介绍一种改良的麦康凯培养基
作者：王继贵 童明华
单位：第二附属医院检验科 长沙 410011
关键词：培养基；磷酸酶；非发酵菌；肠杆菌科
湖南医科大学学报990329 提要 用麦康凯(MCA)培基粉作基础，加入6-苯甲酰-萘基磷酸二钠盐改良MCA培养基。经多种肠道菌检测证实本法可同时观察乳糖和磷酸酶反应，在原始平板上根据菌落的颜色，直接区分肠杆菌科和非发酵菌之菌落，简化了鉴定手续，节约了鉴定时间，对进一步选择鉴定板有很大帮助。
中国图书分类号 R446.5
A modified MacConkey medium
Wang Jigui Tong Minghua
, http://www.100md.com
(Department of Clinical Laboratory, The Second Affiliated Hospsital, Hunan Medical University, Changsha 410011)
We used MacConkey Agar(MCA) medium powder as a basis and added 6-benzoy-2-naphthyl phosphate disodium salt to modify MCA medium. This method was identified by examing several kinds of enteric pathogenic bacteria. Thus it allows us to observe lactose fermentative and phosphatase reaction simultaneously and to recognize Enterobacteriaceae from non-fermentable bacteria on primary culture plates according to the color of colony. This improved method simplifies the recognition procedure and shortens the time so that it is helpful to correctly choosing identification kit.
, http://www.100md.com
Key words medium; phosphatase; non-fermentable bacteria; Enterobacteriaceae
麦康凯培养基(MacConkey Agar; MCA)在临床微生物实验室已应用数十年，它只能区分发酵和不发酵乳糖的菌落，不能区分乳糖阴性的肠道菌和非发酵菌(Non-fermentable bacteria, NFB)的菌落。Satta等[1]研究了革兰氏阴性菌中的磷酸酶活性，发现肠杆菌科的所有菌株磷酸酶都是阳性，磷酸酶活力是肠杆菌科所有重要种的恒定特征。Pompei等[2]报告了一种改良的MCA，它是在MCA培养基中加入6-苯甲酰-萘基磷酸盐作基质，以测定细菌产生磷酸酶的能力，使在初次分离的培养基上根据菌落的颜色，不必作任何补充试验，即可区分肠杆菌科和NFB的菌落。该法原配方是用带结晶紫的MCA培基粉作基础，由于国内市场无此种培基供应，本文用MCA培基粉作基础，加入0.1%结晶紫溶液，经多次试验证明终浓度以每升含结晶紫0.008g为好，完全可以抑制肠球菌生长。本文对改良的MCA作一详细的评价，现报告如下。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 试剂 麦康凯琼脂系江西省医药卫生科技开发中心产品，批号950328。6-苯甲酰-萘基磷酸二钠盐(6-Benzoy-2-naphthyl phosphate disodium salt; 6-BNP)，Lot 76H5022系Sigma chemical Co., St.Louis, MO产品。使用前用无菌蒸馏水配成5%的溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤备用。
1.2
1.2.1 改良MCA培养基 称取MCA琼脂50g，葡萄糖0.2g，无水Na2HPO4 0.6g，甲基蓝0.07g,0.1%结晶紫溶液8.0ml，加蒸馏水至990ml，经高压灭菌(115℃ 15min)后，使培养基冷至50℃左右，加入经滤菌处理的5% 6-BNP溶液10ml，充分混匀后倾注平皿。此改良MCA培养基在4～8℃冰箱中可维持其鉴别活性至少两个月。
, http://www.100md.com
1.2.2 试验菌株 用于本研究的菌株列于附表，所有菌株均由临床标本分离，经Sceptor细菌鉴定仪(美国Becton Dikinson公司)鉴定。
