单克隆抗体ELISA测定血浆富组氨酸糖蛋白的方法①
作者：徐克前 陈正炎
单位：临床生化教研室 长沙 410013
关键词：富组氨酸糖蛋白*；酶联免疫吸附测定；抗体类；单克隆；血浆；方法学
湖南医科大学学报990305 提要 建立用单克隆抗体(McAb)酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定血浆富组氨酸糖蛋白(HRG)的方法。结果显示：McAb 3C6F3包被浓度为10μg.ml-1，单抗酶标结合物(McAb9E7C9-HRP)作1∶200稀释时标准曲线最理想；最低检出限为1ng.ml-1，批内CV 8.2%，批间CV 11.5%，回收率为89.1%，测定范围为2.5～80ng.ml-1；用该法测定40例正常人血浆HRG为(110.3±9.7)mg.L-1，24例肝硬化患者血浆HRG为(79.5±12.6)mg.L-1。该法的特异性强，且方便而准确。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 R446.112
Establishment of sandwich ELISA with McAbs to meausre
histidine-rich glycoprotein in plasma
Xu Keqian Chen Zhengyan
(Department of Clinical Biochemistry, Hunan Medical University, Changsha 410013)
The objective of this paper is to establish a method using sandwich ELISA with McAbs to measure plasma histidine-rich glycoprotein(HRG). The results showed that this method, with a working range from 2.5ng.ml-1 to 80ng.ml-1, provided the lower limit of detection of 1ng.ml-1, the average intra-assay CV, the inter-assay CV and the recovery rate of HRG were 8.2%, 11.5% and 89.1%, respectively. Interference by antithrombin Ⅲ and human albumin was not significant. With this method, the concentration of plasma HRG from healthy donors was (110.3±9.7)mg.L-1, and the value of plasma HRG in liver cirrhosis was (79.5±12.6)mg.L-1. These results suggest that sandwich ELISA with McAbs is high sensitive, precise and specific.
, 百拇医药
Key words histidine-rich glycoprotein*; antibodies,monoclonal; enzyme-linked immunosorbent assay; plasma; methodology
富组氨酸糖蛋白(histidine-rich glycoprotein, HRG)在体内分布广泛，血浆、血小板、骨髓巨核细胞和乳汁中均存在。血浆中HRG浓度约为100～150mg.L-1，由肝实质细胞产生。血浆HRG浓度检测具有重要的临床意义[1，2]，先兆子痫等异常妊娠、肝损伤性疾病及急性心肌梗塞患者，HRG浓度下降。血浆HRG水平与血栓形成密切相关，其下降还可作为器官移植排斥反应的监测指标。目前，国外检测血浆HRG的方法是火箭免疫电泳[2]和多抗酶联免疫吸附测定(ELISA)[3]。为了提高血浆HRG检测的特异性，作者在制备抗HRG单克隆抗体(单抗)的基础上建立了单抗夹心ELISA方法，并将其初步应用于临床。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 ①抗HRG单抗9E7C9和3C6F3系本室采用淋巴细胞杂交瘤技术制备及纯化[4]，经Western-blotting等方法鉴定为抗HRG的单抗。用小鼠Ig亚类测定试剂盒作琼脂糖免疫双扩散试验，显示9E7C9和3C6F3均为IgG1亚类。②抗原标准品系本室制备，经SDS-PAGE和免疫双扩试验证明为电泳纯和免疫纯[5]。③固相载体为聚苯乙烯微量反应板。④包被缓冲液为0.05mol.L-1，pH 9.6碳酸盐缓冲液；洗涤液(PBS-Tween液，pH 7.4)为2.5mmol.L-1 NaH2PO4，7.5mmol.L-1 Na2HPO4，145mmol.L-1 NaCl, 1mmol.L-1 Na2 EDTA及0.1% Tween 20的混合液；封闭液用PBS-Tween液配成1%牛血清白蛋白溶液；稀释液为3% PEG6000的PBS-Tween液；底物溶液为邻苯二胺4mg加入0.1mol.L-1 pH 5.0磷酸-柠檬酸盐缓冲液10ml，临用前加入30% H2O2 10μl。⑤空白对照系用稀释液代替抗原标本；阴性对照用去HRG血浆经稀释后代替抗原标本。⑥抗凝血酶Ⅲ为上海生物制品研究所产品；人血清白蛋白、辣根过氧化物酶为SERVA产品。
