细胞因子及4℃保存对脐血造血干/祖细胞的影响①
作者：谭运福② 李卫民 蒋德昭
单位：血液生理研究室 长沙 410078
关键词：造血细胞生长因子；造血干细胞；脐带；血液
湖南医科大学学报990307 提要 应用体外半固体培养方法，研究了粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素3(IL-3)、白细胞介素6(IL-6)和促红细胞生成素(Epo)的不同组合及4℃保存对脐血造血干/祖细胞CFU-GM和HPP-CFC产率的影响。结果表明：在琼脂半固体培养体系中，在不同组合的细胞因子作用下，脐血CFU-GM产率有明显差异；以GM-CSF组最低，GM-CSF+IL-3+IL-6+Epo组最高。脐血置4℃保存4d后，CFU-GM和HPP-CFC产率明显降低。
中国图书分类号 R331.1
, http://www.100md.com
Effects of cytokines and umbilical cord blood
preserved at 4℃ on the growth of CFU-GM and HPP-CFC
Tan Yunfu Li Weimin Jiang Dezhao
(Department of Blood Physiology, Hunan Medical University, Changsha 410078)
We studied the effects of different cytokine combinations and umbilical cord blood preserved at 4℃ for 4 days on the growth of CFU-GM and HPP-CFC. The results showed that the growth of umbilical cord blood CFU-GM was markedly different when various combinations of cytokines were used. After 2 weeks culturing with IL-3 alone or plus GM-CSF, the number of umbilical cord blood CFU-GM was increased when compared with GM-CSF group; upon stimulation with GM-CSF plus IL-3 plus IL-6 plus Epo, a significant increase of umbilical cord blood CFU-GM was seen. After umbilical cord blood being preserved 4 days at 4℃, the number of umbilical cord blood CFU-GM and HPP-CFC was decreased.
, 百拇医药
Key words hematopoietic cell growth factor; hematopoietic stem cells; umbilical cord; blood
脐血中富含造血干/祖细胞[1]，现已成功地应用脐血造血细胞移植治疗一系列疾病[3，4]。研究认为，脐血造血细胞不仅与骨髓一样可移植和转导基因，而且具有取材方便、成本低、体外易扩增等优点。本文应用半固体培养方法探讨不同细胞因子组合及脐血4℃保存对脐血造血干/祖细胞CFU-GM和HPP-CFC产率的影响。
1 材料与方法
1.1 脐血采集 脐血取自14例健康足月孕妇，其中剖腹产5例。用一次性无菌塑料采血袋进行密闭式采集脐血，以肝素20～40U.ml-1抗凝，淋巴细胞分离液分离后进行实验，或4℃保存4d后，观察脐血CFU-GM和HPP-CFC产率的变化。
, 百拇医药
1.2 脐血单个核细胞(MNC)的分离 抗凝血低温条件下离心20min,2000r.min-1，吸取白膜层。将富含核细胞的白膜层以生理盐水稀释2倍，用Ficoll淋巴细胞分离液经4℃，3000r.min-1 25min分离MNC，以IMDM调整细胞悬液浓度备用。
1.3 脐血CFU-GM和HPP-CFC半固体培养 CFU-GM培养按常规方法稍加改进[2]。CFU-GM半固体培养体系为：IMDM培养液，30%马血清，10%人AB型血清，0.3%琼脂。脐血有核细胞浓度为20×104.ml-1。不同细胞因子组合依次为：①GM-CSF，②IL-3，③GM-CSF+IL-3，④GM-CSF+IL-3+IL-6+Epo。GM-CSF剂量为50U.ml-1，IL-3剂量为50U.ml-1，IL-6剂量为75ng.ml-1，Epo剂量为2U.ml-1。体系混匀后分别接种于35mm玻璃培养皿，每一实验组设3个平行点，每皿1ml，置37℃，5% CO2及饱和湿度条件下，于培养的第7d计数集落数(>40个细胞为一集落)。HPP-CFC培养体系为：IMDM培养液，30%马血清，10%人AB型血清，0.3%琼脂，GM-CSF 50U.ml-1，SCF 50ng.ml-1，IL-3 50U.ml-1，IL-6 75ng.ml-1，Epo 2U.ml-1，脐血有核细胞浓度20×104.ml-1。培养体系用30mm直径的玻璃皿培养，每组培养体系种3皿，每皿1ml，培养28d，计数HPP-CFC集落(集落直径>1mm)。
