) was observed in those cases(452U.L-1 and 582U.L-1， respectively). On the other hand, TTV DNA was positive in four of forty-three normal blood donors. The data indicate that infectious rates of TTV in hepatitis patients and blood donors in Hunan are similar to those in Japan, and TTV's pathogenicity needs further study.
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Key words hepatitis virus; blood transfusion; hepatitis; polymerase chain reaction
自1997～1998年国外连续报道一种新的经输血传播的肝炎病毒(transfusion transmitted virus, TTV)以来[1～3]，北京、深圳等地也有类似报道，但和国外的TTV基因序列有一定的差异[4，5]。为初步了解湖南地区TTV感染情况，作者等从肝炎病人和献血员中检获若干TTV感染者。现分析报告如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象 1998年6月～1999年3月住我院的肝炎病人70例，其中男55例，女15例，均符合1995年北京会议制订的“病毒性肝炎防治方案诊断标准”，排除甲、乙、丙、丁、戊和庚型肝炎病毒感染，或乙型肝炎(乙肝)表面抗原(HBsAg)阳性但复制指标(HBeAg和HBV DNA)阴性者。1999年3月来自岳阳中心血站43例正常献血员血清，献血前已检测HBsAg，HBeAg，抗HCV均阴性，且转氨酶(ALT)正常。以上人员均从静脉无菌采血分离血清，分装后贮存于-70℃冰箱中待测。
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1.2 肝机能和各型肝炎病毒感染标志物的检测 检测肝机能采用日立7060全自动生化分析仪。抗HAV-IgM及抗HAV-IgG的EIA试剂盒由上海科华生物技术公司提供。HBsAg，抗HBs,HBeAg,抗HBe，抗HBC-IgM和抗HBC-IgG的EIA试剂盒由上海科华生物技术公司提供。抗HCV的EIA试剂盒由上海荣盛生物技术公司提供。HBV DNA和HCV RNA试剂盒由北京医科大学提供。抗HEV-IgG及抗HGV EIA试剂盒由华美生物工程公司提供。
1.3 聚合酶链反应(PCR)扩增的引物合成和PCR试剂盒 根据文献[2]报道的日本株TTV基因序列，在其ORF1保守区设计两对套式引物，由Promega生物产品有限公司合成。引物序列如下：外引物5′-ACAGACAGAGGAGGAGGCAAC-3′和5′-GGATACCATTTAGCTCT-
CAT-3′，内引物5′-GGCAACATGTTATGGATAGAC-3′和5′-CCTGGCATTTTACCATTTCCA-3′。扩增后产物约270bp。PCR试剂盒亦购自Promega公司。
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1.4 TTV DNA检测 每份待测血清50μl，采用蛋白酶K法提取DNA。95℃煮10min后离心取上清4μl进行PCR扩增。第一次反应取T1和T2引物各20pmol，反应条件为94℃ 35s,58℃ 35s，72℃ 45s共35个循环，最后72℃延伸5min。取上述产物4μl进行第二次反应，T3和T4引物各20pmol，反应条件同前，共30个循环，最后72℃延伸7min。扩增产物经1.5%低分子量琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色后紫外线观察，出现270bp扩增带示扩增产物阳性。同一血清标本检测两次阳性则认为TTV DNA阳性。
2 结 果
2.1 肝炎病人和献血员血清TTV DNA检测 结果见附表。
附表 湖南地区肝炎病人和献血员血清TTV DNA检测 分组
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肝炎病毒标志物
例数
TTV DNA阳性数
阳性率(%)
ALT(U.L-1)
A(HBV感染)
HBsAg(+)HBeAg(-)
38
10
26.3
452
B(非甲～戊及非
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HAV-HEV和HGV(-)
32
12
37.5
582
庚病毒感染)
C (献血员)
抗HCV(-)HBsAg(-)
43
4
9.3
(-)
2.2 各组病例的病原标志物 附表示，A组HBsAg均为阳性，HBeAg和HBV DNA阴性；其中5例兼有抗HBe和抗HBc-IgG阳性，15例兼有抗HBc-IgG阳性。B组甲、乙、丙、丁、戊、庚型肝炎标志物均为阴性；其中5例删除巨细胞病毒(CMV)，EB病毒(EBV)感染和免疫性、中毒性肝病。全部病例经护肝治疗后好转。C组献血员HBsAg,HBeAg和抗HCV均阴性，肝机能检测属正常范围。
, 百拇医药
3 讨 论
在急性、慢性和暴发型肝炎、输血后肝炎和肝炎肝硬化等肝病病例中，用现已建立的实验室诊断方法检测甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒标志物以后，仍有10%以上的病例阴性。己型肝炎病毒(HFV)可能在急性输血和散发性肝炎中起一定作用，但HFV迄今未分离成功，亦无特异的诊断方法。1995年发现的庚型肝炎病毒(HGV/GBV-C)致病性不明确，研究表明其并非系非甲-非戊型肝炎的主要病因。