附表 实验菌株 菌种
菌株数
菌种
菌株数
肠杆菌科菌
普通变形杆菌
1
乳糖阳性组
奇异变形杆菌
1
, 百拇医药
大肠埃希菌
50
摩根摩根氏菌
1
肺炎克雷伯菌
32
伤寒杆菌
5
催产克雷伯菌
10
非发酵菌
产气肠杆菌
5
, 百拇医药
铜绿假单胞菌
35
阴沟肠杆菌
23
产碱假单胞菌
6
凝聚肠杆菌
5
嗜麦芽假单胞菌
10
异型枸椽酸杆菌
2
粪产碱杆菌
, 百拇医药
3
弗劳地枸椽酸杆菌
5
鲍曼不动杆菌
20
乳糖阴性组
醋酸钙不动杆菌
20
雷极普罗威登斯菌
1
洛非不动杆菌
10
1.2.3 观察方法 将试验菌株分别按以下方法组合，划线接种于改良MCA培养基上，37℃培养过夜，观察各种菌落的颜色及特征。①单个菌株直接接种于改良MCA培养基上；②大肠埃希菌+肠杆菌科菌(乳糖阴性组)，观察两种菌落的区别；③大肠埃希菌+NFB；④大肠埃希菌+NFB+肠杆菌科菌(乳糖阴性组)，观察3种菌落的区别。
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2 结 果
2.1 生长情况 将被研究的所有革兰氏阴性杆菌接种于改良MCA培养基上，经37℃培养18～24h，生长均良好，其菌落大小与MCA培养基上类似。肠球菌在此培养基上受到抑制。
2.2 改良的MCA培养基对革兰氏阴性杆菌的鉴别力 根据磷酸酶反应区分肠杆菌细菌和NFB(如假单胞菌属、不动杆菌属、产碱杆菌等)，前者为阳性，后者为阴性；前者又据乳糖的利用分为乳糖阳性组和乳糖阴性组。改良MCA培养基可同时评价乳糖发酵情况及磷酸酶反应，在此培养基上菌落颜色有以下3种情况。①紫红色菌落，乳糖阳性和磷酸酶阳性之菌落，如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌及弗劳地枸椽酸杆菌等。②紫蓝色菌落，乳糖阴性和磷酸酶阳性之菌落，如伤寒杆菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、摩根摩根氏菌及雷极普罗威登斯菌等。③淡灰色菌落，乳糖阴性和磷酸酶阴性之菌落；此种菌落在稀疏单个菌落区为无色菌落，在菌落密集区显淡灰色菌落，如NFB之菌落均属此类。
, 百拇医药
无论将单株细菌抑或混合菌株接种于改良MCA培养基上，均可根据其菌落颜色予以区别。
3 讨 论
笔者改良的MCA培养基既保持了MCA培养基的性质，又能检测磷酸酶反应。其原理是在MCA培养基中加入磷酸酶基质6-BNP，当细菌磷酸酶为阳性时，则水解6-BNP，反应产物与培养基中的染料甲基兰和中性红结合，在菌落内或菌落周围形成染料沉淀(紫兰色)[2]。改良MCA培养基可同时观察乳糖和磷酸酶两种反应。如乳糖阳性使中性红变为红色，同时磷酸酶阳性，最终则为紫红色。如乳糖为阴性，磷酸酶为阳性，则菌落为紫兰色。如两种反应均为阴性，则顺光观察其菌落为无色，逆光观察其在菌落稀少处为无色，菌落密集处为淡灰色，这可能与培养基底色的散射有关。
绝大多数NFB属于条件致病菌，它们的生存力很强，是医院内感染中最常见的病原菌，它们对多种抗生素有不同程度的耐药性。在烧伤、慢性消耗性疾病以及使用免疫抑制剂的病人中，NFB可以引起严重的感染且经久不愈。快速和准确地分离和鉴定NFB，对临床诊疗工作具有十分重要的价值。
, 百拇医药
临床微生物实验室应用自动鉴定仪已愈来愈普遍，通常，肠杆菌科及NFB的进一步鉴定需接种不同的鉴定板。改良MCA培养基可以在原始平板上根据菌落的颜色特征，区分出肠杆菌科及NFB菌落，不必作任何补充试验及挑选双糖，节约了时间，简化了手续，对进一步选择鉴定板有很大帮助，值得临床推广应用。
作者：王继贵 男 62岁 主治医师
参考文献
1 Satta G, Pompei R, Grazi G, et al. Phosphatase activity is a constant feature of all isolates of all major species of the family Enterobactericeae. J Clin Microbiol, 1988,26:2637～2641
2 Pompei R, Berlutti F, Thaller MC, et al. A modified MacConkey medium which allows the recognition of Enterobacteriaceae from other Gram-negative bacteria on primary culture plates. J Microbiol Methods, 1996,25:271～278
1998-05-12 收稿, http://www.100md.com