, 百拇医药
1.4 统计学处理 结果用均数±标准差(
±s)表示：组间差异用t检验。
2 结 果
2.1 脐血采集量和有核细胞数 正常分娩组脐血采集量为100.26±14.41ml,有核细胞数为1.46±0.013×109.ml-1；经剖腹产脐血采血量为242.00±145.91ml，有核细胞数为4.08±0.02×109.ml-1。剖腹产脐血采集量及有核细胞数较自然分娩明显增多(P<0.01)，有核细胞经胎盼蓝染色细胞存活率为99%。
2.2 细胞因子组合对CFU-GM产率的影响 不同的细胞因子组合对CFU-GM产率的影响有较大差别，各培养体系CFU-GM分别为：①GM-CSF组，82.33±3.5个.ml-1，②IL-3组，123.00±6.24个.ml-1，③GM-CSF+IL-3组，142.00±4.00个.ml-1，④GM-CSF+IL-3+IL-6+Epo组181.00±4.58个.ml-1。结果显示GM-CSF+IL-3+IL-6+Epo组CFU-GM产率最高(图1)，单个集落直径较大。
, 百拇医药
图1 不同的细胞因子组合对脐血CFU-GM产率的影响 ①与GM-CSF组相比，P<0.01
Fig. 1 Effect of different cytokine combination on the growth of CFU-GM ① Compared with GM-CSF gorup, P<0.01
2.3 脐血全血4℃保存对CFU-GM和HPP-CFC产率的影响 与采血后立即检测CFU-GM和HPP-CFC产率的对照组相比，脐血全血4℃保存4d后CFU-GM和HPP-CFC产率显著低于对照组(图2)。
图2 脐血4℃条件下放置4d对脐血CFU-GM和HPP-CFC产率的影响 A：CFU-GM；B：HPP-CFC ①与对照组相比，P<0.01
, 百拇医药
Fig. 2 Effect of blood preserved for 4 days at 4℃ on the growth of CFU-GM and HPP-CFC A: CFU-GM; B: HPP-CFC ①Compared with control, P<0.01
3 讨 论
本文观察了从不同途径采集脐血对脐血收集量的影响，结果表明以经剖腹产采集的血量为多。当进行脐血造血干/祖细胞移植时，在脐血量需求较多的情况下，可考虑首选经剖腹产采集脐血，因它可提供较多的造血干/祖细胞。脐血干/祖细胞体外扩增对于脐血移植、基因治疗的靶细胞筛选及基因转移研究有重要意义。许多研究表明，在不同因素影响下，对脐血造血干/祖细胞的体外扩增有不同的影响[4，5]。本文观察用不同细胞因子组合及脐血4℃低温保存情况下对脐血CFU-GM产率的影响。表明单用IL-3组CFU-GM产率高于GM-CSF组，联合应用GM-CSF+IL-3较单用这两种细胞因子的CFU-GM产率明显增多，GM-CSF+IL-3+IL-6+Epo组扩增效率最大。体外4℃保存脐血4d后，脐血CFU-GM和HPP-CFC回收率显著降低。因此，在进行脐血的基础研究、临床输注、脐血移植、基因转移等方面要从多方面考虑体外因素对造血干/祖细胞的影响。
, 百拇医药
①湖南省卫生厅科研基金资助(No：9601) ②进修医生
作者：谭运福 女 45岁 副教授
参考文献
1 沈柏均主编.人类脐血基础与临床.第一版，天津：天津科学技术出版社，1995：25～26
2 葛忠良.造血祖细胞培养技术.见：杨景山主编.医学细胞化学生物技术.第一版，北京：北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1990：305～306
3 Gluckman E, Broxmeyer H, Auerbach A, et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical cord blood from an HLA-identical sibling. N Engl J Med, 1989,321:1174～1178
4 Wagner JE. Umbilical cord and placental blood transplantation: analysis of the clinical results. J Hematother, 1993,2(2):265～268
5 How J, Bradley B, Marsh J, et al. Growth of human umbilical-cord blood in long-term hematopietic culture. Lancet, 1992,340:73～76
1997-12-22 收稿, 百拇医药(谭运福② 李卫民 蒋德昭)
单位：血液生理研究室 长沙 410078
关键词：造血细胞生长因子；造血干细胞；脐带；血液