1997年12月日本首次报道从1例输血后肝炎病人血清中获得新的DNA病毒克隆(N22)，命名为TTV[1]。1998年以来国内、外亦有类似发现[2，5]。初步研究表明，TTV是单股DNA病毒，无包膜，基因序列长约3.7kb。有两个开放读码框即770个氨基酸的ORF1，和202个氨基酸的ORF2。不同地区的TTV分离株ORF1部分核苷酸序列变异较大[3，4，7]；深圳分离株和北京分离株的ORF1与日本报道的TTV序列相比，变异分别达到33%和12%。初步调查显示TTV分布广泛，日本献血员、各型非甲-非戊及非庚型肝炎、肝硬变、肝细胞癌、静脉吸毒者、血液病和血液透析病人中感染率分别高达12%，46%，48%，39%，40%，68%和46%。 因此很有必要对本地区的TTV感染情况作一观察。
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TTV感染者血清TTV DNA滴度较其它血源传播的病毒如HCV或HIV等为低，且目前尚未建立较成熟的TTV感染血清学的诊断方法。采用PCR检测血清TTV DNA是目前诊断TTV感染的主要手段[2]，一般须经两次巢式或半巢式PCR方能检出。本文作者从住院肝炎病例中收集血清和部分献血员血清，以日本报告的TTV基因序列设计引物作巢式PCR，并以扩增产物电泳后出现特异的270bp带判断TTV DNA阳性。初步检获乙型肝炎病毒感染者，非甲-非戊和非庚型肝炎患者和献血员中TTV DNA阳性率分别为26.3%，37.5%和9.3%，后者与日本的资料相近。
TTV的致病性目前无定论[8，9]，因其在正常人群中亦有8%～10%的感染率，故有学者认为TTV感染不一定致病[4，5]。亦有人观察到：受血感染TTV后出现病毒血症，且与ALT异常有关；当血清TTV DNA消失后ALT也降为正常[1]。有报告谓肝硬化和肝癌病人中，血清TTV DNA的阳性率(35/65，54%)，明显高于慢性肝炎病人(20/62，32%)，认为TTV感染可能是慢性肝病发展的原因之一[9]。本文观察的38例乙肝病毒感染者，其复制指标(HBsAg和HBV DNA)阴性。在此TTV DNA阳性的10例肝炎患者中，2例急性肝炎，2例慢性中度，1例肝硬化，5例慢性重型或亚急性重型，ALT平均(452±236)U.L-1。32例非甲-非戊和非庚型肝炎病例中，TTV DNA阳性者12例，其中5例排除CMV及EBV感染、免疫性和中毒性肝病，其ALT平均为(582±259)U.L-1。作者认为：TTV感染的致病性仍应进行深入研究，因二者的关系尚不能完全确定。
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本文首次对湖南地区TTV感染情况作了初步报道。有关TTV湖南株的基因序列和基因分型，尚待深入研究，并扩大观察例数和病种，了解其在各类肝病病人和高危人群中的感染率和致病性，为制定有效的防治方案提供理论依据。
①第二附属医院输血科
作者：郑煜煜 男 49岁 副教授
参考文献
1 Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K, et al. A novel DNA virus(TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Biochem Biophys Res Commun, 1997,241(1):92～97
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2 Okamoto H, Nishizawa T, Kata N, et al. Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus(TTV) associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Hepatol Res, 1998,10:1～6
3 Simmonds P, Davidson F, Lycett C, et al. Detection of a novel DNA virus(TTV) in blood donors and blood products. Lancet, 1998,352(9123):191～195
4 马为民，周伯平，王炎生，等.一种新的可经输血传播病毒(TTV)的分子流行病学研究.中华肝脏病杂志，1998，6(3)：167～169
, http://www.100md.com
5 陈红松，丛旭，王宇.经输血传播病毒(TTV)在血液透析患者中感染状况及基因分析.中华肝脏病杂志，1998，6(3)：164～166
6 Yashina TL, Favorov MO, Khundyakov YE, et al. Detection of hepatitis G virus(HGV) RNA: Clinical characteristics of acute HGV infection. J Inf Dis, 1997,175(6):1302～1307
7 Hohne M, Berg T, Muller AR, et al. Detection of sequences of TT virus, a novel DNA virus, in German patients. J Gen Virol, 1998,79(11):2761～2764
8 Tanaka H, Okamoto H, Luengrojanakal P, et al. Infection with an unenveloped DNA virus(TTV) associated with posttransfusion non-A to G hepatitis in hepatitis patients and healthy blood dononrs in Thailand. J Med Virol, 1998,56(3):234～238
9 Okamoto H, Akahane Y, Ukita M, et al. Fecal excretion of a non-eveloped DNA virus(TTV) associated with posttransfnsion non-A-G hepatitis. J Med Virol, 1998,56(2):128～132
1999-03-31 收稿, http://www.100md.com