WKY大鼠与SHR血管平滑肌神经肽Y受体数量及其亲和力的对照研究
作者：曾春雨 刘光耀 周勇 王宝文 程绍钧 张广运
单位：曾春雨 刘光耀 周勇 王宝文 第三军医大学附属大坪医院心血管内科 重庆，400042；程绍钧 张广运 医学检验系核医学教研室 重庆，400038
关键词：神经肽Y受体；大鼠近交WKY血管平滑肌；大鼠；近交SHR
第三军医大学学报990318
提要 目的：了解Wistar-Kyoto大鼠(Wistar-Kyoto rats，WKY)、自发性高血压大鼠(Spontaneously hypertensive rats，SHR)血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells，VSMC)上神经肽Y(Neuropeptide Y，NPY)受体的表达水平及其差异。方法：应用Iodogen法对NPY受体进行了测定。结果：NPY蛋白质标记率为70%，比活度为3.36 MBq/μg VSMC在(1.0～5.0)×106细胞/ml的范围内，125I-NPY的特异性结合量与VSMC细胞数之间呈线性关系；SHR的NPY受体最大结合量(Bmax)和受体复合物解离常数(Kd)均明显高于WKY，相关分析显示Bmax，Kd与血压增高程度呈正相关。结论：NPY受体数目和亲和力的增加可能在高血压的发病机制中占有重要的地位。
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中图法分类号 R392.11
A contrastive study on changes number and maximal binding capacity of neuropeptide Y receptors on vascular smooth muscle cells between spontaneously hypertensive rats and Wistar-Kyoto rats
Zeng Chunyu, Liu Guangyao, Zhou Yong, Wang Baowen, Cheng Shaojun, Zhang Guangyun
(Department of Cardiology, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400042)
, 百拇医药
Abstract Objective: To investigate the expression of neuropeptide Y (NPY) receptors on vascular smooth muscle cells (VSMCs) in spontaneously hypertensive rats (SHR) and Wistar-Kyoto rats (WKR) and determine the difference between the two kinds of rats. Methods: NPY was radioiodinated with Na125 I by means of Iodogen method and NPY receptors were detected with radioligand binding assay. Results: The labeling rate of NPY was 70% and the specific radioactivity of 125I-NPY was 33.67 MBq/(g. When the density of VSMCs was in the range of 1～5×106 cells/ml, the number of VSMCs was closely related with 125I-NPY binding quantity. The maximal binding capacity (Bmax) and equilibrium dissociation contant (Kd) were significantly higher in SHR than in WYR. These two parameters were positively correlated to the increment of blood pressure. Conclusion: The increase in number and Bmax of NPY receptors might play an important role in pathogenesis of hypertension.
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Key words neuropeptide Y receptor; vascular smooth muscle; rats, inbred WKY; rats, inbred SHR
神经肽Y是一种含有36个氨基酸的多肽，它广泛地分布于中枢神经系统和外周多种组织器官，无论测定高血压病人或是自发性高血压大鼠血中NPY含量均明显升高，提示NPY可能在高血压的发病机制中占有一定的地位[1]，离体动脉血管内灌注NPY可以产生强有力的、长时间的收缩血管作用，这种作用不被α、β受体阻滞剂所阻断，提示有NPY受体存在于动脉血管中[2]，并且放射自显影技术已证实了VSMC上确有NPY受体存在[3]。但对于VSMC上的定量情况目前尚缺乏研究，本实验利用Iodogen法对NPY进行
125I标记，以125I-NPY作为放射性配基，测定NPY受体在SHR、WKY的VSMC上的分布情况，并进行对比研究，探讨NPY受体在高血压发病中的作用。
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1 材料与方法
1.1 材料
Na-125I为中国原子能科学研究所产品；NPY购自Sigma公司；RPMI-1640培养基为GIBCO-BRL公司产品；Actin单克隆抗体购自宝灵曼公司；SHR、WKY由中国医学科学院阜外医院动物所提供(动物编号9308R021)，雌雄各半，每组10只，两组动物体重差异不显著(P>0.05)，SHR的血压明显高于WKY(P<0.01)。
