人鼻咽癌相关的转化基因Tx转录活化机制研究①
作者：彭白露 曹 利 李桂源 姚开泰
单位：肿瘤研究所 长沙 410078
关键词：鼻咽肿瘤；癌；基因；Tx；核酸内切酶；Dnase-Ⅰ超敏区；分析；基因表达调节；肿瘤
湖南医科大学学报990308 提要 采用DNase-Ⅰ超敏区分析法寻找Tx2.8kb EcoRI片段的转录活化位点，以期探索Tx基因在鼻咽癌发病过程中的作用。结果未发现在此片段中有DNase-Ⅰ超敏区位点。提示与IgκC同源的Tx2.8kb EcoRI片段可能采用免疫球蛋白基因所独有的基因调控方式，而与瘤基因的一般转录活化方式明显不同。
中国图书分类号 R739.63 R730.23
Transcriptional activation study of transforming gene
, 百拇医药
Tx-related human nasopharyngeal carcinoma
Peng Bailu, Cao Li, Li Guiyuan, Yao Kaitai
(Institute of Cancer Research, Hunan Medical University, Changsha 410078)
Tx gene is the DNA sequence with transforming activity which was cloned from the epithelial cell line(CNE2) of human nasopharyngeal carcinoma(NPC). The goal of this study is to find transcriptional activated site on the Tx 2.8kb fragment using DNase-Ⅰ hypersensitivity assay, by which understanding the role of the Tx in carcinogenesis of NPC. The results showed no DNase-Ⅰ hypersensitivity site on the fragment. It suggests that Tx 2.8kb fragment homogenous to IgκC might be regulated by the specific mechanism of immunoglobulin gene, rather than that of oncogenes.
, 百拇医药
Key words nasopharyngeal neoplasms; carcinoma; gene,Tx; endonucleases; DNase-Ⅰ hypersensitivity assay*; analysis; gene expression regulation,neoplasm
鼻咽癌是中国南方常见的恶性肿瘤。近几年来，国内外对鼻咽癌的研究已深入到分子水平，发现鼻咽癌的发生涉及多个瘤基因的活化事件[1，2]。Tx基因即是与鼻咽癌相关的恶性转化基因[3]，其全长16kb中已确定了核心部分EcoRI片段2.8kb的序列[4]；对此2.8kb已进行了多方面的研究[5，6]。一般认为，活跃转录的基因存在于结构松散的常染色质上，较少受到蛋白质的保护，因而易受核酸内切酶DNase-Ⅰ的攻击，特别是基因转录调控位点。本文采用DNase-Ⅰ超敏区法分析探索Tx基因2.8kb片段中的转录活化位点，为探讨Tx基因在鼻咽癌发病过程中的机制提供线索。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料 鼻咽癌细胞株HNE2为湖南医科大学肿瘤研究所建立。细胞在培养条件为RPMI-1640，10%小牛血清中，37℃，5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养。随机引物标记试剂盒为Promega公司产品；EcoRI,XbaⅠ,DNase-Ⅰ为Gibco/BRL公司产品；尼仑膜为Amersham Life Science公司产品；α-32P-dCTP为北京亚辉生物工程公司产品。
1.2 方法
1.2.1 ENE2细胞核的抽提 离心收获培养的HNE2细胞，加入5ml分离缓冲液(10mM Tris.Cl pH 7.4,140mM NaCl, 1mM EDTA)及0.5%终浓度的NP-40，冰上反应5min以裂解细胞。1000×g(800r.min-1)离心5min收获细胞核。用TGK3(10mM Tris.Cl pH8.1,20% glycerol,140mM KCl,5mM MgCl2,1mM MnCl2, 14mM mercaptoethanol) 洗涤细胞核，加适量TGK3冻存于液氮中备用。
, 百拇医药