单位：第二附属医院检验科 长沙 410011
关键词：培养基；磷酸酶；非发酵菌；肠杆菌科
湖南医科大学学报990329 提要 用麦康凯(MCA)培基粉作基础，加入6-苯甲酰-萘基磷酸二钠盐改良MCA培养基。经多种肠道菌检测证实本法可同时观察乳糖和磷酸酶反应，在原始平板上根据菌落的颜色，直接区分肠杆菌科和非发酵菌之菌落，简化了鉴定手续，节约了鉴定时间，对进一步选择鉴定板有很大帮助。
中国图书分类号 R446.5
A modified MacConkey medium
Wang Jigui Tong Minghua
, http://www.100md.com
(Department of Clinical Laboratory, The Second Affiliated Hospsital, Hunan Medical University, Changsha 410011)
We used MacConkey Agar(MCA) medium powder as a basis and added 6-benzoy-2-naphthyl phosphate disodium salt to modify MCA medium. This method was identified by examing several kinds of enteric pathogenic bacteria. Thus it allows us to observe lactose fermentative and phosphatase reaction simultaneously and to recognize Enterobacteriaceae from non-fermentable bacteria on primary culture plates according to the color of colony. This improved method simplifies the recognition procedure and shortens the time so that it is helpful to correctly choosing identification kit.
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Key words medium; phosphatase; non-fermentable bacteria; Enterobacteriaceae
麦康凯培养基(MacConkey Agar; MCA)在临床微生物实验室已应用数十年，它只能区分发酵和不发酵乳糖的菌落，不能区分乳糖阴性的肠道菌和非发酵菌(Non-fermentable bacteria, NFB)的菌落。Satta等[1]研究了革兰氏阴性菌中的磷酸酶活性，发现肠杆菌科的所有菌株磷酸酶都是阳性，磷酸酶活力是肠杆菌科所有重要种的恒定特征。Pompei等[2]报告了一种改良的MCA，它是在MCA培养基中加入6-苯甲酰-萘基磷酸盐作基质，以测定细菌产生磷酸酶的能力，使在初次分离的培养基上根据菌落的颜色，不必作任何补充试验，即可区分肠杆菌科和NFB的菌落。该法原配方是用带结晶紫的MCA培基粉作基础，由于国内市场无此种培基供应，本文用MCA培基粉作基础，加入0.1%结晶紫溶液，经多次试验证明终浓度以每升含结晶紫0.008g为好，完全可以抑制肠球菌生长。本文对改良的MCA作一详细的评价，现报告如下。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 试剂 麦康凯琼脂系江西省医药卫生科技开发中心产品，批号950328。6-苯甲酰-萘基磷酸二钠盐(6-Benzoy-2-naphthyl phosphate disodium salt; 6-BNP)，Lot 76H5022系Sigma chemical Co., St.Louis, MO产品。使用前用无菌蒸馏水配成5%的溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤备用。
1.2
1.2.1 改良MCA培养基 称取MCA琼脂50g，葡萄糖0.2g，无水Na2HPO4 0.6g，甲基蓝0.07g,0.1%结晶紫溶液8.0ml，加蒸馏水至990ml，经高压灭菌(115℃ 15min)后，使培养基冷至50℃左右，加入经滤菌处理的5% 6-BNP溶液10ml，充分混匀后倾注平皿。此改良MCA培养基在4～8℃冰箱中可维持其鉴别活性至少两个月。
, http://www.100md.com