1.2 NPY的125Ⅰ标记
按照我科实验室建立的NPY125I标记法进行[4]。Iodogen 1 mg溶于2 ml氨仿中，取该溶液0.1 ml加入水平底试管中，旋转试管使溶液包被试管内壁，然后用N2吹干。向试管中加入NPY标准品10 nmol、5 mCi Na125I、PBS液40 ml(pH7.4、0.1 mol/L)，混匀，24℃下反应5 min，不断搅拌，150 μl PBS液终止反应。反应完毕后反应液加入已有5%BSA 200 μl的试管中，混匀，上Sep-Pak C18柱，用0.027 mol/L甲酸(内含0.2%BSA、0.02%叠氮钠)洗脱，定量分管收集洗脱液，测定洗脱液放射性，绘制洗脱曲线，计算蛋白标记率和比活度。
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表1 大鼠的一般状况比较(x±s)
Tab 1 Comparison of general characteristics of rats(x±s) Parameter
Weight (g)
Systolic blood pressure(mmHg△)
SHR
257.67±47.23
217±10**△
WKY
243.40±34.21
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141±6△
△:1 mmHg=0.133 kPa；**：P<0.01 vs WKY
1.3 VSMC的消化、分离及培养
常规大鼠麻醉后剖腹取出主动脉，按照我科高血压实验室建立的复合胶原酶消化、分离、收集VSMC[5]，用10%小牛血清培养液调整细胞密度为1×105/ml，将调整后的细胞悬液接种于培养瓶内，置37℃、5%CO2培养箱内培养，培养后的VSMC用免疫组化、透射电镜鉴定。
1.4 VSMC上NPY受体的放射配基结合法测定
收集培养的VSMC，4℃1000 r/min离心30 min，用RMPI 1640培养液调整细胞数为1.5×106/ml，取1 ml此悬液分别与(0.1～1.5)×10-9 mol/L的125Ⅰ-NPY混合，非特异管加入1×10-6 mol/L NPY，混合物于37℃下水浴30 min，冰浴停止反应，离心沉淀细胞，用D-Hanks液洗涤3～4次，检测沉淀细胞的放射计数。
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1.5 数据处理
所有数据行非线性最小二次方曲线拟合。
125I-NPY特异性结合是由总结合(TB)减去非特异性结合(NSB)所得。Scatchard作图，求受体的Bmax和Kd。
2 结果
2.1 VSMC的培养
VSMC在相差显微镜、普通显微镜下呈梭形，长条或椭圆形，胞质密度高，不透明，有数个或一个核仁位于中央。用Actin单克隆抗体进行特异的免疫组化染色，在光镜下仍呈梭形或长条形，胞质染色呈棕色，Actin染色阳性是VSMC的特征之一。透射电镜下可以见到一个细胞核，核膜有切迹，胞质中充满肌丝，核的两端无肌丝，胞膜下有密斑，胞质内有密体。
2.2 VSMC上NPY受体的测定
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SHR的Bmax和Kd均明显高于WKY(Bmax:456172±3607位点/细胞vs 176 059±6 951位点/细胞，t=113.11,P<0.01;Kd:37.22±4.22 vs 19.91±2.54,t=11.11,P<0.01)。相关分析显示Bmax、Kd与血压增高程度正相关(r=0.747，P<0.01;r=0.580，P<0.05)。
3 讨论
125I标记NPY有Iodogen法和氧胺T法等，Iodogen为固相氧化剂，使水溶性的I-蛋白质快速碘化，具有标记率高、反应体积小以及生物活性损失小等优点，越来越被人们所接受。我们的实验结果显示，Iodogen法标记的125I-NPY经分离后具有较好的生物活性、稳定性和放化纯度，可作为放射配基用于受体结合分析。
对测定方法的检测：①测定结果的准确性。将同一份样品的VSMC悬液分成四份，同时测定其与125I-NPY的结合，10次实验结果的CV为4.33%±1.54%，表明该方法重复性好、准确度高。②将VSMC悬液浓度调成不同浓度[(0.5～5.0)×106细胞/ml]，加入等量的125I-NPY，测定其特异结合量与细胞数间呈线性关系(r=0.853,P<0.01，n=6)，换算成每个细胞的结合位点，其数量基本相同，提示测定结果不受吸附于容器上的放射性影响。
, 百拇医药
原发性高血压的发病机制目前尚不甚明了。已发现NPY可能通过收缩血管、增强缩血管物质的作用、减轻舒血管物质的作用、促进VSMC增殖等几种途径而参与原发性高血压的发病机制[6]，NPY在原发性高血压病中的作用已逐渐得到承认，但关于原发性高血压时NPY相应受体的情况则缺乏研究，本实验利用放射配基结合分析法测定了VSMC上NPY受体的分布情况，发现SHR VSMC上NPY受体无论最大结合容量和亲和力均高于WKY，相关分析显示Bmax、Kd与血压增高程度呈正相关，此结果难以用血中NPY变化同种调节NPY受体解释，说明可能是因为SHR NPY受体相应基因异常使NPY受体蛋白翻译水平提高所致，也进一步说明了NPY受体Bmax、Kd的增加可能在高血压的发病中占有一定地位。
作者简介：曾春雨，男，29岁，主治医师，硕士
参考文献
1 Howe P R, Rogers P F, Morris M J， et al. Plasma catecholamine and neuropeptide Y as indices of sympathetic nerve activity in normotensive and stroke spontaneously hypertensive rats. J Cardiovasc Pharmacol,1986，8(6):113
, http://www.100md.com