1.2.2 DNase-Ⅰ浓度梯度处理细胞核及EcoRI对基因组DNA的消化 样品序号2～9中，每管加入2mg.ml-1 DNA的细胞核悬液50μl，用水补足至200μl体积。加入DNase-Ⅰ使其终浓度依次为0，0.5，1，2，4，8，16，32U.ml-1，于37℃温育5min。加入DNA抽提缓冲液以终止反应。按常规方法抽提细胞基因组DNA，溶于50μl TE中，紫外分光光度法测定浓度并调整为1mg.ml-1。取上述各样品10μg，分别于100μl体积中加入EcoRI 60U于37℃消化过夜，以期在基因组DNA中获得Tx2.8kb片段。
1.2.3 DNA探针制备 培养Tx2.8kb克隆质粒菌，抽提2.8kb质粒。用EcoRI，XbaⅠ双酶消化获得2.8kb的3′-端1.6kb，用随机引物标记试剂盒掺入α-32P-dCTP，在标记体系中同步加入0.1ng的λDNA/HindⅢ产物以标记λDNA/HindⅢ markers; Sephadex G-50柱滤去未掺入的游离α-32P-dCTP。探针总活性为4×107cpm。
, 百拇医药
1.2.4 Southern转膜和杂交 经EcoRI消化的HNE2细胞基因组DNA在0.8%琼脂糖凝胶中电泳，经变性和中和后用纸巾虹吸法将DNA转移至尼仑膜后杂交16h。杂交膜在2×SSC，0.1% SDS中于室温漂洗二次，每次15min，继而在0.1×SSC，0.1% SDS中于68℃漂洗2次，每次10min。保鲜膜包裹后，装入带增感屏的暗匣中，于-70℃曝光48h。
2 结 果
取1μl经DNase-Ⅰ梯度处理的基因组DNA各样品电泳，结果如图1所示。DNase-Ⅰ的梯度消化效果优良，尤其是Lane6的消化表现为从未消化(Lane2)到消化过度(Lane9)的中间状态，说明DNase-Ⅰ浓度梯度的范围选择合适。取各样品10μg，经EcoRI进一步消化，结果如图2所示。Southern转膜后，在杂交液中加入4×107cpm的来自Tx2.8kb的1.6kb探针。杂交结果如图3所示，在2.8kb处除有Tx2.8kb的杂交信号外，未见小于2.8kb主带的DNase-Ⅰ超敏性产生的亚带信号。
, 百拇医药
图1 DNase-Ⅰ梯度浓度对HNE2细胞核的消化 1行：λDNA/HindⅢ markers 2～9行：DNase-Ⅰ浓度依次为0，0.5，1，2，4，8，16，32U.ml-1
Fig. 1 Digestion of HNE2 nuclei by DNase-Ⅰ concentration gradient Lane 1:λDNA/HindⅢ markers 2～9: DNA degraded by DNase-Ⅰ concentrations being 0,0.5,1,2,4,8,16,32U.ml-1, respectively
图2 EcoRI对DNase-Ⅰ浓度梯度消化的HNE2细胞DNA的消化 1行：λDNA/HindⅢ markers 2～9行：依次为DNase-Ⅰ 0,0.5,1,2,4,8,16,32U.ml-1处理的DNA
, 百拇医药
Fig. 2 Digestion of HNE2 DNA degraded by DNase-Ⅰ concentration gradient with EcoRI Lane 1:λDNA/HindⅢ markers 2～9: DNA degraded by DNase-Ⅰ concentrations being 0,0.5,1,2,4,8,16,32U.ml-1, respectively
图3 HNE2细胞基因组DNA中Tx2.8kb的DNase-Ⅰ超敏区分析 1行:λDNA/HindⅢ markers 2～9行: 依次为DNase-Ⅰ 0,0.5,1,2,4,8,16,32U.ml-1 处理的DNA
Fig. 3 DNase-Ⅰ hypersensitivity assay of Tx2.8kb fragment in HNE2 genomic DNA Lane 1:λDNA/HindⅢ markers 2～9: DNA degraded by DNase-Ⅰ concentrations being 0,0.5,1,2,4,8,16,32U.ml-1, respectively
, http://www.100md.com
3 讨 论
人鼻咽癌转化基因Tx是从人鼻咽癌细胞株中克隆出来的具有转化活性的DNA序列[3]，人们已对其生物物理性状，部分核苷酸序列，染色体定位以及在鼻咽癌和其它细胞中的表达进行了研究。计算机分析表明，Tx2.8kb EcoRI片段互补链上1526～2734位核苷酸之间的序列与Hieter等[7，8]报道的免疫球蛋白κ链C区(IGκC)基因全部序列(1209个核苷酸)的同源程度高达99.5%。与IGκC同源的区域位于1.6kb XbaⅠ/EcoRI片段内，且不一致的碱基均位于IGκC基因3′-端终止密码子以后的非编码区。上述结果强烈提示，Tx基因与IGκC基因可能是同一种基因，或者说Tx基因是改变(突变)了的IGκC基因。