湖南医科大学学报990307 提要 应用体外半固体培养方法，研究了粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素3(IL-3)、白细胞介素6(IL-6)和促红细胞生成素(Epo)的不同组合及4℃保存对脐血造血干/祖细胞CFU-GM和HPP-CFC产率的影响。结果表明：在琼脂半固体培养体系中，在不同组合的细胞因子作用下，脐血CFU-GM产率有明显差异；以GM-CSF组最低，GM-CSF+IL-3+IL-6+Epo组最高。脐血置4℃保存4d后，CFU-GM和HPP-CFC产率明显降低。
中国图书分类号 R331.1
, http://www.100md.com
Effects of cytokines and umbilical cord blood
preserved at 4℃ on the growth of CFU-GM and HPP-CFC
Tan Yunfu Li Weimin Jiang Dezhao
(Department of Blood Physiology, Hunan Medical University, Changsha 410078)
We studied the effects of different cytokine combinations and umbilical cord blood preserved at 4℃ for 4 days on the growth of CFU-GM and HPP-CFC. The results showed that the growth of umbilical cord blood CFU-GM was markedly different when various combinations of cytokines were used. After 2 weeks culturing with IL-3 alone or plus GM-CSF, the number of umbilical cord blood CFU-GM was increased when compared with GM-CSF group; upon stimulation with GM-CSF plus IL-3 plus IL-6 plus Epo, a significant increase of umbilical cord blood CFU-GM was seen. After umbilical cord blood being preserved 4 days at 4℃, the number of umbilical cord blood CFU-GM and HPP-CFC was decreased.
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Key words hematopoietic cell growth factor; hematopoietic stem cells; umbilical cord; blood
脐血中富含造血干/祖细胞[1]，现已成功地应用脐血造血细胞移植治疗一系列疾病[3，4]。研究认为，脐血造血细胞不仅与骨髓一样可移植和转导基因，而且具有取材方便、成本低、体外易扩增等优点。本文应用半固体培养方法探讨不同细胞因子组合及脐血4℃保存对脐血造血干/祖细胞CFU-GM和HPP-CFC产率的影响。
1 材料与方法
1.1 脐血采集 脐血取自14例健康足月孕妇，其中剖腹产5例。用一次性无菌塑料采血袋进行密闭式采集脐血，以肝素20～40U.ml-1抗凝，淋巴细胞分离液分离后进行实验，或4℃保存4d后，观察脐血CFU-GM和HPP-CFC产率的变化。
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1.2 脐血单个核细胞(MNC)的分离 抗凝血低温条件下离心20min,2000r.min-1，吸取白膜层。将富含核细胞的白膜层以生理盐水稀释2倍，用Ficoll淋巴细胞分离液经4℃，3000r.min-1 25min分离MNC，以IMDM调整细胞悬液浓度备用。
1.3 脐血CFU-GM和HPP-CFC半固体培养 CFU-GM培养按常规方法稍加改进[2]。CFU-GM半固体培养体系为：IMDM培养液，30%马血清，10%人AB型血清，0.3%琼脂。脐血有核细胞浓度为20×104.ml-1。不同细胞因子组合依次为：①GM-CSF，②IL-3，③GM-CSF+IL-3，④GM-CSF+IL-3+IL-6+Epo。GM-CSF剂量为50U.ml-1，IL-3剂量为50U.ml-1，IL-6剂量为75ng.ml-1，Epo剂量为2U.ml-1。体系混匀后分别接种于35mm玻璃培养皿，每一实验组设3个平行点，每皿1ml，置37℃，5% CO2及饱和湿度条件下，于培养的第7d计数集落数(>40个细胞为一集落)。HPP-CFC培养体系为：IMDM培养液，30%马血清，10%人AB型血清，0.3%琼脂，GM-CSF 50U.ml-1，SCF 50ng.ml-1，IL-3 50U.ml-1，IL-6 75ng.ml-1，Epo 2U.ml-1，脐血有核细胞浓度20×104.ml-1。培养体系用30mm直径的玻璃皿培养，每组培养体系种3皿，每皿1ml，培养28d，计数HPP-CFC集落(集落直径>1mm)。