2 Maclean M R，Hiley C R. Effect of neuropeptide Y on cardiac output, its distribution,regional blood flow and organ vascular resistance in the pithed rat. Brit J Pharmacol,1990，99(2):340
3 Sheikh S P, Roach E, Fuhendorff J, et al. Localizaton of Y1 receptors for NPY and PYY on vascular smooth muscle cells in rat pancreas. Am J Physiol,1991，260(23):G250
4 曾春雨，刘光耀，王旭开，等.神经肽Y放免方法的建立.第三军医大学学报，1997，19(5)：478
5 王旭开，刘光耀，杨成明，等.复合胶原酶法分离人血管平滑肌细胞的新方法.第三军医大学学报，1993，15(4)：357
6 McDermott B J, Millar B C， Piper H M. Cardiovascular effects of neuropeptide Y:receptor interaction and cellular mechanism. Cardiovasc Res,1993，27(6):893
(收稿：1997-12-22；修回：1998-09-17), 百拇医药
单位：曾春雨 刘光耀 周勇 王宝文 第三军医大学附属大坪医院心血管内科 重庆，400042；程绍钧 张广运 医学检验系核医学教研室 重庆，400038
关键词：神经肽Y受体；大鼠近交WKY血管平滑肌；大鼠；近交SHR
第三军医大学学报990318
提要 目的：了解Wistar-Kyoto大鼠(Wistar-Kyoto rats，WKY)、自发性高血压大鼠(Spontaneously hypertensive rats，SHR)血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells，VSMC)上神经肽Y(Neuropeptide Y，NPY)受体的表达水平及其差异。方法：应用Iodogen法对NPY受体进行了测定。结果：NPY蛋白质标记率为70%，比活度为3.36 MBq/μg VSMC在(1.0～5.0)×106细胞/ml的范围内，125I-NPY的特异性结合量与VSMC细胞数之间呈线性关系；SHR的NPY受体最大结合量(Bmax)和受体复合物解离常数(Kd)均明显高于WKY，相关分析显示Bmax，Kd与血压增高程度呈正相关。结论：NPY受体数目和亲和力的增加可能在高血压的发病机制中占有重要的地位。
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中图法分类号 R392.11
A contrastive study on changes number and maximal binding capacity of neuropeptide Y receptors on vascular smooth muscle cells between spontaneously hypertensive rats and Wistar-Kyoto rats
Zeng Chunyu, Liu Guangyao, Zhou Yong, Wang Baowen, Cheng Shaojun, Zhang Guangyun
(Department of Cardiology, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400042)
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Abstract Objective: To investigate the expression of neuropeptide Y (NPY) receptors on vascular smooth muscle cells (VSMCs) in spontaneously hypertensive rats (SHR) and Wistar-Kyoto rats (WKR) and determine the difference between the two kinds of rats. Methods: NPY was radioiodinated with Na125 I by means of Iodogen method and NPY receptors were detected with radioligand binding assay. Results: The labeling rate of NPY was 70% and the specific radioactivity of 125I-NPY was 33.67 MBq/(g. When the density of VSMCs was in the range of 1～5×106 cells/ml, the number of VSMCs was closely related with 125I-NPY binding quantity. The maximal binding capacity (Bmax) and equilibrium dissociation contant (Kd) were significantly higher in SHR than in WYR. These two parameters were positively correlated to the increment of blood pressure. Conclusion: The increase in number and Bmax of NPY receptors might play an important role in pathogenesis of hypertension.