IGκC基因作为免疫球蛋白基因有着区别于一般基因调控模式的独特方法。在性细胞和非B细胞中，κ轻链基因的V区和C区序列被数十万个碱基对隔开；这些细胞的κ基因是不活动的。在成熟的B细胞中，V区和C区之间的序列被切除，使二区连接成一个有活性的基因。非功能性的V区大约有200个，而C区只有一个。在B细胞成熟过程中，重组使200个V区中的任一个随机地与C区连接而形成一个功能性基因。
, 百拇医药
以Tx基因1.6kb XbaI/EcoRI片段作探针所进行的Northerning杂交及Western Blotting实验表明，Tx基因在人鼻咽癌细胞株CNE2，HNE1和类淋巴母细胞系Raji和B95-8中表达1.3kb的mRNA和Kappa免疫球蛋白[6]。
图1示，DNase-Ⅰ的浓度梯度消化效果优良，尤其是Lane 6的消化状态表现为从未消化(Lane 2)到消化过度(Lane 9)的中间状态，说明DNase-Ⅰ浓度梯度的范围选择合适。图2表明，EcoRI对细胞基因组DNA的消化是完全的。图3显示：在2.8kb处有Tx2.8kb杂交信号；随着DNase-Ⅰ消化的浓度增大，DNA弥散的主要部分不在2.8kb前后时，杂交信号逐渐消失(Lane7,8,9)；但未见小于2.8kb主带的DNase-Ⅰ敏感性产生的特征性亚带杂交信号。据此基本认为，Tx2.8kb中无DNase-Ⅰ超敏区。
既然Tx基因，换言之IGκC，在多种细胞中有如此广泛的表达，为什么本资料的DNase-Ⅰ超敏区分析并未检出其转录活化位点呢也许Tx基因即是按照IGκC所遵循的免疫球蛋白基因的独特调控方式进行转录活化，而与一般的瘤基因活化方式无相通之处。这为我们从新的角度探讨鼻咽癌发病机制提供了有益的启示。
, http://www.100md.com
①国家自然科学基金资助项目(No.39400153)
作者：彭白露 男 36岁 助理研究员
参考文献
1 Huang DP, Ho JH, Chan WK, et al. Cytogenetics of undifferentiated nasopharyngeal carcinoma Xenografts from southern Chinese. Int J Cancer, 1989,43:936～939
2 Huang DP, Lo KW, Choi PH, et al.Loss of heterozygosity on the short arm of chromosome 3 in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Gaenet Cytogenet, 1991,54:91～99
, 百拇医药
3 Cao Ya, Yi Sun, Nancy H, et al. Isolation and partial characterization-associated sequence from human nasopharyngeal carcinoma. Mol Carcinogenesis, 1991,4:297～307
4 胡维新，曹亚，姚开泰.人类鼻咽癌细胞株CNE2的转化基因Tx的一个EcoRI片段的核苷酸序列分析.生物化学杂志，1993，9：331～336
5 胡维新，曹亚，李晓燕，等.Tx基因与免疫球蛋白Kappa基因的同源性研究及其在不同细胞株中的表达.生物化学与生物物理学报，1995，27(2)：215～221
6 姚开泰.鼻咽癌研究的回顾与展望.湖南医科大学学报，1995，20(2)：99～102
, http://www.100md.com
7 Hieter PA, Max EE, Seidman JG, et al.Cloned human and mouse Kappa immunoglobulin constant and J region genes conserve homology in functional segments. Cell, 1990,22:197～207
8 Hieter PA, Maizel JV Jr, Leder P. Evolution of human immunoglobulin KJ region genes. J Biol Chem, 1982,257:1516～1522
9 贺红，李小燕，曹亚.鼻咽癌恶性转化基因的染色体定位研究.中华病理杂志，1993，73：338～340
10 Malcolm S, Barton P, Murphy C, et al.Localization of human immunoglobulin K light chain variable rejion genes to the short arm of chromosome 2 by in situ hybridization. PNAS, 1982,79:4957～4961