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1.1.2 血浆标本 来源于健康成人40例，经临床诊断为肝硬化病人24例。清晨空腹采血，ACD抗凝，4℃离心分离血浆，置-40℃冰箱保存待测，测定时用稀释液作1∶100连续二次稀释。
1.2 方法
1.2.1 辣根过氧化物酶标记McAb9E7C9 采用改良过碘酸钠法，HRP与McAb的摩尔比值和McAb-HRP结合物中HRP的活性综合评价酶标单抗的质量。
1.2.2 去HRG血浆的制备 按Koide T方法[6]制备去HRG血浆。用ELISA法检测时，与空白对照A450差值应小于0.1。
1.2.3 ELISA方法的建立 ⑴包被：用包被液将3C6F3稀释成10μg.ml-1，200μl/孔，4℃过夜，洗板3次，每次3min。⑵封闭：加封闭液200μl/孔，37℃放置1h，洗板3次，每次3min。⑶加样：加稀释样本血浆或HRG标准液200μl/孔，37℃ 2h，洗板3次，每次3min。⑷加酶标抗体：将HRP-McAb 9E7C9稀释成1∶200，200μl/孔，37℃ 2h，洗板3次，每次3min。⑸显色：立即于孔中加入底物溶液200μl/孔，37℃避光15min，加入2mol.L-1 H2SO4 50μl/孔终止反应。⑹检测：用酶标仪于450nm处测定吸光度。
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1.2.4 统计学处理 结果以
±s表示；数据用INSTAT统计学软件；两样本间比较用t检验。
2 结 果
2.1 实验条件 用棋盘滴定法确定包被聚苯乙烯微孔板的McAb3C6F3浓度及HRP-McAb9E7C9的稀释度。当McAb3C6F3包被浓度为10μg.ml-1时，HRP-McAb 9E7C9的稀释度为1∶200时，所得标准曲线最理想。
2.2 方法评价
2.2.1 精密度 取低、中、高3份血浆标本，做批内和批间精密度(CV)实验。结果示，批内平均CV为8.2%，批间平均CV为11.5%(表1)。
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表1 血浆HRG测定精密度实验结果(mg.L-1) 样本号
批内(15次)
批间(10次)±s
CV(%)±s
CV(%)
1
85.3±6.7
7.9
82.1±10.3
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12.5
2
128.0±10.6
8.3
107.5±14.1
13.1
3
141.5±11.9
8.4
142.6±12.5
8.8
2.2.2 准确度 在已知HRG浓度的血浆中加入不同浓度的HRG标准液，用已建立的ELISA方法测得的回收率分别为91.6%和86.5%，平均为89.1%(表2)。表2 血浆HRG测定回收试验结果 测得浓度
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(mg.L-1)
加入标准液浓度
(mg.L-1)
回收浓度
(mg.L-1)
回收率
(%)
120.5
-
-
-
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166.3
50
45.8
91.6
207.0
100
86.5
86.5
2.2.3 检出限的测定 按阴性对照的±3s计算，检测的下限为1.0ng.ml-1。
2.2.4 线性范围 将HRG标准液作系列稀释，按ELISA法测定，用半对数坐标纸作标准曲线，可知HRG浓度在2.5～80ng.ml-1之间线性良好(附图)。
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附图 抗HRG McAb夹心ELISA标准曲线
Fig. Standard curve of sandwich ELISA with anti-HRG McAb
2.2.5 干扰实验 用抗凝血酶Ⅲ和人血清白蛋白代替抗原HRG，按ELISA法操作，其显色程度与空白对照A450差值均小于0.1。说明抗凝血酶Ⅲ和人血清白蛋白对所建立的ELISA方法未观察到干扰反应。