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Key words neuropeptide Y receptor; vascular smooth muscle; rats, inbred WKY; rats, inbred SHR
神经肽Y是一种含有36个氨基酸的多肽，它广泛地分布于中枢神经系统和外周多种组织器官，无论测定高血压病人或是自发性高血压大鼠血中NPY含量均明显升高，提示NPY可能在高血压的发病机制中占有一定的地位[1]，离体动脉血管内灌注NPY可以产生强有力的、长时间的收缩血管作用，这种作用不被α、β受体阻滞剂所阻断，提示有NPY受体存在于动脉血管中[2]，并且放射自显影技术已证实了VSMC上确有NPY受体存在[3]。但对于VSMC上的定量情况目前尚缺乏研究，本实验利用Iodogen法对NPY进行
125I标记，以125I-NPY作为放射性配基，测定NPY受体在SHR、WKY的VSMC上的分布情况，并进行对比研究，探讨NPY受体在高血压发病中的作用。
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1 材料与方法
1.1 材料
Na-125I为中国原子能科学研究所产品；NPY购自Sigma公司；RPMI-1640培养基为GIBCO-BRL公司产品；Actin单克隆抗体购自宝灵曼公司；SHR、WKY由中国医学科学院阜外医院动物所提供(动物编号9308R021)，雌雄各半，每组10只，两组动物体重差异不显著(P>0.05)，SHR的血压明显高于WKY(P<0.01)。
1.2 NPY的125Ⅰ标记
按照我科实验室建立的NPY125I标记法进行[4]。Iodogen 1 mg溶于2 ml氨仿中，取该溶液0.1 ml加入水平底试管中，旋转试管使溶液包被试管内壁，然后用N2吹干。向试管中加入NPY标准品10 nmol、5 mCi Na125I、PBS液40 ml(pH7.4、0.1 mol/L)，混匀，24℃下反应5 min，不断搅拌，150 μl PBS液终止反应。反应完毕后反应液加入已有5%BSA 200 μl的试管中，混匀，上Sep-Pak C18柱，用0.027 mol/L甲酸(内含0.2%BSA、0.02%叠氮钠)洗脱，定量分管收集洗脱液，测定洗脱液放射性，绘制洗脱曲线，计算蛋白标记率和比活度。
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表1 大鼠的一般状况比较(x±s)
Tab 1 Comparison of general characteristics of rats(x±s) Parameter
Weight (g)
Systolic blood pressure(mmHg△)
SHR
257.67±47.23
217±10**△
WKY
243.40±34.21
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141±6△
△:1 mmHg=0.133 kPa；**：P<0.01 vs WKY
1.3 VSMC的消化、分离及培养
常规大鼠麻醉后剖腹取出主动脉，按照我科高血压实验室建立的复合胶原酶消化、分离、收集VSMC[5]，用10%小牛血清培养液调整细胞密度为1×105/ml，将调整后的细胞悬液接种于培养瓶内，置37℃、5%CO2培养箱内培养，培养后的VSMC用免疫组化、透射电镜鉴定。
1.4 VSMC上NPY受体的放射配基结合法测定
收集培养的VSMC，4℃1000 r/min离心30 min，用RMPI 1640培养液调整细胞数为1.5×106/ml，取1 ml此悬液分别与(0.1～1.5)×10-9 mol/L的125Ⅰ-NPY混合，非特异管加入1×10-6 mol/L NPY，混合物于37℃下水浴30 min，冰浴停止反应，离心沉淀细胞，用D-Hanks液洗涤3～4次，检测沉淀细胞的放射计数。
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1.5 数据处理
所有数据行非线性最小二次方曲线拟合。
125I-NPY特异性结合是由总结合(TB)减去非特异性结合(NSB)所得。Scatchard作图，求受体的Bmax和Kd。
2 结果
2.1 VSMC的培养
VSMC在相差显微镜、普通显微镜下呈梭形，长条或椭圆形，胞质密度高，不透明，有数个或一个核仁位于中央。用Actin单克隆抗体进行特异的免疫组化染色，在光镜下仍呈梭形或长条形，胞质染色呈棕色，Actin染色阳性是VSMC的特征之一。透射电镜下可以见到一个细胞核，核膜有切迹，胞质中充满肌丝，核的两端无肌丝，胞膜下有密斑，胞质内有密体。