1997-12-23 收稿, 百拇医药
单位：肿瘤研究所 长沙 410078
关键词：鼻咽肿瘤；癌；基因；Tx；核酸内切酶；Dnase-Ⅰ超敏区；分析；基因表达调节；肿瘤
湖南医科大学学报990308 提要 采用DNase-Ⅰ超敏区分析法寻找Tx2.8kb EcoRI片段的转录活化位点，以期探索Tx基因在鼻咽癌发病过程中的作用。结果未发现在此片段中有DNase-Ⅰ超敏区位点。提示与IgκC同源的Tx2.8kb EcoRI片段可能采用免疫球蛋白基因所独有的基因调控方式，而与瘤基因的一般转录活化方式明显不同。
中国图书分类号 R739.63 R730.23
Transcriptional activation study of transforming gene
, 百拇医药
Tx-related human nasopharyngeal carcinoma
Peng Bailu, Cao Li, Li Guiyuan, Yao Kaitai
(Institute of Cancer Research, Hunan Medical University, Changsha 410078)
Tx gene is the DNA sequence with transforming activity which was cloned from the epithelial cell line(CNE2) of human nasopharyngeal carcinoma(NPC). The goal of this study is to find transcriptional activated site on the Tx 2.8kb fragment using DNase-Ⅰ hypersensitivity assay, by which understanding the role of the Tx in carcinogenesis of NPC. The results showed no DNase-Ⅰ hypersensitivity site on the fragment. It suggests that Tx 2.8kb fragment homogenous to IgκC might be regulated by the specific mechanism of immunoglobulin gene, rather than that of oncogenes.
, 百拇医药
Key words nasopharyngeal neoplasms; carcinoma; gene,Tx; endonucleases; DNase-Ⅰ hypersensitivity assay*; analysis; gene expression regulation,neoplasm
鼻咽癌是中国南方常见的恶性肿瘤。近几年来，国内外对鼻咽癌的研究已深入到分子水平，发现鼻咽癌的发生涉及多个瘤基因的活化事件[1，2]。Tx基因即是与鼻咽癌相关的恶性转化基因[3]，其全长16kb中已确定了核心部分EcoRI片段2.8kb的序列[4]；对此2.8kb已进行了多方面的研究[5，6]。一般认为，活跃转录的基因存在于结构松散的常染色质上，较少受到蛋白质的保护，因而易受核酸内切酶DNase-Ⅰ的攻击，特别是基因转录调控位点。本文采用DNase-Ⅰ超敏区法分析探索Tx基因2.8kb片段中的转录活化位点，为探讨Tx基因在鼻咽癌发病过程中的机制提供线索。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料 鼻咽癌细胞株HNE2为湖南医科大学肿瘤研究所建立。细胞在培养条件为RPMI-1640，10%小牛血清中，37℃，5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养。随机引物标记试剂盒为Promega公司产品；EcoRI,XbaⅠ,DNase-Ⅰ为Gibco/BRL公司产品；尼仑膜为Amersham Life Science公司产品；α-32P-dCTP为北京亚辉生物工程公司产品。
1.2 方法
1.2.1 ENE2细胞核的抽提 离心收获培养的HNE2细胞，加入5ml分离缓冲液(10mM Tris.Cl pH 7.4,140mM NaCl, 1mM EDTA)及0.5%终浓度的NP-40，冰上反应5min以裂解细胞。1000×g(800r.min-1)离心5min收获细胞核。用TGK3(10mM Tris.Cl pH8.1,20% glycerol,140mM KCl,5mM MgCl2,1mM MnCl2, 14mM mercaptoethanol) 洗涤细胞核，加适量TGK3冻存于液氮中备用。
, 百拇医药