2.3 健康成人血浆HRG含量 40例健康成人的血浆HRG浓度为(110.3±9.7)mg.L-1，其中17例男性为(111.8±9.0)mg.L-1，23例女性为(108.8±10.3)mg.L-1。性别间差异无显著性(P>0.05)。
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2.4 肝硬化患者血浆HRG含量 24例肝硬化患者血浆HRG为(79.5±12.6)mg.L-1，明显低于健康成人(P<0.01)。
3 讨 论
目前，国外常用火箭免疫电泳和多抗ELISA检测血浆HRG，我国尚未见有关报道。作者利用抗HRG单克隆抗体建立起夹心ELISA检测法，成功地测定了血浆HRG。此法特异性强，未观察到在抗原HRG纯化过程中性质相似而难以分离的抗凝血酶Ⅲ以及血浆中含量较多的白蛋白的免疫交叉反应。该法具有简单、快速、特异性高和敏感度好的特点，适用于临床检测。本文用此法检测了40例健康成人血浆HRG的结果为(110.3±9.7)mg.L-1，男女性别间差异无显著性。此结果与国外报道[2，3]基本一致。
体外研究表明，HRG可与纤溶酶(原)、纤维蛋白(原)、肝素、T淋巴细胞、补体等结合，具有调节凝血和纤溶的作用，并有调节免疫系统的作用。其生理功能至今尚不明了[1]，一般认为HRG的临床研究有助于阐明其生理功能。国外对HRG检测的临床意义进行了广泛的研究，国内则未见报道。本室对血浆HRG浓度变化与肝硬化的关系进行了初步探讨，所测24例肝硬化病人的血浆HRG浓度明显低于健康人。此结果与Saito[7]和Frank[8]等人的报道近似。肝硬化患者有出血倾向，其机制尚不完全清楚。HRG具有纤溶酶原结合的能力，从而减少了HRG促纤溶的可能性，起着纤溶抑制剂的作用。肝硬化时，HRG浓度下降，使纤溶酶原被激活的可能性增加。据此推测HRG的下降可能是导致肝硬化出血的原因之一，其机制尚待证实。
, 百拇医药
①国家自然科学基金资助课题(编号39270648)
作者：徐克前 男 34岁 讲师
参考文献
1 Zehnder JL, Leung LK. Histidine-rich glycoprotein: Is there a role in hemostasis or immune function? Lab Clin Med, 1995,125:682～683
2 Chang NS, Lew RW, Rummage JA, et al. Regulation of complement functional efficiency by histidine-rich glycoprotein. Blood, 1992,79:2978～2980
3 Hennis BC, Boheemen PA, Wakabayashi S, et al. Identification and genetic analysis of a common molecular variant of histidine-rich glycoprotein with a difference of 2kD in apparent molecular weight. Throm Haemost, 1995,74:1491～1496
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4 李志坚，徐克前，陈正炎，等.纯化小鼠腹水中抗富组氨酸糖蛋白单克隆抗体方法的比较.湖南医科大学学报，1996，21：509～512
5 王连春，贺石林，陈正炎.富组氨酸糖蛋白的纯化及促凝活性的初步研究.湖南医科大学学报，1995，20：315～318
6 Koide T, Odani S, Ono T, et al. Human histidine-rich glycoprotein: Simultaneous purification with antithrombin Ⅲ and characterization of its gross structure. J Biochem, 1985,98:1191～1200
7 Saito H, Goodnough LT, Boyle JM, et al. Reduced histidine-rich glycoprotein levels in plasma of patients with advanced liver cirrhosis. Am J Med, 1982,78:179～182
8 Frand WGL, Cornelis K, Eduard ARK, et al. Histidine-rich glycoprotein is elevated in mild liver cirrhosis and decreased in moderate and severe liver cirrhosis. J Lab Clin Med, 1989,118:497～498
(本文编辑 傅希文/薛绍莲)
1998-06-24 收稿, 百拇医药
单位：临床生化教研室 长沙 410013