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1.4 统计学处理 结果用均数±标准差(
±s)表示：组间差异用t检验。2 结 果
2.1 脐血采集量和有核细胞数 正常分娩组脐血采集量为100.26±14.41ml,有核细胞数为1.46±0.013×109.ml-1；经剖腹产脐血采血量为242.00±145.91ml，有核细胞数为4.08±0.02×109.ml-1。剖腹产脐血采集量及有核细胞数较自然分娩明显增多(P<0.01)，有核细胞经胎盼蓝染色细胞存活率为99%。
2.2 细胞因子组合对CFU-GM产率的影响 不同的细胞因子组合对CFU-GM产率的影响有较大差别，各培养体系CFU-GM分别为：①GM-CSF组，82.33±3.5个.ml-1，②IL-3组，123.00±6.24个.ml-1，③GM-CSF+IL-3组，142.00±4.00个.ml-1，④GM-CSF+IL-3+IL-6+Epo组181.00±4.58个.ml-1。结果显示GM-CSF+IL-3+IL-6+Epo组CFU-GM产率最高(图1)，单个集落直径较大。
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图1 不同的细胞因子组合对脐血CFU-GM产率的影响 ①与GM-CSF组相比，P<0.01
Fig. 1 Effect of different cytokine combination on the growth of CFU-GM ① Compared with GM-CSF gorup, P<0.01
2.3 脐血全血4℃保存对CFU-GM和HPP-CFC产率的影响 与采血后立即检测CFU-GM和HPP-CFC产率的对照组相比，脐血全血4℃保存4d后CFU-GM和HPP-CFC产率显著低于对照组(图2)。
图2 脐血4℃条件下放置4d对脐血CFU-GM和HPP-CFC产率的影响 A：CFU-GM；B：HPP-CFC ①与对照组相比，P<0.01
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Fig. 2 Effect of blood preserved for 4 days at 4℃ on the growth of CFU-GM and HPP-CFC A: CFU-GM; B: HPP-CFC ①Compared with control, P<0.01
3 讨 论
本文观察了从不同途径采集脐血对脐血收集量的影响，结果表明以经剖腹产采集的血量为多。当进行脐血造血干/祖细胞移植时，在脐血量需求较多的情况下，可考虑首选经剖腹产采集脐血，因它可提供较多的造血干/祖细胞。脐血干/祖细胞体外扩增对于脐血移植、基因治疗的靶细胞筛选及基因转移研究有重要意义。许多研究表明，在不同因素影响下，对脐血造血干/祖细胞的体外扩增有不同的影响[4，5]。本文观察用不同细胞因子组合及脐血4℃低温保存情况下对脐血CFU-GM产率的影响。表明单用IL-3组CFU-GM产率高于GM-CSF组，联合应用GM-CSF+IL-3较单用这两种细胞因子的CFU-GM产率明显增多，GM-CSF+IL-3+IL-6+Epo组扩增效率最大。体外4℃保存脐血4d后，脐血CFU-GM和HPP-CFC回收率显著降低。因此，在进行脐血的基础研究、临床输注、脐血移植、基因转移等方面要从多方面考虑体外因素对造血干/祖细胞的影响。
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①湖南省卫生厅科研基金资助(No：9601) ②进修医生
作者：谭运福 女 45岁 副教授
参考文献
1 沈柏均主编.人类脐血基础与临床.第一版，天津：天津科学技术出版社，1995：25～26
2 葛忠良.造血祖细胞培养技术.见：杨景山主编.医学细胞化学生物技术.第一版，北京：北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1990：305～306
3 Gluckman E, Broxmeyer H, Auerbach A, et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical cord blood from an HLA-identical sibling. N Engl J Med, 1989,321:1174～1178
4 Wagner JE. Umbilical cord and placental blood transplantation: analysis of the clinical results. J Hematother, 1993,2(2):265～268
5 How J, Bradley B, Marsh J, et al. Growth of human umbilical-cord blood in long-term hematopietic culture. Lancet, 1992,340:73～76
1997-12-22 收稿, 百拇医药(谭运福② 李卫民 蒋德昭)