1.2.2 试验菌株 用于本研究的菌株列于附表，所有菌株均由临床标本分离，经Sceptor细菌鉴定仪(美国Becton Dikinson公司)鉴定。
附表 实验菌株 菌种
菌株数
菌种
菌株数
肠杆菌科菌
普通变形杆菌
1
乳糖阳性组
奇异变形杆菌
1
, 百拇医药
大肠埃希菌
50
摩根摩根氏菌
1
肺炎克雷伯菌
32
伤寒杆菌
5
催产克雷伯菌
10
非发酵菌
产气肠杆菌
5
, 百拇医药
铜绿假单胞菌
35
阴沟肠杆菌
23
产碱假单胞菌
6
凝聚肠杆菌
5
嗜麦芽假单胞菌
10
异型枸椽酸杆菌
2
粪产碱杆菌
, 百拇医药
3
弗劳地枸椽酸杆菌
5
鲍曼不动杆菌
20
乳糖阴性组
醋酸钙不动杆菌
20
雷极普罗威登斯菌
1
洛非不动杆菌
10
1.2.3 观察方法 将试验菌株分别按以下方法组合，划线接种于改良MCA培养基上，37℃培养过夜，观察各种菌落的颜色及特征。①单个菌株直接接种于改良MCA培养基上；②大肠埃希菌+肠杆菌科菌(乳糖阴性组)，观察两种菌落的区别；③大肠埃希菌+NFB；④大肠埃希菌+NFB+肠杆菌科菌(乳糖阴性组)，观察3种菌落的区别。
, http://www.100md.com
2 结 果
2.1 生长情况 将被研究的所有革兰氏阴性杆菌接种于改良MCA培养基上，经37℃培养18～24h，生长均良好，其菌落大小与MCA培养基上类似。肠球菌在此培养基上受到抑制。
2.2 改良的MCA培养基对革兰氏阴性杆菌的鉴别力 根据磷酸酶反应区分肠杆菌细菌和NFB(如假单胞菌属、不动杆菌属、产碱杆菌等)，前者为阳性，后者为阴性；前者又据乳糖的利用分为乳糖阳性组和乳糖阴性组。改良MCA培养基可同时评价乳糖发酵情况及磷酸酶反应，在此培养基上菌落颜色有以下3种情况。①紫红色菌落，乳糖阳性和磷酸酶阳性之菌落，如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌及弗劳地枸椽酸杆菌等。②紫蓝色菌落，乳糖阴性和磷酸酶阳性之菌落，如伤寒杆菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、摩根摩根氏菌及雷极普罗威登斯菌等。③淡灰色菌落，乳糖阴性和磷酸酶阴性之菌落；此种菌落在稀疏单个菌落区为无色菌落，在菌落密集区显淡灰色菌落，如NFB之菌落均属此类。
, 百拇医药
无论将单株细菌抑或混合菌株接种于改良MCA培养基上，均可根据其菌落颜色予以区别。
3 讨 论
笔者改良的MCA培养基既保持了MCA培养基的性质，又能检测磷酸酶反应。其原理是在MCA培养基中加入磷酸酶基质6-BNP，当细菌磷酸酶为阳性时，则水解6-BNP，反应产物与培养基中的染料甲基兰和中性红结合，在菌落内或菌落周围形成染料沉淀(紫兰色)[2]。改良MCA培养基可同时观察乳糖和磷酸酶两种反应。如乳糖阳性使中性红变为红色，同时磷酸酶阳性，最终则为紫红色。如乳糖为阴性，磷酸酶为阳性，则菌落为紫兰色。如两种反应均为阴性，则顺光观察其菌落为无色，逆光观察其在菌落稀少处为无色，菌落密集处为淡灰色，这可能与培养基底色的散射有关。
绝大多数NFB属于条件致病菌，它们的生存力很强，是医院内感染中最常见的病原菌，它们对多种抗生素有不同程度的耐药性。在烧伤、慢性消耗性疾病以及使用免疫抑制剂的病人中，NFB可以引起严重的感染且经久不愈。快速和准确地分离和鉴定NFB，对临床诊疗工作具有十分重要的价值。
, 百拇医药
临床微生物实验室应用自动鉴定仪已愈来愈普遍，通常，肠杆菌科及NFB的进一步鉴定需接种不同的鉴定板。改良MCA培养基可以在原始平板上根据菌落的颜色特征，区分出肠杆菌科及NFB菌落，不必作任何补充试验及挑选双糖，节约了时间，简化了手续，对进一步选择鉴定板有很大帮助，值得临床推广应用。
作者：王继贵 男 62岁 主治医师
参考文献
1 Satta G, Pompei R, Grazi G, et al. Phosphatase activity is a constant feature of all isolates of all major species of the family Enterobactericeae. J Clin Microbiol, 1988,26:2637～2641
2 Pompei R, Berlutti F, Thaller MC, et al. A modified MacConkey medium which allows the recognition of Enterobacteriaceae from other Gram-negative bacteria on primary culture plates. J Microbiol Methods, 1996,25:271～278
1998-05-12 收稿, http://www.100md.com