关键词：富组氨酸糖蛋白*；酶联免疫吸附测定；抗体类；单克隆；血浆；方法学
湖南医科大学学报990305 提要 建立用单克隆抗体(McAb)酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定血浆富组氨酸糖蛋白(HRG)的方法。结果显示：McAb 3C6F3包被浓度为10μg.ml-1，单抗酶标结合物(McAb9E7C9-HRP)作1∶200稀释时标准曲线最理想；最低检出限为1ng.ml-1，批内CV 8.2%，批间CV 11.5%，回收率为89.1%，测定范围为2.5～80ng.ml-1；用该法测定40例正常人血浆HRG为(110.3±9.7)mg.L-1，24例肝硬化患者血浆HRG为(79.5±12.6)mg.L-1。该法的特异性强，且方便而准确。
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中国图书分类号 R446.112
Establishment of sandwich ELISA with McAbs to meausre
histidine-rich glycoprotein in plasma
Xu Keqian Chen Zhengyan
(Department of Clinical Biochemistry, Hunan Medical University, Changsha 410013)
The objective of this paper is to establish a method using sandwich ELISA with McAbs to measure plasma histidine-rich glycoprotein(HRG). The results showed that this method, with a working range from 2.5ng.ml-1 to 80ng.ml-1, provided the lower limit of detection of 1ng.ml-1, the average intra-assay CV, the inter-assay CV and the recovery rate of HRG were 8.2%, 11.5% and 89.1%, respectively. Interference by antithrombin Ⅲ and human albumin was not significant. With this method, the concentration of plasma HRG from healthy donors was (110.3±9.7)mg.L-1, and the value of plasma HRG in liver cirrhosis was (79.5±12.6)mg.L-1. These results suggest that sandwich ELISA with McAbs is high sensitive, precise and specific.
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Key words histidine-rich glycoprotein*; antibodies,monoclonal; enzyme-linked immunosorbent assay; plasma; methodology
富组氨酸糖蛋白(histidine-rich glycoprotein, HRG)在体内分布广泛，血浆、血小板、骨髓巨核细胞和乳汁中均存在。血浆中HRG浓度约为100～150mg.L-1，由肝实质细胞产生。血浆HRG浓度检测具有重要的临床意义[1，2]，先兆子痫等异常妊娠、肝损伤性疾病及急性心肌梗塞患者，HRG浓度下降。血浆HRG水平与血栓形成密切相关，其下降还可作为器官移植排斥反应的监测指标。目前，国外检测血浆HRG的方法是火箭免疫电泳[2]和多抗酶联免疫吸附测定(ELISA)[3]。为了提高血浆HRG检测的特异性，作者在制备抗HRG单克隆抗体(单抗)的基础上建立了单抗夹心ELISA方法，并将其初步应用于临床。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 ①抗HRG单抗9E7C9和3C6F3系本室采用淋巴细胞杂交瘤技术制备及纯化[4]，经Western-blotting等方法鉴定为抗HRG的单抗。用小鼠Ig亚类测定试剂盒作琼脂糖免疫双扩散试验，显示9E7C9和3C6F3均为IgG1亚类。②抗原标准品系本室制备，经SDS-PAGE和免疫双扩试验证明为电泳纯和免疫纯[5]。③固相载体为聚苯乙烯微量反应板。④包被缓冲液为0.05mol.L-1，pH 9.6碳酸盐缓冲液；洗涤液(PBS-Tween液，pH 7.4)为2.5mmol.L-1 NaH2PO4，7.5mmol.L-1 Na2HPO4，145mmol.L-1 NaCl, 1mmol.L-1 Na2 EDTA及0.1% Tween 20的混合液；封闭液用PBS-Tween液配成1%牛血清白蛋白溶液；稀释液为3% PEG6000的PBS-Tween液；底物溶液为邻苯二胺4mg加入0.1mol.L-1 pH 5.0磷酸-柠檬酸盐缓冲液10ml，临用前加入30% H2O2 10μl。⑤空白对照系用稀释液代替抗原标本；阴性对照用去HRG血浆经稀释后代替抗原标本。⑥抗凝血酶Ⅲ为上海生物制品研究所产品；人血清白蛋白、辣根过氧化物酶为SERVA产品。