2.2 VSMC上NPY受体的测定
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SHR的Bmax和Kd均明显高于WKY(Bmax:456172±3607位点/细胞vs 176 059±6 951位点/细胞，t=113.11,P<0.01;Kd:37.22±4.22 vs 19.91±2.54,t=11.11,P<0.01)。相关分析显示Bmax、Kd与血压增高程度正相关(r=0.747，P<0.01;r=0.580，P<0.05)。
3 讨论
125I标记NPY有Iodogen法和氧胺T法等，Iodogen为固相氧化剂，使水溶性的I-蛋白质快速碘化，具有标记率高、反应体积小以及生物活性损失小等优点，越来越被人们所接受。我们的实验结果显示，Iodogen法标记的125I-NPY经分离后具有较好的生物活性、稳定性和放化纯度，可作为放射配基用于受体结合分析。
对测定方法的检测：①测定结果的准确性。将同一份样品的VSMC悬液分成四份，同时测定其与125I-NPY的结合，10次实验结果的CV为4.33%±1.54%，表明该方法重复性好、准确度高。②将VSMC悬液浓度调成不同浓度[(0.5～5.0)×106细胞/ml]，加入等量的125I-NPY，测定其特异结合量与细胞数间呈线性关系(r=0.853,P<0.01，n=6)，换算成每个细胞的结合位点，其数量基本相同，提示测定结果不受吸附于容器上的放射性影响。
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原发性高血压的发病机制目前尚不甚明了。已发现NPY可能通过收缩血管、增强缩血管物质的作用、减轻舒血管物质的作用、促进VSMC增殖等几种途径而参与原发性高血压的发病机制[6]，NPY在原发性高血压病中的作用已逐渐得到承认，但关于原发性高血压时NPY相应受体的情况则缺乏研究，本实验利用放射配基结合分析法测定了VSMC上NPY受体的分布情况，发现SHR VSMC上NPY受体无论最大结合容量和亲和力均高于WKY，相关分析显示Bmax、Kd与血压增高程度呈正相关，此结果难以用血中NPY变化同种调节NPY受体解释，说明可能是因为SHR NPY受体相应基因异常使NPY受体蛋白翻译水平提高所致，也进一步说明了NPY受体Bmax、Kd的增加可能在高血压的发病中占有一定地位。
作者简介：曾春雨，男，29岁，主治医师，硕士
参考文献
1 Howe P R, Rogers P F, Morris M J， et al. Plasma catecholamine and neuropeptide Y as indices of sympathetic nerve activity in normotensive and stroke spontaneously hypertensive rats. J Cardiovasc Pharmacol,1986，8(6):113
, http://www.100md.com
2 Maclean M R，Hiley C R. Effect of neuropeptide Y on cardiac output, its distribution,regional blood flow and organ vascular resistance in the pithed rat. Brit J Pharmacol,1990，99(2):340
3 Sheikh S P, Roach E, Fuhendorff J, et al. Localizaton of Y1 receptors for NPY and PYY on vascular smooth muscle cells in rat pancreas. Am J Physiol,1991，260(23):G250
4 曾春雨，刘光耀，王旭开，等.神经肽Y放免方法的建立.第三军医大学学报，1997，19(5)：478
5 王旭开，刘光耀，杨成明，等.复合胶原酶法分离人血管平滑肌细胞的新方法.第三军医大学学报，1993，15(4)：357
6 McDermott B J, Millar B C， Piper H M. Cardiovascular effects of neuropeptide Y:receptor interaction and cellular mechanism. Cardiovasc Res,1993，27(6):893
(收稿：1997-12-22；修回：1998-09-17), 百拇医药