1.2.2 DNase-Ⅰ浓度梯度处理细胞核及EcoRI对基因组DNA的消化 样品序号2～9中，每管加入2mg.ml-1 DNA的细胞核悬液50μl，用水补足至200μl体积。加入DNase-Ⅰ使其终浓度依次为0，0.5，1，2，4，8，16，32U.ml-1，于37℃温育5min。加入DNA抽提缓冲液以终止反应。按常规方法抽提细胞基因组DNA，溶于50μl TE中，紫外分光光度法测定浓度并调整为1mg.ml-1。取上述各样品10μg，分别于100μl体积中加入EcoRI 60U于37℃消化过夜，以期在基因组DNA中获得Tx2.8kb片段。
1.2.3 DNA探针制备 培养Tx2.8kb克隆质粒菌，抽提2.8kb质粒。用EcoRI，XbaⅠ双酶消化获得2.8kb的3′-端1.6kb，用随机引物标记试剂盒掺入α-32P-dCTP，在标记体系中同步加入0.1ng的λDNA/HindⅢ产物以标记λDNA/HindⅢ markers; Sephadex G-50柱滤去未掺入的游离α-32P-dCTP。探针总活性为4×107cpm。
, 百拇医药
1.2.4 Southern转膜和杂交 经EcoRI消化的HNE2细胞基因组DNA在0.8%琼脂糖凝胶中电泳，经变性和中和后用纸巾虹吸法将DNA转移至尼仑膜后杂交16h。杂交膜在2×SSC，0.1% SDS中于室温漂洗二次，每次15min，继而在0.1×SSC，0.1% SDS中于68℃漂洗2次，每次10min。保鲜膜包裹后，装入带增感屏的暗匣中，于-70℃曝光48h。
2 结 果
取1μl经DNase-Ⅰ梯度处理的基因组DNA各样品电泳，结果如图1所示。DNase-Ⅰ的梯度消化效果优良，尤其是Lane6的消化表现为从未消化(Lane2)到消化过度(Lane9)的中间状态，说明DNase-Ⅰ浓度梯度的范围选择合适。取各样品10μg，经EcoRI进一步消化，结果如图2所示。Southern转膜后，在杂交液中加入4×107cpm的来自Tx2.8kb的1.6kb探针。杂交结果如图3所示，在2.8kb处除有Tx2.8kb的杂交信号外，未见小于2.8kb主带的DNase-Ⅰ超敏性产生的亚带信号。
, 百拇医药
图1 DNase-Ⅰ梯度浓度对HNE2细胞核的消化 1行：λDNA/HindⅢ markers 2～9行：DNase-Ⅰ浓度依次为0，0.5，1，2，4，8，16，32U.ml-1
Fig. 1 Digestion of HNE2 nuclei by DNase-Ⅰ concentration gradient Lane 1:λDNA/HindⅢ markers 2～9: DNA degraded by DNase-Ⅰ concentrations being 0,0.5,1,2,4,8,16,32U.ml-1, respectively
图2 EcoRI对DNase-Ⅰ浓度梯度消化的HNE2细胞DNA的消化 1行：λDNA/HindⅢ markers 2～9行：依次为DNase-Ⅰ 0,0.5,1,2,4,8,16,32U.ml-1处理的DNA
, 百拇医药
Fig. 2 Digestion of HNE2 DNA degraded by DNase-Ⅰ concentration gradient with EcoRI Lane 1:λDNA/HindⅢ markers 2～9: DNA degraded by DNase-Ⅰ concentrations being 0,0.5,1,2,4,8,16,32U.ml-1, respectively
图3 HNE2细胞基因组DNA中Tx2.8kb的DNase-Ⅰ超敏区分析 1行:λDNA/HindⅢ markers 2～9行: 依次为DNase-Ⅰ 0,0.5,1,2,4,8,16,32U.ml-1 处理的DNA
Fig. 3 DNase-Ⅰ hypersensitivity assay of Tx2.8kb fragment in HNE2 genomic DNA Lane 1:λDNA/HindⅢ markers 2～9: DNA degraded by DNase-Ⅰ concentrations being 0,0.5,1,2,4,8,16,32U.ml-1, respectively
, http://www.100md.com
3 讨 论
人鼻咽癌转化基因Tx是从人鼻咽癌细胞株中克隆出来的具有转化活性的DNA序列[3]，人们已对其生物物理性状，部分核苷酸序列，染色体定位以及在鼻咽癌和其它细胞中的表达进行了研究。计算机分析表明，Tx2.8kb EcoRI片段互补链上1526～2734位核苷酸之间的序列与Hieter等[7，8]报道的免疫球蛋白κ链C区(IGκC)基因全部序列(1209个核苷酸)的同源程度高达99.5%。与IGκC同源的区域位于1.6kb XbaⅠ/EcoRI片段内，且不一致的碱基均位于IGκC基因3′-端终止密码子以后的非编码区。上述结果强烈提示，Tx基因与IGκC基因可能是同一种基因，或者说Tx基因是改变(突变)了的IGκC基因。