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1.1.2 血浆标本 来源于健康成人40例，经临床诊断为肝硬化病人24例。清晨空腹采血，ACD抗凝，4℃离心分离血浆，置-40℃冰箱保存待测，测定时用稀释液作1∶100连续二次稀释。
1.2 方法
1.2.1 辣根过氧化物酶标记McAb9E7C9 采用改良过碘酸钠法，HRP与McAb的摩尔比值和McAb-HRP结合物中HRP的活性综合评价酶标单抗的质量。
1.2.2 去HRG血浆的制备 按Koide T方法[6]制备去HRG血浆。用ELISA法检测时，与空白对照A450差值应小于0.1。
1.2.3 ELISA方法的建立 ⑴包被：用包被液将3C6F3稀释成10μg.ml-1，200μl/孔，4℃过夜，洗板3次，每次3min。⑵封闭：加封闭液200μl/孔，37℃放置1h，洗板3次，每次3min。⑶加样：加稀释样本血浆或HRG标准液200μl/孔，37℃ 2h，洗板3次，每次3min。⑷加酶标抗体：将HRP-McAb 9E7C9稀释成1∶200，200μl/孔，37℃ 2h，洗板3次，每次3min。⑸显色：立即于孔中加入底物溶液200μl/孔，37℃避光15min，加入2mol.L-1 H2SO4 50μl/孔终止反应。⑹检测：用酶标仪于450nm处测定吸光度。
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1.2.4 统计学处理 结果以
±s表示；数据用INSTAT统计学软件；两样本间比较用t检验。2 结 果
2.1 实验条件 用棋盘滴定法确定包被聚苯乙烯微孔板的McAb3C6F3浓度及HRP-McAb9E7C9的稀释度。当McAb3C6F3包被浓度为10μg.ml-1时，HRP-McAb 9E7C9的稀释度为1∶200时，所得标准曲线最理想。
2.2 方法评价
2.2.1 精密度 取低、中、高3份血浆标本，做批内和批间精密度(CV)实验。结果示，批内平均CV为8.2%，批间平均CV为11.5%(表1)。
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表1 血浆HRG测定精密度实验结果(mg.L-1) 样本号
批内(15次)
批间(10次)
±sCV(%)
±sCV(%)
1
85.3±6.7
7.9
82.1±10.3
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12.5
2
128.0±10.6
8.3
107.5±14.1
13.1
3
141.5±11.9
8.4
142.6±12.5
8.8
2.2.2 准确度 在已知HRG浓度的血浆中加入不同浓度的HRG标准液，用已建立的ELISA方法测得的回收率分别为91.6%和86.5%，平均为89.1%(表2)。表2 血浆HRG测定回收试验结果 测得浓度
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(mg.L-1)
加入标准液浓度
(mg.L-1)
回收浓度
(mg.L-1)
回收率
(%)
120.5
-
-
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166.3
50
45.8
91.6
207.0
100
86.5
86.5
2.2.3 检出限的测定 按阴性对照的
±3s计算，检测的下限为1.0ng.ml-1。2.2.4 线性范围 将HRG标准液作系列稀释，按ELISA法测定，用半对数坐标纸作标准曲线，可知HRG浓度在2.5～80ng.ml-1之间线性良好(附图)。
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附图 抗HRG McAb夹心ELISA标准曲线
Fig. Standard curve of sandwich ELISA with anti-HRG McAb
2.2.5 干扰实验 用抗凝血酶Ⅲ和人血清白蛋白代替抗原HRG，按ELISA法操作，其显色程度与空白对照A450差值均小于0.1。说明抗凝血酶Ⅲ和人血清白蛋白对所建立的ELISA方法未观察到干扰反应。
2.3 健康成人血浆HRG含量 40例健康成人的血浆HRG浓度为(110.3±9.7)mg.L-1，其中17例男性为(111.8±9.0)mg.L-1，23例女性为(108.8±10.3)mg.L-1。性别间差异无显著性(P>0.05)。
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2.4 肝硬化患者血浆HRG含量 24例肝硬化患者血浆HRG为(79.5±12.6)mg.L-1，明显低于健康成人(P<0.01)。
3 讨 论
目前，国外常用火箭免疫电泳和多抗ELISA检测血浆HRG，我国尚未见有关报道。作者利用抗HRG单克隆抗体建立起夹心ELISA检测法，成功地测定了血浆HRG。此法特异性强，未观察到在抗原HRG纯化过程中性质相似而难以分离的抗凝血酶Ⅲ以及血浆中含量较多的白蛋白的免疫交叉反应。该法具有简单、快速、特异性高和敏感度好的特点，适用于临床检测。本文用此法检测了40例健康成人血浆HRG的结果为(110.3±9.7)mg.L-1，男女性别间差异无显著性。此结果与国外报道[2，3]基本一致。
体外研究表明，HRG可与纤溶酶(原)、纤维蛋白(原)、肝素、T淋巴细胞、补体等结合，具有调节凝血和纤溶的作用，并有调节免疫系统的作用。其生理功能至今尚不明了[1]，一般认为HRG的临床研究有助于阐明其生理功能。国外对HRG检测的临床意义进行了广泛的研究，国内则未见报道。本室对血浆HRG浓度变化与肝硬化的关系进行了初步探讨，所测24例肝硬化病人的血浆HRG浓度明显低于健康人。此结果与Saito[7]和Frank[8]等人的报道近似。肝硬化患者有出血倾向，其机制尚不完全清楚。HRG具有纤溶酶原结合的能力，从而减少了HRG促纤溶的可能性，起着纤溶抑制剂的作用。肝硬化时，HRG浓度下降，使纤溶酶原被激活的可能性增加。据此推测HRG的下降可能是导致肝硬化出血的原因之一，其机制尚待证实。
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①国家自然科学基金资助课题(编号39270648)
作者：徐克前 男 34岁 讲师
参考文献
1 Zehnder JL, Leung LK. Histidine-rich glycoprotein: Is there a role in hemostasis or immune function? Lab Clin Med, 1995,125:682～683
2 Chang NS, Lew RW, Rummage JA, et al. Regulation of complement functional efficiency by histidine-rich glycoprotein. Blood, 1992,79:2978～2980
3 Hennis BC, Boheemen PA, Wakabayashi S, et al. Identification and genetic analysis of a common molecular variant of histidine-rich glycoprotein with a difference of 2kD in apparent molecular weight. Throm Haemost, 1995,74:1491～1496
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4 李志坚，徐克前，陈正炎，等.纯化小鼠腹水中抗富组氨酸糖蛋白单克隆抗体方法的比较.湖南医科大学学报，1996，21：509～512
5 王连春，贺石林，陈正炎.富组氨酸糖蛋白的纯化及促凝活性的初步研究.湖南医科大学学报，1995，20：315～318
6 Koide T, Odani S, Ono T, et al. Human histidine-rich glycoprotein: Simultaneous purification with antithrombin Ⅲ and characterization of its gross structure. J Biochem, 1985,98:1191～1200
7 Saito H, Goodnough LT, Boyle JM, et al. Reduced histidine-rich glycoprotein levels in plasma of patients with advanced liver cirrhosis. Am J Med, 1982,78:179～182
8 Frand WGL, Cornelis K, Eduard ARK, et al. Histidine-rich glycoprotein is elevated in mild liver cirrhosis and decreased in moderate and severe liver cirrhosis. J Lab Clin Med, 1989,118:497～498
(本文编辑 傅希文/薛绍莲)
1998-06-24 收稿, 百拇医药