IGκC基因作为免疫球蛋白基因有着区别于一般基因调控模式的独特方法。在性细胞和非B细胞中，κ轻链基因的V区和C区序列被数十万个碱基对隔开；这些细胞的κ基因是不活动的。在成熟的B细胞中，V区和C区之间的序列被切除，使二区连接成一个有活性的基因。非功能性的V区大约有200个，而C区只有一个。在B细胞成熟过程中，重组使200个V区中的任一个随机地与C区连接而形成一个功能性基因。
, 百拇医药
以Tx基因1.6kb XbaI/EcoRI片段作探针所进行的Northerning杂交及Western Blotting实验表明，Tx基因在人鼻咽癌细胞株CNE2，HNE1和类淋巴母细胞系Raji和B95-8中表达1.3kb的mRNA和Kappa免疫球蛋白[6]。
图1示，DNase-Ⅰ的浓度梯度消化效果优良，尤其是Lane 6的消化状态表现为从未消化(Lane 2)到消化过度(Lane 9)的中间状态，说明DNase-Ⅰ浓度梯度的范围选择合适。图2表明，EcoRI对细胞基因组DNA的消化是完全的。图3显示：在2.8kb处有Tx2.8kb杂交信号；随着DNase-Ⅰ消化的浓度增大，DNA弥散的主要部分不在2.8kb前后时，杂交信号逐渐消失(Lane7,8,9)；但未见小于2.8kb主带的DNase-Ⅰ敏感性产生的特征性亚带杂交信号。据此基本认为，Tx2.8kb中无DNase-Ⅰ超敏区。
既然Tx基因，换言之IGκC，在多种细胞中有如此广泛的表达，为什么本资料的DNase-Ⅰ超敏区分析并未检出其转录活化位点呢也许Tx基因即是按照IGκC所遵循的免疫球蛋白基因的独特调控方式进行转录活化，而与一般的瘤基因活化方式无相通之处。这为我们从新的角度探讨鼻咽癌发病机制提供了有益的启示。
, http://www.100md.com
①国家自然科学基金资助项目(No.39400153)
作者：彭白露 男 36岁 助理研究员
参考文献
1 Huang DP, Ho JH, Chan WK, et al. Cytogenetics of undifferentiated nasopharyngeal carcinoma Xenografts from southern Chinese. Int J Cancer, 1989,43:936～939
2 Huang DP, Lo KW, Choi PH, et al.Loss of heterozygosity on the short arm of chromosome 3 in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Gaenet Cytogenet, 1991,54:91～99
, 百拇医药
3 Cao Ya, Yi Sun, Nancy H, et al. Isolation and partial characterization-associated sequence from human nasopharyngeal carcinoma. Mol Carcinogenesis, 1991,4:297～307
4 胡维新，曹亚，姚开泰.人类鼻咽癌细胞株CNE2的转化基因Tx的一个EcoRI片段的核苷酸序列分析.生物化学杂志，1993，9：331～336
5 胡维新，曹亚，李晓燕，等.Tx基因与免疫球蛋白Kappa基因的同源性研究及其在不同细胞株中的表达.生物化学与生物物理学报，1995，27(2)：215～221
6 姚开泰.鼻咽癌研究的回顾与展望.湖南医科大学学报，1995，20(2)：99～102
, http://www.100md.com
7 Hieter PA, Max EE, Seidman JG, et al.Cloned human and mouse Kappa immunoglobulin constant and J region genes conserve homology in functional segments. Cell, 1990,22:197～207
8 Hieter PA, Maizel JV Jr, Leder P. Evolution of human immunoglobulin KJ region genes. J Biol Chem, 1982,257:1516～1522
9 贺红，李小燕，曹亚.鼻咽癌恶性转化基因的染色体定位研究.中华病理杂志，1993，73：338～340
10 Malcolm S, Barton P, Murphy C, et al.Localization of human immunoglobulin K light chain variable rejion genes to the short arm of chromosome 2 by in situ hybridization. PNAS, 1982,79:4957～4961
1997-12-23 收稿, 百拇医药